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一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法

花匠小妙招
2024-11-23 10:37

本发明属于植物病害检测，具体涉及一种能够快速高通量地鉴定小麦对禾谷镰孢菌的抗性水平的方法。

背景技术：

1、小麦赤霉病是一种真菌性的穗部病害，发生于温暖潮湿的气候条件下，常造成小麦产量和籽粒品质的降低，是危害小麦生产的重要病害之一。该病主要由病原真菌禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)造成。禾谷镰孢菌是植物十大病原性真菌之一(deanetal.2012)，能够侵染小麦根、茎秆、叶片、穗等多种器官。病菌在成功入侵后能够分泌脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,don)等毒素，这些毒素对人畜有害，会导致呕吐、腹泻等症状(chen et al.2019)。近年来，受气候变暖、降雨量增多、秸秆还田不充分、玉米-小麦/水稻-小麦轮作等因素的影响，赤霉病频发高发，逐渐变成世界范围内小麦的流行病害(baiet al.2018；ma et al.2019)。

2、在实际生产中，常通过喷洒药剂、栽培管理、种植抗病品种等方式对小麦赤霉病进行防控。实践表明，培育并种植抗病品种是最为经济有效的基础策略。但是，目前在小麦及其近缘种中尚未发现对赤霉病免疫的抗源，生产中广泛种植的小麦抗病品种的抗性级别大多数在中抗水平，而可供育种利用的抗病基因资源十分匮乏。因此，持续不断地鉴定新抗源，发掘新的抗病基因，并将之应用于抗病育种，是应对赤霉病威胁的长久之策。

3、小麦赤霉病的抗性分为5种类型，分别为typeⅰ(抗侵染)、typeⅱ(抗扩展)、typeⅲ(抗毒素积累)、typeⅳ(籽粒抗性)、typeⅴ(耐病性)(mesterházy 1995)。typeⅰ抗性是指小麦对病原菌初侵染的抗性，即寄主阻止病原菌定殖的能力；typeⅱ抗性是指小麦抵御病原菌在穗部扩展的能力；typeⅲ抗性是指小麦抑制don等毒素积累或降解毒素的能力，一般通过测定感染赤霉病的种子中don含量来评价；typeⅳ代表籽粒抗病性，通常用病麦粒百分比来衡量；typeⅴ代表耐病性，通常以受赤霉病菌侵染后小麦产量的损失大小来衡量。

4、无论何种抗性，准确的表型鉴定是关键。在实际生产中，小麦赤霉病的人工抗性鉴定通常采用多种方法。单花滴注法是应用最为广泛的方法，通常在小麦扬花初期对穗中部的一个小花注射孢子液，三周后统计病小穗数，以病小穗数占总小穗数的比例评价抗病性(王裕中等，1982)。在赤霉病的研究中，研究人员广泛利用单花滴注法筛选抗源、鉴定目的品种的抗病性等，但单花滴注法仅能反映typeⅱ抗性，不能反映typeⅰ抗性。在单花滴注法的基础上，zhang et al.(2021)发明了穗轴接种法，在小麦扬花初期将孢子液注射到穗基部节间内部，根据第1个病小穗出现的时间以及接种21天的病小穗率来评价抗病性。该方法可作为单花滴注法的补充，反映typeⅱ抗性。孢子喷雾或土表放置病麦粒法可以模拟自然条件下病原菌对寄主的侵染能力，通常以病穗率、病情指数等作为评价标准，能同时反映typeⅰ和typeⅱ抗性。但该方法受环境影响较大，喷雾次数、喷雾均匀程度、温湿度等均会影响鉴定的可靠性，导致个体间发病率差异较大。除人工接种鉴定外，还可采用重病区自然鉴定法，在赤霉病发病严重地区种植鉴定材料，或在本地试验田利用喷水等装置创造适宜病害发生的条件，完全依靠自然发病。自然鉴定易受环境条件影响，鉴定结果的一致性和稳定性较差。

5、上述接种方法均耗时费力，易受环境条件影响，且评价标准中需要统计发病和未发病小穗数，易受个人主观判断影响，不仅等待时间较长，还耗费大量人力物力，因此无法应用于高通量抗源精准鉴定，严重制约抗源发掘及育种工作的进展。探索简便快捷的接种方式，建立高效的评价方法，对快速摸清种质资源“家底”，抢占小麦赤霉病育种先机，加快推进种业振兴具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，以解决现有鉴定小麦赤霉病抗性的方法存在的对接种技术、环境条件要求比较高，病情鉴定依赖人工判断，耗时耗力，而且不适合进行高通量鉴定的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，包括以下步骤：

4、步骤1，培养禾谷镰孢菌，并制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液；

5、步骤2，剪取小麦穗子，浸没于步骤1制备的孢子悬浮液中，然后将充分沾有菌液的穗子置于培养箱内生长，生长后取出小麦穗子；

6、步骤3，将小麦穗子清洗，并提取dna；

7、步骤4，用基于dna的实时荧光定量pcr技术检测禾谷镰孢菌特有基因osp24的量，通过计算禾谷镰孢菌osp24基因量相对于小麦actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的生长量，进而判断小麦对禾谷镰孢菌的抗性。

8、优选的，所述步骤1中，禾谷镰孢菌的孢子悬浮液中的孢子浓度为1×105个/ml。

9、所述步骤2中，选取扬花期的小麦穗子，将其完全浸没在含有tween-20的孢子悬浮液中，2min后，取出小麦穗子，基部置于装有水的容器中，用塑料袋将小麦穗子套住以保持湿度，置于培养箱中，不超过2d后，取出小麦穗子。

10、优选的，所述孢子悬浮液中，tween-20的体积浓度为0.05％。

11、优选的，所述步骤3中，小麦穗子剪去麦芒后，置于离心管中，用含表面活性剂的灭菌水剧烈震荡、涡旋以去除表面微生物，重复3次，每次清洗后均用干净吸水纸吸干水分。

12、优选的，所述表面活性剂为silwet l-77。

13、优选的，所述灭菌水中，表面活性剂的体积浓度为0.02％。

14、优选的，所述步骤3中，采用ctab法抽提小麦穗子dna。

15、优选的，所述步骤4中，设计针对osp24基因的特异性引物，通过pcr技术得到osp24基因的特异产物，以此来标记禾谷镰孢菌。

16、优选的，所述针对osp24基因的特异性引物如下：

17、osp24-drt-f1(5′-ctcacaatgccctggaaataaac-3′)；

18、osp24-drt-r1(5′-cgagcggtagcaaagacat-3′)。

19、有益效果：本发明的技术方案简单易操作，对环境条件要求不高，只需用病菌孢子液浸泡小麦穗子后放置于培养箱培养，之后抽提小穗dna检测病菌基因即可完成全部流程。本发明适用于高通量鉴定，耗时短，不会消耗大量人力物力。

技术特征：

1.一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤1中，禾谷镰孢菌的孢子悬浮液中的孢子浓度为1×105个/ml。

3.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤2中，选取扬花期的小麦穗子，将其完全浸没在含有tween-20的孢子悬浮液中，2min后，取出小麦穗子，基部置于装有水的容器中，用塑料袋将小麦穗子套住以保持湿度，置于培养箱中，不超过2d后，取出小麦穗子。

4.根据权利要求3所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液中，tween-20的体积浓度为0.05％。

5.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤3中，小麦穗子剪去麦芒后，置于离心管中，用含表面活性剂的灭菌水剧烈震荡、涡旋以去除表面微生物，重复3次，每次清洗后均用干净吸水纸吸干水分。

6.根据权利要求5所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述表面活性剂为silwet l-77。

7.根据权利要求5或6所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述灭菌水中，表面活性剂的体积浓度为0.02％。

8.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤3中，采用ctab法抽提小麦穗子dna。

9.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤4中，设计针对osp24基因的特异性引物，通过pcr技术得到osp24基因的特异产物，以此来标记禾谷镰孢菌。

10.根据权利要求9所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述针对osp24基因的特异性引物如下：

技术总结
本发明公开了一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，包括以下步骤：培养禾谷镰孢菌，并制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液；剪取小麦穗子，浸没于孢子悬浮液中，然后将充分沾有菌液的穗子置于培养箱内生长，生长后取出小麦穗子；将小麦穗子清洗，并提取DNA；用基于DNA的实时荧光定量PCR技术检测禾谷镰孢菌特有基因OSP24的量，通过计算禾谷镰孢菌OSP24基因量相对于小麦Actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的生长量，进而判断小麦对禾谷镰孢菌的抗性。本发明能够快速高效地筛选出抗赤霉病的小麦材料，从而为筛选可供育种利用的小麦抗赤霉病种质资源以及定位、克隆抗赤霉病基因奠定基础。

技术研发人员：马海港,赵雪妍,马鸿翔,刘永江,张苏红,高玉姣,王永刚,戴毅
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15