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一种利用注射器注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法

花匠小妙招
2024-11-23 11:24

专利名称：一种利用注射器注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种番茄黄化曲叶病毒的接种方法，属植物保护领域。
背景技术：
番茄黄化曲叶病是番茄上一种毁灭性的病毒病，该病自1964年首次报道以来，在欧洲、非洲、亚洲、加勒比海及大洋州等地区都有发生危害的报道，特别是近年来，随着全球气候变暖和耕作制度的改变以及国际间贸易的增加，番茄黄化曲叶病在全球范围传播，给番茄生产造成了严重损失。1991-1992年该病在美国佛罗里达州番茄上暴发，造成的损失达 1. 4亿美元。在我国，由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)导致的番茄黄化曲叶病最早于2006年在上海和浙江出现危害报道，番茄受其侵染后早期会表现叶缘黄化、上卷，叶片变小、植株矮缩；后期整株上部呈现簇缩状，花萎蔫，座果率大大降低，严重影响番茄的产量和质量，发病重的棚室多造成绝产绝收，经济损失巨大。2007年该病传入江苏、安徽、山东危害，随后在河北、北京、天津、内蒙古等省市也相继出现危害，扩展蔓延速度十分惊人，同时造成的危害也异常惨重。2008年末到2009年初仅河北邯郸市因番茄黄化曲叶病造成的直接经济损失就近1亿元。目前该病已经逐渐成为当前我国番茄生产上一个重要的制约因素。由于番茄黄化曲叶病毒是一种烟粉虱传播的病毒，因此常规的生物学实验常常采用烟粉虱接种法米研究番茄黄化曲叶病毒。但是由于该方法操作过程中需要烟粉虱来实现传毒，因此无论是在室内还是在田间实验，该方法都存在一些难于克服的问题1、烟粉虱的接种虫量难于控制，由于烟粉虱的生活周期非常短，世代重叠现象非常严重，导致其群体增殖能力非常强，而烟粉虱的个体又非常小，因此无论是在田间还是在室内，单株上接种的烟粉虱数量很难控制；2、带毒烟粉虱的接种数量难于控制，由于烟粉虱本身的接种虫量难于控制，也导致了其中带毒烟粉虱的接种虫量难于计量；3、烟粉虱的传毒效率难于控制，由于烟粉虱是一种传毒昆虫，只有在其取食的过程中才能实现传毒，而其取食受诸多因素影响，如温度、湿度、光照、寄主等等，这些因素会影响其取食次数及取食量，对接种效率产生影响，进而对实验结果的准确性也产生影响；4、由于烟粉虱传播的病毒非常多，因此使用烟粉虱接种番茄黄化曲叶病毒的时候，烟粉虱可能同时携带其它病毒，影响接种结果。除了烟粉虱接种方法外，还有一些其它的接种方法，如嫁接接种法、基因枪接种法 (biolisticinoculation)，但是这些接种方法也存在操作繁琐，成本较高等问题。为了解决烟粉虱等接种方法上存在的问题，我们创制了一种基于侵染性克隆注射接种的方法，该方法操作简便，重复性好，可控性好，效率高，结果准确，为研究及利用番茄黄化黄化曲叶病毒提供了一种新方法。

发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，为番茄黄化曲叶病毒的接种提供了一种快速、简便、有效的方法。1、接种用的材料含PTYjOl的农杆菌保存于江苏省农科院植保所病害室(江苏省南京市孝陵卫钟灵街50号，210014)，接种用的注射器采用标准的一次性注射器(Iml)，YEP培养基及抗生素的配制参照《分子克隆实验指南(第三版)》。2、接种处理方法a)将含有PTYjOl的农杆菌接种含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin，Km)和50mg/ ml的链霉素(Str印tomycin，SM)的YEP液体培养基中，28 °C 150rpm培养至OD6tltl达到 0. 6-0. 8。b)在玻璃温室内(温度为25_28°C )用穴盘育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3-4片叶时进行接种处理。c)用Iml注射器取菌液于3-4叶期番茄茎杆韧皮部注射3_4点，注射处理后的番茄于玻璃温室(温度为25-28°C )内放置，观察发病情况。本发明的有益效果是避免了常规烟粉虱接种方法的上的缺陷，无需饲养烟粉虱，无需繁琐的操作，只要通过简单的茎杆注射就可以实现番茄黄化曲叶病毒的接种。

附图是番茄黄化曲叶病毒茎杆注射接种示意图
具体实施例方式实例一以番茄品种东圣1号为材料，通过茎杆注射方法接种番茄黄化曲叶病毒。1、实验处理a)将含有PTYjOl的农杆菌接种含50gm/ml的卡那霉素(Kanamycin，Km)和50mg/ ml的链霉素(Str印tomycin，SM)的YEP液体培养基中，28 °C 150rpm培养至OD6tltl达到 0. 6-0. 8。b)在玻璃温室内用穴盘育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3-4片叶时进行接种处理。c)用Iml注射器取菌液于3-4叶期番茄茎杆韧皮部注射3_4点，共注射番茄21 株，注射处理后的番茄于玻璃温室内(25-28°C )放置，观察其发病情况。2、实验结果处理后的番茄于接种后12天出现症状，16天症状非常典型(21棵番茄全部发病)，表现明显的叶缘黄化。其后病株症状继续加重，表现叶片变小、叶缘上卷、植株矮缩等症状。与田间番茄黄化曲叶病病株症状一致，说明该接种方法是有效的。
权利要求
一种利用注射器注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法，包括以下步骤(1)将含有PTYj01的农杆菌接种含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin，Km)和50mg/ml的链霉素(Streptomycin，SM)的YEP液体培养基中，28℃150rpm培养至OD600达到0.6 0.8；(2)在玻璃温室内(温度为25 28℃)用穴盘育苗，2片真叶时移至一次性营养钵中，3 4片叶时进行接种处理；(3)用1ml注射器取菌液于3 4叶期番茄茎干韧皮部注射3 4点，注射处理后的番茄于玻璃温室(温度为25 28℃)内放置，观察发病情况。
2.根据权利要求1所述的注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于育苗及接种用的玻璃温室温度为25-28°C。
3.根据权利要求1所述的注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于接种用的材料为 PTYjO 1。
4.根据权利要求1所述的注射接种番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于接种的病毒为番茄黄化曲叶病毒。
全文摘要
本发明提供一种快速接种番茄黄化曲叶病毒的方法，属植物保护领域。利用构建好的侵染性克隆PTYj01，通过茎杆注射法实现了番茄黄化曲叶病毒的快速接种。传统的番茄黄化曲叶病毒接种常采用烟粉虱接种法，需要专门饲养烟粉虱，接种效率受到介体昆虫传毒效率的影响，同时还可能受到其它粉虱传病毒的干扰。该方法有效的克服了传统烟粉虱接种法的缺点，无需饲养烟粉虱，操作简单，效率高，重复性好，可控性好，是一种简便而有效的接种方法。
文档编号C12N7/00GK101892201SQ20101020706
公开日2010年11月24日申请日期2010年6月23日优先权日2010年6月23日
发明者余文贵, 周彤, 周晓伟, 周益军, 孙海霞, 季英华, 程兆榜, 赵统敏申请人:江苏省农业科学院