荷花NnTP1和NnTP2基因调控‘千瓣莲’花型形成的机理研究

• 花匠小妙招
• 2024-08-26 17:11

　　荷花(lotus)又名莲花,系莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelu mbo)的多年生草本宿根花卉,也是我国十大传统名花中唯一的水生花卉,在我国的栽培历史长达2500多年,具有深厚的文化底蕴。荷花花色艳丽,花型丰富,可分为单瓣、半重瓣、重瓣、重台和千瓣五种类型,其中千瓣型最为特殊,因其雌雄蕊完全瓣化、花瓣数目极多、单朵花期长而具有更高的观赏和科研价值。迄今为止,被报道的千瓣品种仅有‘千瓣莲’、‘宜良千瓣’和‘至尊千瓣’三例,多样性低,极大地限制了该类品种的观赏应用,因而以了解千瓣型荷花形成的分子机理为基础,培育出更多的千瓣型荷花将成为今后科研和育种工作的一大主要目标。由于受到高度重瓣化的荷花往往不育特性的限制,通过传统的杂交育种方式几乎无法培育出千瓣型的品种,唯有通过分子育种的途径来实现突破。前期的研究发现,千瓣的形成是由NnTP1(Nelumbo THOUSAND PETALS-1)和NnTP2基因的表达异常引起,但NnTP1基因cDNA全长序列并未发生突变,仅在启动子2000 bp的区域内出现了一个28 bp碱基位点的缺失。本研究在此基础上,深入分析NnTP1和NnTP2基因的表达模式及其受调控的方式,揭示‘千瓣莲’形成的分子机制,为将来培育新的千瓣荷花品种提供科学的理论依据。本研究以单瓣、重瓣、重台和千瓣等不同花型品种的的花蕾为材料,对荷花的花器官发育关键调控基因NnTP1和NnTP2的表达模式进行了分析,并分别通过过量、RNAi干扰和CRISPR/Cas9敲除等手段对基因功能进行了验证。主要研究内容及结果如下:1、采用Real-time quantitative PCR技术在荷花不同瓣型品种、不同组织、花药不同发育时期中测定NnTP1和NnTP2基因的表达量,并对表达模式进行分析。结果显示:(1)在‘洪湖红莲’(单瓣)、‘唐招提寺’(重瓣)和‘千瓣莲’(千瓣)中检测关键调控基因的表达情况,和‘洪湖红莲’相比发现,这两个关键调控基因在‘千瓣莲’中几乎不表达,在其他品种‘单洒锦’(单瓣)、‘大洒锦’(重瓣)、‘中山红台’(重台)和‘至尊千瓣’(千瓣)中也检测出相似的表达情况,初步认为NnTP1和NnTP2基因表达量下降是荷花花型重瓣化的主要原因;(2)进一步在单瓣品种(‘洪湖红莲,)中检测关键调控基因在不同组织中的表达情况,发现两个基因都在雄蕊中的表达量最高,在莲蓬和雌蕊中低丰度表达,而在其他组织中几乎不表达,推测NnTP1和NnTP2基因是一类主要在雄蕊中表达的基因;(3)对单瓣品种(‘洪湖红莲’)不同发育时期的花药进行检测,结果显示两个基因的表达量随着花药的发育逐渐增强,在小孢子中期达到峰值,提示NnTP1和NnTP2基因可能参与雄蕊的发育进程;(4)两个关键调控基因的表达模式趋于一致,但NnTP1基因较NnTP2基因的整体表达丰度更高,因此该基因可能对荷花花器官发育的调控更关键。2、成功构建了植物过量表达载体p35S-TP1、p35S-TP2;植物超量表达载体2×p35S-TP1、2×p35S-TP2;RNAi干扰表达载体pHB-TP 1-RNAi、pHB-TP2-RNAi;CRISPRCas9 敲除表达载体 1300-TP1-CR ISP、1300-TP2-CRISP;以及启动子2000 pb的GUS表达载体1301-GUS-TP1-HH、1301-GUS-TP1-QB 和 1301-GUS-TP2-HH。以农杆菌为介导,在模式植物拟南芥和矮牵牛,新型植物材料瓦氏秋海棠上进行功能分析和验证,得到以下结果:(1)花序浸渍法将超量表达载体转化野生型拟南芥,经潮霉素抗性筛选获得转NnTP1基因幼苗16株,转NnTP2基因幼苗23株,表型观察发现植株总体表现为生长发育不良的状态:矮小、瘦弱、叶片小而卷曲、顶端略微发黄;相比野生型开花和结实时间大幅度提前,整个生长周期缩短一半;花器官结构出现异常,主要表现为第二轮花瓣向雄蕊状结构转变;在果荚的形成过程中,外轮萼片不脱落,果荚表面崎岖不平,成熟期结实率显著下降等生物学变化;(2)花序浸渍法将NnTP1基因启动子GUS载体转化野生型拟南芥,经潮霉素抗性筛选获得转TP1-HH和TP1-QB幼苗分别有24株,但其表型与野生型相比无明显变化。活性检测发现GUS基因在‘洪湖红莲’启动子的驱动下能在拟南芥维管束、果荚中表达,但在花药中未观察到表达;而‘千瓣莲’启动子在拟南芥各个组织中未能检测到表达;(3)叶盘法将超量表达载体转化矮牵牛W115,初步获得转NnTP1基因阳性苗2株,转NnTP2基因阳性苗1株,表型变化有待进一步观察分析;(4)喷雾法将超量表达载体转化瓦氏秋海棠,初步获得转NnTP1基因阳性苗6株,转NnTP2基因阳性苗2株,表型变化有待进一步观察分析;(5)叶盘法将过量表达载体转化瓦氏秋海棠,组织培养结果不太理想,未能诱导出芽;3、将pHB植物超量表达载体、RNAi干扰表达载体、CRISPR敲除表达载体采用农杆菌介导的花粉管通道法转化荷花,收获转化种子1225粒,经PCR少量检测后分别获得超量表达NnTP1转基因荷花14株,超量表达NnTP2转基因荷花10株,RNAi干扰NnTP1转基因荷花68株,RNAi干扰NnTP2转基因荷花27株,CRISPR敲除NnTP1和NnTP2转基因荷花各有13株,初步建立了荷花的遗传转化体系,各类转基因荷花的表型变化有待进一步观察分析。   

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