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高中生物选修三《现代科技生物专题》(一)基因工程

花匠小妙招
2024-08-26 17:16

专题一基因工程

1.1DNA重组技术的基本工具

1.基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术赋予生物以新的遗传性状，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

2.基因工程的基本工具是限制酶、DNA连接酶、载体。

①限制性核酸内切酶又称限制酶，被称为“分子手术刀”。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们的作用是识别特定双链DNA序列，并切开其中一条链的特定位置。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即平末端和黏性末端。

②DNA连接酶被称为“分子缝合针”，其作用是将DNA片段拼接成新的DNA分子，根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：Ⅰ.从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶；II.从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接；T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率比较低。

③基因进入受体细胞的载体被称为“分子运输车”，通常是利用质粒作为载体。它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段或基因插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等基因，这些基因的作用是供重组DNA的鉴定和选择。

3.在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段上也有很大差别。

4.在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

5.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别：DNA连接酶是连接两个DNA片段之间，不需要模板；DNA聚合酶是连接单个的脱氧核苷酸，需要模板。

6.限制酶不剪切细菌本身的DNA的原因是：①DNA分子不具备这种限制酶的识别序列；②DNA甲基化修饰（表观遗传学修饰），限制酶不能切开。

1.2基因工程的基本操作程序

1.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

2.获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以利用人工方法合成。目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

3.目前获取目的基因的常用方法有：从基因文库中获取目的基因、利用PCR扩增目的基因。此外，如果已知基因序列，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

4.将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中存储，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。其中基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。一些基因文库只有包含了一种生物的部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。从基因组文库中得到所需的目的基因要根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。

5.基因组文库与cDNA文库的区别：

①文库大小：基因组文库大，cDNA文库小。

②基因中启动子即具有启动作用的DNA片段，基因组文库有启动子，cDNA文库无启动子。

③基因中内含子即位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段，基因组文库有内含子，cDNA文库无内含子。

④基因的数量：基因组文库含有某种生物的全部基因，cDNA文库含有某种生物的部分基因。

⑤物种间的基因交流：基因组文库中物种间的基因部分可以交流，cDNA文库中物种间的基因可以交流。

6.PCR是多聚酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。它是利用DNA双链复制的原理。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知核苷酸序列的目的基因，以便于根据这一序列合成引物（特异性）。扩增的过程是：目的基因受热变性后解链为单链→引物与单链相应互补序列结合→在Taq酶（热稳定的DNA聚合酶）作用下进行延伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因此目的基因的量可以成指数形式扩增。

7.基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时使目的基因能够稳定维持和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、标记基因、终止子等（复制原点）。启动子是一段具有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子位于基因的尾端，是一段具有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。

8.将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞中维持稳定和表达的过程称为转化。

9.将目的基因导入受体细胞的几种常用的转化方法：

（1）将目的基因导入植物细胞的方法：

①将目的基因导入植物细胞最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞。这时农杆菌中的Ti质粒的T-DNA（可转移的DNA），可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持并表达。由于这种方法比较经济和有效，迄今为止，约80%的转基因植物都是通过这种方式获得的。

②基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6-4μm。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。

③花粉管通道法：我国科学家独创。就是在植物受粉后，形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加含有目的基因的DNA，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国的转基因抗虫棉就是用这种方法获得的。

（2）将目的基因导入动物细胞：

①显微注射法是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。显微注射法的基本操作程序是：首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1-3μm/mL；然后，从雌性动物体内取出卵，卵可以在体内或体外受精，采用显微注射仪进行显微注射；再将注射了目的基因的受精卵，经早期胚胎培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。

（3）将目的基因导入微生物细胞：

①早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，原因是：繁殖快，多为单细胞，遗传物质较少，其中以大肠杆菌应用最为广泛。

②大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用钙离子处理细胞，使细胞处于能吸收外界环境中的DNA的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。

10.目的基因的检测与鉴定：目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。

（1）分子检测：

①要检测目的基因是否导入受体细胞，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，则表明目的基因已形成蛋白质产品。

②需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测的方法是分子杂交技术，与上述方法不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出现杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。

③检验目的基因是否翻译成蛋白质。检测的方法是，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若有杂交带出现，则表明目的基因已形成蛋白质产品。

（2）个体检测：

①一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病的特性，需要做抗虫或抗病的接种试验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。又如，有的基因工程产品需要天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。

11.作为基因工程表达载体，只含有目的基因不可认为完成任务，原因是：可能缺少启动子、标记基因、终止子等。

12.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，想将一个抗病基因导入单子叶植物，从理论上说，应当的做法是：在单子叶植物的伤口处涂上酚类化合物。

1.3基因工程的应用

1.植物基因工程硕果累累

①转基因大豆、棉花、油菜、玉米已进入大规模商业化应用阶段，我国转基因作物的种植面积也迅速增长，目前已位居世界第四。

②植物基因工程主要用于提高植物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱、抗盐碱等），以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。

（1）抗虫转基因植物

从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性，已成为防治作物虫害的发展趋势，其意义在于减少环境污染，降低生产成本，减少环境污染，用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。例如，我国转基因抗虫棉就是转入Bt毒蛋白基因培育出来的，它对棉铃虫具有较强的抗性。我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉的研究和应用，取得了突飞猛进的发展。

①Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转入该基因的植物时，Bt基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道，在消化酶的作用下蛋白质能够降解成相对分子质量比较小的、有毒的多肽。多肽结合在肠上皮细胞的特异性受体上，会导致细胞膜穿孔，细胞肿胀裂解，最后导致害虫死亡。

②蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中，它产生的抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形成复合物，从而阻断或降低蛋白酶的活性，使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质。这种复合物还能刺激昆虫分泌过量的消化酶，引起害虫的厌食反应。

③淀粉酶抑制剂基因产生的淀粉酶抑制剂可以一直昆虫消化道中的淀粉酶活性，使害虫不能消化所摄取的淀粉，从而阻断害虫的能量来源。

④植物凝集素基因控制植物合成糖蛋白，这种糖蛋白可与昆虫肠道上的某种物质结合，从而影响害虫对营养物质的吸收和利用。

（2）抗病转基因植物

引起植物生病的微生物称为病原微生物，主要有病毒、细菌、真菌等。抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；抗真菌转基因植物中可使用的是几丁质酶基因和抗毒素合成基因。

（3）抗逆转基因植物

目前科学家们正在利用一些可以调节细胞渗透压的基因，来提高农作物的抗盐碱和抗干旱的能力，还研究开发出了一批耐寒作物，使他们在寒冷的环境条件下良好的生长。例如，将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄，使烟草和番茄的耐寒能力均有提高。此外，将抗除草剂基因导入大豆、玉米等作物，喷洒除草剂时，杀死田间杂草而不损伤作物。

（4）利用转基因改良植物的品质

①豆类食品中，含有蛋氨酸比较少，大米、玉米、小麦则含有赖氨酸比较少。这些人人体必需的氨基酸缺少后对人的健康不利。科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键蛋白的活性，以提高氨基酸的含量。例如，我国科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30%。

②番茄含有丰富的维生素，但不耐储存。我国科学家将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄，储存时间可延长1~2个月，有的可达80多天。目前，我国农业部已批准这种耐储存番茄进行商品化生产。我国科学家还成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异。

2.植物基因工程硕果累累

（1）抗虫转基因植物

①动物基因工程技术可以提高动物的生长速率。由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快。

（2）用于改善畜产品的品质

①有些人食用牛奶后，对牛奶中的乳糖不能完全消化；也有人食用牛奶后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。

②科学家将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，然后送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需的药物，而称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。

（3）用转基因动物作器官移植的供体

①由于猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似，而且猪体内隐藏的，可导致人类疾病的病原体要远远少于灵长类动物，是否可以用猪的器官来解决人类器官的来源问题呢？科学家将目光集中在小型猪身上，实现这一目标的最大难题是免疫排斥。目前，科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造，采用的方法是将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制基因的表达，或设法除去抗原决定簇基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。

（4）基因工程药物异军突起

①基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株一般称为“工程菌”。

②干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白。由于干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染。

3.基因治疗曙光初照

①基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。

②从1990年成功转移腺苷酸脱氨酶基因到现在，大部分基因治疗的临床试验，都是先从病人体内获得某种细胞，例如T淋巴细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。上述方法操作复杂，效果较为可靠，称为体外基因治疗；例如1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者肺组织中。这种直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法叫做体内基因治疗。这种基因治疗方法操作简单。

③用于基因治疗的基因有三类。第一类是从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用于取代病变基因，或依靠其表达产物，来弥补病变基因带来的生理缺陷，如对血友病和地中海贫血病的治疗。第二类是反义基因，即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻止非正常蛋白质合成。第三类是编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫做自杀基因。

4.神奇的基因芯片

①基因芯片又叫做DNA芯片，寡聚核苷酸芯片，或DNA微阵列。其概念来自计算机芯片，是伴随“人类基因组计划”的研究进展而发展起来的一门高新技术。

②基因芯片的用途广泛，可以用于基因测序，寻找有用的目的基因，或对基因的序列进行分析。

③基因芯片在临床诊断方面表现出的独特优势是：它不仅能在早期诊断中发挥作用；与传统检测方法相比，它可以在一张芯片上，同时对多个病人进行多种疾病的检测；利用基因芯片，还可以从分子水平上了解疾病。

④基因芯片诊断技术的特点是快速、高效、自动化等。

1.4蛋白质工程的崛起

1.蛋白质工程崛起的缘由

基因工程的实质是将一种生物的基因导入另一种生物体内，后者则可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要。例如。干扰素是动物体内的一种糖蛋白，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在-70℃的条件下，可以保存半年。玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两个关键酶即天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性受细胞内赖氨酸浓度的影响较大，当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两个酶的活性。所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天冬氨酸激酶的352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬氨酰变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。

2.蛋白质工程的基本原理

①蛋白质工程的目的是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过基因来完成。

②天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→表达（转录和翻译）→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能；而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是：预期蛋白质功能→预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（即基因）。

③蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二种基因工程。

3.蛋白质工程的进展和前景

①生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少、效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。

②蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还很不够。