菊花CmMYB1和CmMYB2转录因子基因的克隆及功能鉴定

• 花匠小妙招
• 2024-11-23 11:42

【摘要】： 植物通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达来调控其生长发育及生理代谢。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族之一,参与植物次生代谢调控、激素和环境胁迫的应答,并对细胞分化和植物叶片等器官的形态建成起重要的调控作用。菊花原产我国,是我国十大传统名花和世界四大切花之一,具有很高的观赏和应用价值,在花卉生产中占有十分重要的地位。但菊花新基因的发掘和分子育种方始起步,本研究以菊花为研究材料,从中分离克隆出新的MYB转录因子,以期为MYB转录因子在植物次生代谢调控及其胁迫应答等方面的研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下：1.根据菊花EST文库筛选出2个MYB基因同源片段,据此设计基因特异引物,以自主选育的盆栽多头菊品种‘钟山紫桂’叶片为材料,通过3’、5’RACE-PCR分别得到全长为1,237bp和1,331bp的菊花MYB基因cDNA序列CmMYB1(JF795917)和CmMYB2(JF795918);其中CmMYB1具有一个846bp的ORF,编码281个氨基酸及95bp的5’非编码区和296bp包含了多聚A尾的3’非编码区；CmMYB2具有一个948bp的ORF,编码315个氨基酸及86bp的5’非编码区和297bp包含了多聚A尾的3’非编码区。氨基酸序列比对表明,这2个基因均具有两个MYB结构域,为典型的R2R3-MYB转录因子基因,其中CmMYB1基因属于第4亚群成员,而CmMYB2基因属于第22亚群成员。以基因组DNA为模板对CmMYB1和CmMYB2进行PCR扩增,扩增产物经序列分析表明,CmMYB1含有1个307bp的内含子,而CmMYB2不含内含子。2.克隆了CmMYB1、CmMYB2基因的启动子序列并发现了一些与ABA及胁迫相关的作用元件。3.构建2个酵母效应质粒pGBKT7-CmMYBl和pGBKT7-CmMYB2,转入酵母菌株Y2H中,并分别在缺陷培养基SD/-Trp上筛选后转入SD/-His-Ade上培养,结果表明,CmMYB1和CmMYB2均无明显的转录激活功能。4.荧光定量PCR结果表明,CmMYB1和CmMYB2基因在菊花的根、茎、叶和花的5个发育阶段都有表达,且在茎中的表达量最高,CmMYBl在叶片和花的完全着色与初开期时表达量较高,在根中表达较低；CmMYB2基因在叶中表达量也较高,但在根和开花的各个时期表达量均较低。胁迫应答的检测结果显示,在高盐、干旱(PEG)、低温和ABA诱导条件下,CmMYB2的表达量在处理后1h均有所增加,而CmMYB1的表达量除了在低温胁迫下略有上升外,其他胁迫条件下均较低。5.构建绿色荧光蛋白融合表达载体,农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,CmMYB1、CmMYB2蛋白位于细胞核中。6.构建植物表达载体pCAMBIA1301-CmMYB1和pCAMBIA1301-CmMYB2,利用农杆菌介导法转化拟南芥(Co1.0),通过潮霉素抗性、GUS染色及RT-PCR筛选鉴定阳性苗。转CmMYB1植株和野生型植株在表型上没有区别；qRT-PCR检测结果显示,CmMYB1降低木质素合成途径以及由总苯丙氨酸途径通往木质素合成途径的关键酶基因AtCAD (cinnamyl alcohol dehydrogenase,肉桂醇脱氢酶)、AtCOMT (caffeic acid o-methyl-transferase,咖啡酸-0-甲基转移酶)、AtC4H (cinnamate4-hydroxylase,肉桂酸-4-羟基酶)和At4CLl (4-coumarate-CoA ligase,4-香豆酸：辅酶A连接酶)的表达,结果在CmMYBl表达的拟南芥中,木质素含量降低。转CmMYB2植株较野生型开花延迟,叶片数目增多,耐胁迫检测结果表明,CmMYB2在拟南芥中的过表达,增强了转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性；qRT-PCR检测结果显示,过表达CmMYB2拟南芥中RD22、RD29A、RAB18、COR47、ABA1和ABA2等胁迫相关基因的表达量增强；此外,CO(CONSTANS)、FT (FLOWERING LOCUS T)、SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1)、LFY(LEAFY)、API (APETALA1)等开花相关基因的表达量降低,与转CmMYB2植株晚花表型相吻合。

【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011

相关知识

菊花DREB同源基因的克隆和功能分析
单子叶植物蓝色花形成关键转录因子基因克隆与功能研究
菊花反转录转座子鉴定及分子标记开发
花特异转录调节因子的克隆
转录因子RhERF092的分离及其在月季花朵开放中的功能鉴定
百合双色花形成的转录组分析及基因LhUFGT和LhSGR的功能研究
植物WRKY转录因子家族基因抗病相关功能的研究进展
菊花‘神马’花芽分化期的数字基因表达谱及关键基因的克隆和表达分析
桂花OfABFs基因克隆和表达分析
CmMYB42转录因子调控菊花低氮胁迫的机理研究

网址: 菊花CmMYB1和CmMYB2转录因子基因的克隆及功能鉴定 https://m.huajiangbk.com/newsview673331.html