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葡萄风信子FLS基因克隆及功能分析

花匠小妙招
2024-11-20 17:07

　　葡萄风信子是一种原产欧洲的多年生草本球根花卉,其花色主要以不同程度的蓝色为主要颜色,也有少数品种花色为白色。目前关于葡萄风信子的研究主要集中在葡萄风信子的种球繁殖、遗传转化、解剖结构分析以及它的花期调控方面,对于类黄酮代谢途径的分子基础研究还未见报道。黄酮醇合成途径是类黄酮代谢的一个重要分支,而黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)则是植物黄酮醇合成途径中的一个重要的生物酶。本研究以具有蓝色葡萄风信子亚美尼亚(Muscari botryoides armeniacum)和白花葡萄风信子(Muscari botryoides cv.album)为研究材料,通过转录组测序结果,结合代谢谱综合分析,从中分离并克隆葡萄风信子FLS基因;对FLS基因进行比对,进化分析以及亚细胞定位等基本特征分析;同时利用Real-time PCR分析结构基因在环境胁迫下的表达变化,并对花、根、茎、叶等组织中的黄酮醇含量做了定性定量的分析,主要结果如下:1.分别从葡萄风信子亚美尼亚和白花葡萄风信子花瓣中克隆到了二条具有开放阅读框的FLS基因,分别命名为MaFLS-a、MaFLS-b。序列分析表明分别从蓝白材料中获得FLS基因的cDNA序列的开放阅读框(ORF)全长均为999bp且序列一致,仅在468位(T C)和642(A G)位核苷酸序列不同,但是编码的氨基酸序列一致均为332个氨基酸。2.生物信息学分析表明,FLS蛋白可能为疏水性蛋白,不具跨膜区,无信号肽,属于胞内蛋白。具有6个Ser磷酸化位点,4个Thr磷酸化位点,6个Tyr磷酸化位点;FLS蛋白的主要二级结构元件是α-螺旋、β折叠以及无规则卷曲;具有典型的2-oxoglutarate-and Fe(II)-dependent dioxygenases(2-ODD)双加氧酶超家族保守域、亚铁离子结合基序(the His-XAsp-Xaa-His motif:His204,Asp206,His265)以及二氧戊二酸盐结合位点(the His-X-Ser motif:Arg274,Ser276)和2-ODD超家族保守氨基酸(Gly甘氨酸,His组氨酸,Pro脯氨酸和Gly甘氨酸),属于2-ODD超家族。3.构建了pBI221-MaFLS-GFP亚细胞定位的表达载体,利用基因枪转化法将其转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下进行观察,显示FLS融合蛋白定位于整个细胞中。4.构建了pET-MaFLS进行原核表达的重组载体,通过电击转化制备好的感受态细胞BL21(DE3)中,在试剂IPTG诱导下使蛋白在体外表达,结果显示FLS基因可以再体外进行表达并翻译蛋白。5.研究了在环境胁迫条件下葡萄风信子FLS基因的表达。采用荧光实时定量PCR技术,分析水杨酸、氯化钠对FLS基因在根、茎、叶中的诱导表达情况。结果表明,在高盐和水杨酸处理下,MaFLS-a基因的表达水平有不同程度的变化。水杨酸(SA)处理植株明显提高植株花瓣和茎组织器官中MaFLS-a的表达量,分别是对照组的8.36倍、5.87倍,但是在处理组根和叶片中MaFLS-a的表达量有所降低。氯化钠(NaCl)对亚美尼亚植株进行处理结果发现除了在根组织中MaFLS-a表达量增加外其他组织部位表达量均是小幅度的下调。以上结果说明MaFLS-a基因为诱导型表达基因,并且具有组织表达差异,水杨酸(SA)能够在转录水平激起FLS的相应信号,保护组织免受伤害。6.研究了白色葡萄风信子和蓝色葡萄风信子中FLS基因的表达模式。采用实时定量PCR技术,分析了FLS基因在花瓣发育的5个时期、根、茎和叶中的表达情况。结果表明,MaFLS-a和MaFLS-b在葡萄风信子花组织中表达水平较高,根,茎,叶中微量表达;白花葡萄风信子中FLS的表达量整体上要高于亚美尼亚中FLS的表达量;MaFLS-a与MaFLS-b在白色品种和蓝色品种中表达量尽管有差异,但整体趋势一致。7.利用高效液相色谱测定葡萄风信子黄酮醇的含量。结果显示,黄酮醇的积累与FLS基因的表达基本一致。并且白花葡萄风信子黄酮醇含量要高于亚美尼亚中黄酮醇含量。