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一种郁金香碎色病毒RT

花匠小妙招
2024-11-23 11:46

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

郁金香是国际名花之一，以高贵、典雅为世界人民所宠爱，是欧亚等地区近20个国家的国花。近年来，我国各地相继举办了郁金香花展，获得了较好的效益。虽然郁金香在我国很早就有少量栽培，但大部分仍从荷兰等国家进口。20世纪80年代中后期以来，我国从国外引进郁金香商品种球数量逐年成倍增长，其携带的一些有害生物也随之传入，包括真菌、细菌、线虫和病毒等，潜在危害性很大。郁金香碎色病是种球常见感染之一，其造成种球退化，严重影响了郁金香的生产。

引起郁金香碎色病的病原体是郁金香碎色病毒(Tulipa breaking virus,TuBV)，病毒粒子大小为700nm×(12-13)nm。感染TuBV的主要症状是叶片出现浅绿色或灰白色条斑，有时形成花叶，在红花和紫花品种上产生碎色花，花瓣上形成大小不等浅色斑点或条斑，严重时植株生长不良，还可危害百合类花卉。

目前检测郁金香病毒多使用抗血清的ELISA法或RT-PCR法，然而这两种方法均存在不足：ELISA法须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而RT-PCR灵敏度和特异性不高。因此，有必要开发一种快速、准确的TuBV检测方法，以满足产业需求。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。

逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQ ID NO:1)

外引物B3：CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQ ID NO:2)

内引物FIP：CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT

GTTAAATCTGGAGTGT(SEQ ID NO:3)

内引物BIP：ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC

AACTGCTCG(SEQ ID NO:4)。

优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。

优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgSO4组成。

优选地，所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。

优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。

优选地，本发明的试剂盒进一步包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

在另一个方面中，本发明还提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括以下步骤：

(1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA；

(2)设计并合成引物，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQ ID NO:1)

外引物B3：CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQ ID NO:2)

内引物FIP：CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT

GTTAAATCTGGAGTGT(SEQ ID NO:3)

内引物BIP：ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC

AACTGCTCG(SEQ ID NO:4)；

(3)在PCR管中制备25μl的RT-LAMP反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、2U AMV逆转录酶1μl、8U Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH8.0和50mM EDTA作为阴性对照；

(4)LAMP反应：将步骤(3)中PCR管于63℃恒温反应60min；

(5)分析判断反应产物结果：在(4)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgSO4组成。

优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。

本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对病毒保守区域设计特异性和灵敏度高的四条引物，且一步完成逆转灵和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴定简便，较传统的检测方法优势显著。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备

1.1 试剂

引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green I购自Invitrogen；其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。

1.2 试剂盒的制备：

反应缓冲液，按照以下配方配制：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱、50mM MgSO4；

引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度为40pmol/μl。

2U的AMV逆转录酶；

8U的Bst DNA聚合酶；

核酸染料：1000×SYBR Green I；

阳性对照：郁金香碎色病毒基因组DNA；

阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。

实施例2 郁金香碎色病毒特异性检测

2.1 RT-LAMP特异性检测

待测样品包括从郁金香栽培基地获得的5株郁金香碎色病毒以及甜菜花叶病毒、洋葱黄矮病毒和烟草蚀纹病毒各1株。

使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤对郁金香碎色病毒进行检测：

(1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA；

(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其中四种引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、2U AMV逆转录酶1μl、8U Bst DNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH8.0和50mM EDTA作为阴性对照；

(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；

(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl1000×SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

2.2 检测结果

5株郁金香碎色病毒的PCR管中均呈现绿色，而甜菜花叶病毒、洋葱黄矮病毒和烟草蚀纹病毒的显色结果均为橙色，表明引物具有很强的特异性。

实施例3 郁金香碎色病毒灵敏度检测

3.1 RT-LAMP灵敏度检测

按照实施例2的步骤(1)提取郁金香碎色病毒RNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7个梯度。

RT-LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)。

3.2 检测结果

除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pg DNA，灵敏度很高。