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猕猴桃溃疡病相细菌的鉴定及致病性研究
DissertationforMaster’sDegree Identificationandpathogenicityof bacteriaassociatedwithkiwifruitcanker Supervisor:Prof.GenjiaTan AssociateProf.LixinZhang MasterCandidate:ShashaLi Major:PlantPathology AnhuiAgriculturalUniversity Hefei,Anhui,China June2013 摘 要 猕猴桃溃疡病是一种世界性的侵染猕猴桃的细菌性病害，该病害危害极大，严 重时可致使全园毁灭，造成严重的经济损失。该病害在中国、日本、韩国、意大利、 新西兰等主要猕猴桃种植国家均有发生。目前猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃产区的发 生呈上升趋势，个别年份甚至大流行。由于我国对猕猴桃溃疡病的病原缺乏系统的 研究，因此，本研究分别在安徽、陕西、重庆等地猕猴桃果园重病区采集病样，对 该病害的相关细菌进行了分离，并对其做了表型鉴定、分子特征分析以及致病性测 定等研究。主要研究结果如下： 1．猕猴桃溃疡病相关细菌的分离及表型鉴定 本研究采用研磨稀释分离法分 别用三种培养基对采集的病样进行分离，共得到328株出现频率高并具有代表性的 菌株，这些菌落在BPA培养基上培养的形态有三类：一类是菌落呈白色，圆形隆起， 边缘呈光滑的波浪状，共311株。其中有28 株革兰氏染色为阴性，能动，好氧， LOPAT试验为（++–++），七叶苷水解和明胶液化试验为阳性，能利用葡萄糖产 KB 酸，能利用葡萄糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，乳糖，麦芽糖，并且能在 培养 基上产荧光色素，初步鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。另29株革兰 氏染色为阴性，兼性厌氧，能动，LOPAT试验为（+–––+），产荧光色素试验、明 胶液化试验均为阴性，过氧化氢酶反应和七叶苷水解试验为阳性。第二类是菌落黄 色，圆形光滑，全缘。第三类是菌落初呈乳白色，后产生黄色素，菌落生长快。 2．猕猴桃溃疡病相关细菌的分子特征分析 PsaF1/R PsaF3/R4 125 利用丁香假单胞猕猴桃致病变种的特异性引物 、 ，对 株 细菌的全基因组DNAITS 区域进行双重PCR扩增，凝胶电泳检测结果表明仅意大 利提供的P.syringaepv.actinidiae菌株F285、Fc84、F28c在 175bp和280bp左右 的位置检测到两条扩增片段，分离所得细菌均未检测到目的片段。 利用细菌16SrRNA片段通用引物P1F/P R，对125株细菌全基因组DNA做 PCR扩增，均得到一条大小约为1500bp 目的片段，分别用限制性内切酶HaeIII和 MSPI 16SrRNA-PCR HaeIII 对 扩增片段酶切，酶切图谱显示，内切酶 将菌株分为 四类，MSPI将菌株分为五类，酶切结果与菌株的表型鉴定结果大体一致。选取14 株代表性细菌，将其 16SrRNA-PCR扩增片段进行T/A克隆、序列测定，对获得序 列在NCBI数据库中进行Blast搜索，结果显示意大利提供的P.syringaepv.actinidiae 菌株F285、Fc84、F28c 的16SrRNA 片段与P.s.pv.actinidiae 同源性达99%，菌 株AHK-1、AHK- 、A1-3、A2-1、A2- 与P.fluorescens 同源性达99%，菌株A17、 F-7 Rahnellaspp. 99% C101 AL-3
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