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分子标记在植物遗传育种中的应用(编辑修改稿)

花匠小妙招
2024-11-20 11:51

分子标记在植物遗传育种中的应用(编辑修改稿)

2024-02-13 20:09 本页面

【文章内容简介】 60。Step6 72℃ 5分钟AFLP的选择性扩增取 4181。l稀释预扩增液，加入 16181。l如下反应液：PstⅠ 引物（ 50ng/181。l） MseⅠ 引物（ 50ng/181。l） 10PCRBuffer Mg2+（ 30mM） dNTP（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。l） ddH2O 混合后按如下 PCR程序扩增：Step1 95℃ 2分钟Step2 95℃ 30秒Step3 65℃ 30秒（ ℃ /cycle）Step4 72℃ 60秒Step5 GOTOStep212循环Step6 95℃ 30秒Step7 56℃ 30秒Step8 72℃ 60秒Step9 GOTOStep630cyclesStep10 72℃ 5分钟AFLP的检测216。银染216。荧光216。同位素检测注意事项：1． AFLP酶切反应对模板 DNA质量要求较高，要求 260/280在，且不能有降解。2． AFLP反应对模板 DNA浓度不是很敏感，在50pg50ng时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性， DNA浓度不能太低。3．酶切连接反应可以分开作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。4． AFLP反应对 PCR要求较高，要首先摸索优化 Mg2+、 dNTP条件，达到最佳扩增。5． EcoRⅠ 受甲基化胞嘧啶的影响较小，而PstⅠ 对富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而 PstⅠ MseⅠ 检测的多为表达区域，而EcoRⅠ MseⅠ 检测位点聚集在甲基化较高的重复序列区域。6．引物中用作选择性核苷酸的Ｇ和Ｃ含量对扩增出的产物数目有影响。一般而言，Ｇ和Ｃ含量越高，扩增出的产物数目越少。7．同位素、荧光标记分辨率较高，但价格昂贵，操作不方便；银染方法方便快捷，掌握好各个环节，同样可以达到很好的效果。为什么用双酶解 ?适合 PCR扩增效率与变性胶的分辨率减少 PCR扩增的片段 ,从而减少使用选择性碱基的数目使标记单链成为可能增加 PCR扩增的灵活性增加使用引物的灵活性为什么要预扩增 ?减少选择性碱基的错配减轻背景提供足量模板 DNA降低模板浓度的影响目的：分子标记辅助选择 (MAS)筛选 BAC文库，进行图位克隆（ mapbased gene cloning）AFLP SCARPIC/Simpson遗传多样性系数 = 1  Pi 2等位基因数目 A A = 4PIC = 1 – SUM ()2 + ()2 + ()2 + ()2 = SSR资料：遗传相似系数 Gower (1985): a + da + b + c + d简单匹配系数（ SM）(Simplematchingcoefficient) a a + b + cJaccard相似系数(Jaccard1908). 2a2a + b + cDice(1945)相似系数，即 NeiLi(1979)相似系数 .其中 :a bc d++kj遗传距离的计算：Rogers（ 1972）RogersW （ Rogers distance as modified by Wright （ 1978）两个随机群体 j 、 k间的遗传距离（ Nei 1972）: Xij 为 X群体第 i个位点第 j个等位基因频率 Yij为 Y群体第 i个位点第 j个位点基因频率 n 在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距离（ RD）和改良的罗杰斯距离（ MRD）（Rogers， 1972； Goodman Stuber， 1983）。n 根据遗传特性确定的罗杰斯距离在相关种质的亲缘关系分析中非常有用；而改良的罗杰斯距离还适用于杂种优势研究。聚类分析n 聚类指标：遗传相似系数遗传距离n 聚类方法： SAHN（ Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested） clustering常用 UPGMAn 分析软件：（ Rholf， 1998）QTL分析l ‘A’ Homozygote for the allele from A parentl ‘B’ Homozygote for the allele from B parentl ‘H’ Heterozygote carrying both alelles A and Bl ‘C’ Either BB or AB genotypel ‘D’ Either AA or AB genotypel ‘’ Missing data for the individual at this locusdata type F2 intercross20 5 1*locus1 BBBHHAAABBBHHHAABA*locus2 ABABHABHABABABHAH*locus3 ABBAHHHBHABHABHBBHHLocus3 may be misscored in individual 12!*locus4 ABHHABAAAHABABHABHH*locus5 ABHABHAAABHABHAHHHB*trait1 EST (Expressed Sequence Tags)SNP（ single nucleotide polymophism）cSSR、 cSNPDNA微阵列（ Microarray）蛋白质组学n ．．．　．．．新型分子标记n EST是长约 150400bp的基因表达序列片段，携带着完整基因的某些片段。 n mRNA反转录成 cDNA，克隆到质粒或噬菌体载体，构建 cDNA文库，而后大规模随机挑选克隆，对 5’或 3’端进行一步法测序，获得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程认识的技术。EST(Expressed Sequence Tags)DNA Databanksn cDNA resourcesn Genbank (NCBI), Nucleotide Sequence Database (EMBL), DDBJ , MGC,…n Genomic DNA resourcesn HTG, dbGSS, GOLD, ERGO,…n EST resourcesn dbEST, UniGene, GIs, STACKS, DOTS,…n Othersn dbSTS, UniSTS, dbSNP, TransFac, ISIS, Repbase, ... ...常用基因组网址：单核苷酸多态（ SNP single nucleotide polymophism）n SNP是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，即基因中的点突变。特点：n 双等位基因n 在基因组中的发生频率比较高n 有些 SNP位点还影响基因的功能 n SNPs可大大丰富既有的连锁图n 成熟自动化技术，有望分析成千上万的 SNPscSSR、 cSNP——— 从 EST中开发 SSR、 SNPn 目前某些植物全序列的测定及 EST数据库的开发，为 SSR、 SNP的开发开辟了新的途径。n 优点：n 表达序列，与特定功能有联系n 多态性丰富，可大大丰富标记数目n 开发简单、经济利用 DNA芯片技术，将大量探针固定于玻 /硅片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，以