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吉林省农业科学院玉米研究所

花匠小妙招
2024-11-20 14:14

植物转基因操作方法概述

吉林省农业科学院玉米研究所刘俊

植物转基因技术( Transgentic Technology) 是指从植物中分离得到或经过修饰的目的基因导入到植物体内，使其在植物体内稳定表达和遗传。
1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。
一、传统转基因操作方法
根据转基因植物的受体类型，传统的植物转基因方法可以分为3大类：①以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、病毒介导法、基因枪法和超声波介导法；②以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇（PEG）法、电击法、脂质体法；③以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。
其中以原生质体为受体的基因转化方法，由于存在原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法转化率低、效果不理想等缺点，该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。
1.1 农杆菌介导法
农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导的主要是利用根癌农杆菌（Agrobacterium　tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）分别含有大小为200～800 bp的结构和功能相似Ti（Tumer induce）质粒和Ri（Root induce）质粒，其上有一段参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组的T-DNA区，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA 插入到植物基因组中。因此，该方法具体操作主要是将外源基因插入到农杆菌的T-DNA区，通过对受体植物的侵染实现外源基因向植物细胞的转移与整合。
农杆菌介导法的基本步骤是：（1）诱导生成目标植物外植体；（2）构建含有目的基因的质粒；（3）质粒导入合适的农杆菌菌株中，并完成该菌株的活化；（4）目标植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染转化；（5）共培养及脱菌处理；（6）愈伤组织筛选、分化与植株再生；（7）再生转化植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；（8）转基因植株T1代的目标性状鉴定。
农杆菌介导转化法目前已经成功应用在烟草、番茄、大豆等多种双子叶植物以及水稻、玉米、大麦等单子叶植物上。据统计，目前的转基因植物中有80%是由农杆菌介导法转化而来，但大部分都是由根癌农杆菌介导获得。
农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段明显及实验费用低等优点，因此，农杆菌介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法。
该方法也存在一定的局限：如在自然条件下，农杆菌只侵染双子叶植物，而对于单子叶植物，人工干扰诱导农杆菌完成侵染过程以及单子叶植物的组织培养都有一定的难度。目前，只发现20多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次，植物细胞壁对农杆菌介导转化效果有一定影响。再次，影响农杆菌转化效率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时，研究者要考虑农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况；外植体的基因型、来源和发育状态；培养基成分及某些诱导条件如是否加入酚类物质等。此外，植物愈伤组织的诱导过程有时会存在困难。
1.2 病毒介导法
病毒介导转化法利用病毒核酸能在寄主细胞中进行复制和表达，进而将外源基因导入植物细胞，因此可以作为植物转基因操作的基因载体而发展起来的。目前研究较多的植物病毒载体系统有单链RNA植物病毒载体系统（烟草花叶病毒Tobacco Mosaic Virus，TMV)、单链DNA植物病毒载体系统（番茄金花叶病毒 Tomato Golden Mosaic Virus，TGMV）和双链DNA植物病毒载体系统（花椰菜花叶病毒Cauliflower Mosaic Virus，CaMV）。
病毒介导法的一般步骤是: （1）构建病毒载体，将外源DNA插入到病毒基因组；（2）将重组分子克隆在含有T－DNA 的农杆菌质粒载体上，并转化携带辅助质粒的农杆菌; 将农杆菌注射到染色体上已经整合了病毒B 链基因植物的组织中，此时重组DNA 分子在植物体内被包装成具有活力的病毒颗粒，后者分泌后再感染其他细胞和组织，并表达目的基因。
病毒介导转化法的优点有病毒载体不受寄主是单子叶或是双子叶植物的限制，更易在实验室进行操作。缺点在于：可插入的外源DNA片段小，且受病毒寄主范围的限制；病毒感染后，寄主植物易患病进而导致产量和品质下降；植物细胞只能通过原生质体感染病毒；此外，该方法获得的转化植株，外源基因无法整合到受体植株染色体上导致外源基因无法稳定地遗传给后代。
1.3 基因枪法
基因枪法也被称为微粒轰击法(Micro-Projectile Bombardment)，由美国康奈尔大学的Sanfobrd在1987年提出。该方法被认为是最有前途的植物转基因方法之一。该方法操作原理是利用直径约1～4 μm的钨粉或金粉微粒包裹外源DNA，再通过特制的基因枪装置利用火药爆炸、电弧放电或高压气体作为动力，将微粒加速到300～600 m/s，直接穿过受体植物的细胞壁和细胞膜，将外源DNA送入完整的植物组织和细胞内，整合到植物基因组中并表达。然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。
基因枪法的基本步骤是：（1）诱导目标植物外植体；（2）构建含有目的基因的质粒或制备外源DNA样品；（3）重金属颗粒的外源基因包被过程；（4）植物愈伤组织的前处理；（5）基因枪轰击过程；（6）愈伤组织筛选、分化与植株再生；（7）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
目前，基因枪法已经成功应用在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上，利用该方法转化的水稻、玉米、小麦、大豆、土豆、棉花等农作物均已获得成功。
该方法具有以下优势：操作方法简单，转化时间短，转入的外源基因片段大等，不受受体植物范围的限制，对受体材料无严格要求，还能进行线粒体和叶绿体的基因转化。然而基因枪法也有其局限性：如基因枪设备昂贵、转化效率不高、外源DNA 拷贝数多、嵌合体多等问题；基因的随机整合位点不固定也可能导致转基因后代的突变率提高或转基因的失活、沉默；轰击过程有可能造成外源基因的断裂等。
1.4　超声波介导法
超声波介导法是一种基于物理学原理发展出来的基因转化方法。该方法原理是：利用超声波的空化作用，在细胞膜上产生可恢复的渗透孔通道，从而使外源DNA进入细胞。
超声波介导转化法的基本步骤是：（1）目标植物外植体的制备；（2）目的基因的制备；（3）超声波处理；（4）转化受体愈伤组织的筛选与植株再生；（5）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
在农作物基因转化研究中，该方法已成功地将外源DNA导入烟草和甜菜的原生质体、玉米和小麦的未成熟胚及烟草的叶片中。目前，该方法常与农杆菌介导转化法共用以提高外源DNA的转化效率。
超声波介导转化法的优点有：不受宿主范围的限制，可以将外源基因导入任何基因型的植物细胞内；该方法可以避免对细胞的机械性损伤，有利于原生质体的存活；该方法操作简便、设备便宜等优点。由于超声波介导法也存在外源DNA随机整合及外源DNA拷贝数多等问题。因此，该方法也会导致转基因后代的突变率提高、整合的DNA丢失及基因沉默等现象。
1.5 聚乙二醇( PEG)介导法
PEG介导法是用一种化学诱导剂PEG促进原生质体直接吸收外源质粒DNA，进而实现外源基因整合的一种原生质体转化法。其原理是在高pH 条件下的PEG与原生质体融合，原生质体膜通透性发生改变，增强了原生质对外源DNA的吸收，从而使目的基因整合到原生质体的基因组上并使之发生特异表达。该方法最初是由于农杆菌对单子叶植物侵染的限制而发展出的一种转化方法，已成功将外源基因转入水稻、玉米、小麦等多种禾谷类单子叶植物中。因此，PEG法是禾谷类作物转化中最早应用的方法之一。
此转化方法易于操作，需要的实验设备简单，对细胞伤害小，转化稳定性、重复性好，可一次转化多个原生质体，还能有效避免嵌合转化体的产生；缺点是转化率较低（一般为10-5~10-6），因为PEG 对原生质体有毒害作用，所以该方法不能用于原生质体培养，也不能用于再生困难的植物。因此，PEG法一直未得到广泛应用。
1.6 电激法
电激法（Electroporation）转化是利用植物原生质体能够整合并表达外源DNA，高压脉冲作用在原生质体膜上电激穿孔形成瞬间通道，将外源质粒DNA导入受体细胞中，整合后形成转化细胞。电激法是植物转化的一种有效方法，已在悬浮培养细胞、原生质体、组织、花粉以及植物胚胎等材料上导入外源基因获得瞬间或稳定表达。已成功转化了玉米、水稻、烟草等。
电激法的原理是利用植物原生质体能够整合并表达外源DNA，使细胞膜的透性在电激( 聚乙二醇) 处理后发生改变，出现可逆性孔隙，和原生质体膜直接接触到的DNA 分子便可进入细胞中，细胞内酶可以降解大部分DNA，小部分DNA整合到核基因组并可以稳定地遗传。质膜上出现的可逆孔隙的大小和数量由电场强度、溶液性质、处理时间等决定。优点是可以一次性将许多原生质体转化，但必须具备原生质制备、培养、再生系统。
电激转化法的基本步骤是：（1）目标植物外植体的制备；（2）目的基因的制备；（3）电激处理转化；（4）转化受体愈伤组织的筛选与植株再生；（5）再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
电激法最初应用于动物细胞中，现已被广泛应用于各种单、双子叶植物及真菌转化，除具有PEG法的优点外，还具有操作简便，转化效率高，适于瞬时表达等；目前发展出可直接在带细胞壁的植物组织和细胞上直接打孔实现外源基因的导入，不用面临原生质体再生等问题。
1.7 真空渗透转化法
该方法最先在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中获得成功，是一种简便、快速且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转化方法。常见的有真空渗透花粉粒、幼嫩植株等直接转化法，是植物常规转基因方法中一种有效的转化方式。在真空渗透中，将介导细菌直接接种到植株减数分裂和有丝分裂旺盛的部位（如幼嫩植株、花芽或花粉等）进行真空渗透转化。
真空渗透花粉粒直接转化的步骤有：（1）构建含有目的基因的质粒导入合适的农杆菌菌株中；（2）收集目标植物的新鲜花粉粒；（3）将离心后浓缩的农杆菌重悬于花粉萌发培养液中，加入花粉，浸泡并抽真空处理；（4）将农杆菌侵染过的花粉粒进行授粉操作；（5）对转化种子及其后代的外源基因及其表达产物进行分子检测。
真空渗透法转化法无需经过组织培养即可转化完整植株，从而直接获得转化的种子，易于重复，可靠性高；对于组织培养或原生质体制备困难的作物，也可尝试此方法。该方法目前在水稻、油菜、大豆、棉花等作物上都有成功的案例。
1.8 子房注射转化法
子房注射法是一种育种工作中经常使用的简便易行的植物转基因方法。该方法原理是：使用微注射针或显微注射仪将外源DNA直接注入处于减数分裂期的受体植物的子房中，借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力，外源DNA进入受精的卵细胞中，借助合子胚发育过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象，外源DNA随机整合到受体植株的染色体上。子房注射法已成功应用于玉米、小麦、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种工作中。
子房注射转化法的基本步骤是：（1）目的基因的制备；（2）根据受体植物受精作用后其子房的发育特点，确定最佳转化节点，进行外源DNA注射或将离体的受精子房进行外源DNA注射，再对该离体子房进行培养；（3）对转化种子及其后代的外源基因及其表达产物进行分子检测。
子房注射法的优点：该方法无需组织培养过程，因此实验过程简单，操作便捷；该方法所用的仪器设备简单便宜；外源DNA直接注射进入子房可以提高转化率；该方法可以直接得到转化种子，因此缩短了育种周期。其缺点是：田间转化过程的工作量大；转化过程中，子房受到机械性伤害易导致转化率和结实率低；易产生杂基因污染；该方法只能在授粉期进行；受季节和天气等自然条件影响；由于后代群体规模较大，筛选过程工作量较大。
1.9 花粉管通道法
该方法是20世纪70年代末期在DNA片段杂交假设理论和对植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上发展而来。其原理是在植物授粉后的特定时期内，外源基因可通过柱头内的花粉管珠心通道进入受精胚囊，利用受精卵发育过程中细胞壁和核膜系统尚未发育的阶段，转化尚未形成完整细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，最终实现外源DNA整合到受体植株基因组中。该方法最初是由中国学者周光宇等在20世纪80年代提出并成功利用该技术将外源DNA整合到陆地棉中，培育出抗枯萎病的棉花新品种，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是采用花粉管通道法培育出来的。
花粉管通道法的基本步骤是：（1）目的基因的制备；（2）根据受体植物受精后，花粉管形成的情况和精卵细胞融合的时间，确定最佳时间，进行外源DNA导入；（3）转化种子及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测。
花粉管通道法目前已在成功运用于植物遗传转化及作物育种，如水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、烟草、番茄等均有成功案例。该方法的优点主要有：操作简单，转化速度快，育种周期短；对受体植物种类无要求，有效利用自然生殖过程不需要对其进行后期的组织培养和再生，无需进行组培和再生。但也有其局限性：受环境及受体植物自身花期等条件的限制，需要充分了解受体植物开花受精的时间，因此需要很强的经验性，对某些农作物的操作难度较大；转化率低，结果的可重复性差，转基因植株后代中外源基因的稳定遗传性差。
二、现代转基因操作方法
随着现代分子生物学技术进步，涌现了一批新的转基因操作技术方法，如RNA干扰（RNAi）技术、基因编辑技术等。
2.1 RNA干扰（RNAi）技术
RNAi（RNA interference）即RNA干扰，是指由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导细胞内同源mRNA高效特异性降解，从而使特定基因表达受抑制或使其沉默的现象。RNAi技术具有序列的高度特异性、抑制基因表达的高效性、沉默信号的高稳定性、沉默信号的可遗传性和可传递性的特点。
RNAi 以其序列特异性的优势广泛应用于阻断或抑制基因表达，这也使得它成为转基因植物研发的强大工具。RNAi作为新型转基因技术已经在植物抗病虫害和品质改良等方面得到了广泛应用，一批RNAi 转基因作物如抗虫转基因玉米，抗褐变转基因苹果、马铃薯等已开始商业化应用。此外，利用RNAi 技术降低支链淀粉等物质含量，改良作物品质，已在玉米、水稻、小麦等作物中得到广泛应用，获得了一系列有产业化价值的转基因材料。
RNAi技术具有操作简便，耗时短，在不改变基因组DNA 序列的情况下实现抑制或降低靶基因表达，是一种高效、特异性的基因阻断技术。但由于可能存在的干扰序列特异性、dsRNA的剂量差异以及对非靶标基因的影响，导致RNAi 技术也存在抑制效率不一致等。
2.2 基因编辑技术
基因编辑技术主要是利用位点特异性核酸酶（SSNs，site-specific nucleases）来切割DNA 双链，在基因组的特定位置形成DNA 双链断裂（DSBs，double stranded breaks），诱发细胞产生非同源末端连接（NHEJ，non-homologous end joining）或同源重组（HR，homologous recombination）修复机制对受损DNA 实现修复。目前常见的SSNs 包括锌指核酸酶（ZFNs，zinc finger nucleases）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs，transcription activator-like effector nucleases）以及规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas，Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein）。
2.2.1 锌指核酸酶（ZFNs）技术
锌指核酸酶（ZFNs，zinc-finger nucleases）：由一个DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指核酸酶能识别特异的DNA序列，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后细胞固有的DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复，从而达到DNA靶向修饰的目的。锌指核酸酶技术不仅将基因组靶向修饰的效率提高了3~ 5个数量级，而且具有极高的特异性。锌指核酸酶激活了体内的DNA 损伤修复机制，可以大大提高基因打靶的效率。
2.2.2 CRISPR技术
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），即成簇规律间隔的短回文重复序列。Cas9蛋白是一种能够降解DNA分子的核酸酶（nuclease），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双螺旋中的一条链。CRISPR在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）的基因组中均有存在，它依赖crRNA (CRISPR RNA 能够与tracrRNA配对，形成双链RNA 结构，这种双链RNA 分子能够介导Cas9 核酸内切酶对与双链RNA 分子互补结合的DNA序列进行切割)和tracrRNA (trans-activating chimeric RNA，即反式激活嵌合RNA，一种非编码RNA，能够促进crRNA 的形成，是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子)对外源DNA 进行特异的识别，然后使用Cas9对外源DNA进行序列特异性地切割降解，从在细菌和古细菌细胞发挥了一种获得性免疫的作用。
在植物基因组编辑中，将DNA序列插入到染色体的特定位置上，得到的植株中不存在外源DNA，所以，基因编辑技术相对更容易被接受且更安全。因此，美国农业部将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的蘑菇和玉米列入不属于转基因监管的范围；目前应用较多的是CRISPR/Cas9系统。
与传统转基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术存在许多优点。传统转基因技术中外源目的基因在受体基因组中插入的位置是随机的，而CRISPR/Cas9基因编辑技术没有外源基因的导入，只对内源基因进行修饰，其更加安全、高效，而且精确的目标位点，使基因型与表型联系起来，减少了筛选转基因植株导致的DNA 随机插入的样本数量，从而可以确切的判断基因的功能，降低研发时间和成本；其次，CRISPR/Cas9基因编辑技术可以实现同时对多个位点进行编辑，并能够对突变或插入位点实现精确调控，这是传统转基因技术所无法完成的；另外，传统转基因技术只能在RNA 水平上下调目的基因的表达，并不能完全抑制其转录，且遗传不稳定，而CRISPR/Cas9基因编辑技术能够实现靶基因的突变，从而更加稳定可靠。但基因编辑技术也存在脱靶效应，且对于多倍体植物而言，基因改造的难度较大。
转基因技术是当今生物技术研究的热点,是研究基因功能及作物改良的重要技术。转基因技术不仅在农业领域有着广泛的应用，而且同时在医学、食品、生物及能源等领域的应用也在迅速发展。转基因技术必将为全球正在面临的粮食安全问题做出巨大贡献，并且通过转基因技术的广泛应用带来巨大的经济效益和社会效益。