利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法.pdf
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域。具体地说，本发明涉及一种改良植物抗虫性的新方法。
背景技术
在农业上，虫害问题一直是影响农作物产量的一个重要因素。人们每年要投入大量的人力、物力来抑制虫害，以提高作物产量。
随着农业害虫对农药的抗性增加，以及出于保护环境和可持续性发展的考虑，迫切需要新的抗虫方法的出台。转基因抗虫植物的出现缓解了这一矛盾，为农业的发展作出了重大贡献，如转基因抗虫大豆，Bt抗虫棉等。然而，目前已陆续有研究报道，随着时间的推移，各种转基因抗虫植物的抗性正在下降，以前大规模罕见的虫害现象又开始死灰复燃。
因此，迫切需要找到新的方法，开发出新型的转基因抗虫植物，以有效地和/或特异性地对抗植物的病虫害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法。
在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗虫性的方法，所述的方法包括步骤：
将表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
Seq反向为跟Seq正向互补的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，
在本发明的另一优选例中，所述dsRNA在植物体内形成干扰RNA。
在本发明的另一优选例中，所述的抗虫性为对植食性昆虫的抗性。
在本发明的另一优选例中，所述的构建物位于表达载体上，所述的表达载体还包含能在植物中转录的启动子。
在本发明的另一优选例中，所述昆虫基因是昆虫生长必需的基因，或在特定条件下(如在有农药、或植物抗毒素等存在或诱导的情况下)能影响昆虫生长发育的基因。
在本发明的另一优选例中，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中表达的基因。更佳地，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中特异性表达或高表达的基因。
在本发明的另一优选例中，所述的植物选自：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。
在本发明的另一优选例中，所述的植物是农作物、花卉植物、或林业植物。
在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)：棉花、烟草、拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱等。
在本发明的另一优选例中，所述的昆虫选自：植食性昆虫。
在本发明的另一优选例中，所述的昆虫包括(但不限于)：棉铃虫。
在本发明的另一优选例中，所述的间隔序列的长度为80-300bp；更佳地为100-250bp。
在本发明的另一优选例中，所述的间隔序列为内含子。
在本发明的第二方面，提供一种昆虫基因dsRNA的用途，用于制备具有抗虫性的植物。
在本发明的另一优选例中，所述的基因是棉铃虫的GIP基因。
在本发明的另一优选例中，所述的昆虫基因被制成一双链构建物，并且其正链或负链含有以下式I结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
Seq反向为跟Seq正向互补的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中后，在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，
式II
式中，
Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成氢键。
在本发明的第三方面，提供一种植物细胞，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因dsRNA的构建物，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
Seq反向为跟Seq正向互补的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在本发明的第四方面，提供一种分离的GIP蛋白，该蛋白选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽；或
(b)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少70％同源度，且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同功能的多肽。
在本发明的第五方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或
(b)在严谨杂交条件下能跟SEQ ID NO：1杂交的核苷酸序列；或
(c)与SEQ ID NO：1所示的序列至少有70％同源度的核苷酸序列；或
(d)连续不少于50个SEQ ID NO：1中所示核苷酸的多核苷酸片段序列，而且该片段能够使GIP基因沉默；或
(e)与(a)，(b)，(c)，(d)序列互补的核苷酸序列。
在本发明的第六方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备抑制昆虫生长的制剂或植物。
在另一优选例中，所述的制剂或植物含有能使GIP基因沉默的dsRNA。
在另一优选例中，所述的dsRNA含有以下式一结构：
Seq1-X-Seq2 式I
式中，
Seq1为GIP基因的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
Seq2为能与Seq1互补的核苷酸序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
X为位于Seq1和Seq2之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1和Seq2不互补。
在另一优选例中，所述的昆虫是棉铃虫。
在本发明的第七方面，提供一种提高不少于50个核苷酸的dsRNA的稳定性的方法，所述方法是：将所述的dsRNA转入没有Dicer样(dicer-like)核酸酶或者Dicer样(dicer-like)核酸酶失活的宿主的细胞，组织或器官中。
在另一优选例中，所述的宿主是真核生物或原核生物。
在本发明的第八方面，提供一种GIP基因的用途，用于制备抑制棉铃虫生长的制剂或植物。
在本发明的另一优选例中，所述抑制棉铃虫生长的制剂为含有可下调GIP基因表达的干扰RNA(如siRNA)的制剂。
在本发明的另一优选例中，所述的制剂用于下调棉铃虫体内GIP基因的表达。
在本发明的另一优选例中，所述的制剂通过抑制GIP基因的转录来下调棉铃虫体内GIP基因的表达。
在本发明的另一优选例中，所述的制剂通过降低棉铃虫对棉酚的耐受性来抑制棉铃虫的生长。
在本发明的另一优选例中，所述的GIP基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明中所指的严谨杂交条件，指的是50℃杂交6-16小时，42℃洗膜30分钟，洗脱液为含50％甲酰胺的5XSSC。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了利用植物表达昆虫基因的dsRNA，通过昆虫取食该植物后抑制昆虫体内相关基因表达的示意图。
图2显示了GIP，GST1基因的核苷酸序列以及推测的蛋白序列。其中，A：GIP的核苷酸序列；B：GIP的蛋白序列；C：GST1的核苷酸序列；D：GST1的蛋白序列。阴影处为本发明的优选方式中用于构建dsRNA载体的序列。ATG：始密码子；终止密码子。
图3显示了在棉酚存在下，GIP的表达与棉铃虫的生长密切相关。
图4A显示了本发明的dsRNA载体的构建。其中，图4A上列为PBI121载体的部分结构，图4A下列为利用PBI121载体构建的PBIdsRNA的部分结构。
图4B显示了Northern印迹检测表达含GIP，GFP或GST1序列dsRNA的转基因烟草和拟南芥。
图5显示了表达含GIP序列的dsRNA转基因拟南芥和烟草对棉铃虫的影响。
图6显示了表达含GIP序列的dsRNA转基因棉花对棉铃虫的影响。
图7显示了表达含GST1序列的dsRNA转基因拟南芥对棉铃虫的影响。
图8显示了棉铃虫在进食表达含dsGIP相应序列的dcl2 dcl3 dcl4三突变体植物后，中肠内的GIP表达被抑制。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现植物体内形成的昆虫基因的干扰RNA(如siRNA)在被昆虫服食后，可达到显著抑制昆虫基因的目的，受昆虫体内消化系统等屏障的影响较小或不受影响。因此，可利用在转基因植物体内产生的昆虫基因的干扰RNA，藉由植食性昆虫取食进入到昆虫体内，行使对靶基因的RNA干扰，抑制靶基因的表达。
因此，本发明人开发了一种利用RNA干扰机制、以植物作为媒介来抑制昆虫生长的方法。即：将包含昆虫基因(或片段)序列的构建物导入到植物内，该构建物在植物体内可表达昆虫基因的dsRNA，所述dsRNA形成干扰RNA(如siRNA)，昆虫在服食了所述植物后，摄入该干扰RNA，在昆虫体内抑制所述昆虫基因的表达，从而达到抑制昆虫生长的目的。
此外，本发明人还发现，在棉铃虫中，有1条基因在棉铃虫对棉酚的解毒中起重要作用，并从亚洲棉铃虫(Helicovepa armigera)cDNA文库中分离到全长的该基因，本发明人将之命名为GIP。进一步的研究发现，抑制GIP基因的表达可显著抑制棉铃虫的生长，并且使棉铃虫对棉酚的耐受性降低。
RNA干扰(RNAi)
如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。
如本文所用，术语“干扰RNA”是指一种双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interferencepathway)。
在本发明中，所述的RNA干扰的基本原理是：以植物作为媒介，使昆虫服食可干扰其基因(如GIP基因)表达的干扰RNA(如siRNA)，从而抑制昆虫的生长。更具体地，所述的原理为：通过转基因的方法让植物体内表达昆虫基因(全长或部分)的双链RNA(dsRNA)，在植物体内形成高丰度的干扰RNA，当昆虫取食这种转基因植物的同时也摄入了大量的干扰RNA，所述的干扰RNA在进入昆虫体内后能够抑制所述昆虫基因在昆虫体内的表达，干扰昆虫正常的生长发育甚至引起昆虫的死亡，从而降低昆虫对植物的取食。如图1所示，其中Dicer为RNA酶III样的核酸酶；RISC为RNA诱导的沉默复合物，“间隔”表示间隔序列。利用所述原理，可以有效地改良植物对于昆虫的抗虫性。
作为一种优选方式，利用一个内含子序列，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“颈-环”结构，并且“颈”状部分能够在植物体内被植物加工成约21-25nt左右的小RNA，这种小RNA能特别有效的抑制目的基因的表达。
将RNA干扰技术应用到转基因抗虫植物上，开发新型的转基因抗虫植物，对农业的发展具有重大的意义。
提高植物抗虫性的方法
基于以上所述的RNA干扰的原理，本发明提供了提高植物抗虫性的方法：将表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向 式I
式中，
Seq正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
Seq反向为同一昆虫基因的反向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
作为本发明的优选方式，表达昆虫基因dsRNA的构建物转入植物细胞、组织或器官中后，在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因dsRNA，
式II
式中，
Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的双链RNA氢键。
本发明对所采用的昆虫基因没有特别的限制。为了能够使昆虫在服食所述的植物后受到抑制，所述昆虫基因通常为昆虫生长必需的基因或在特定条件下能影响昆虫生长发育的基因。如本文所用，所述的“昆虫生长必需的基因”为在昆虫的生长、发育、代谢、繁殖过程中发挥重要作用的基因(也称为“昆虫生长的重要基因”)。所述基因的低表达或不表达将导致昆虫的生长、发育、代谢、繁殖等过程产生异常，甚至导致昆虫的死亡。在用于本发明时，所述的昆虫生长必需的基因是全长基因或基因片段。所述的特定条件比如在有农药或植物抗毒素存在等的情况下。由于昆虫通过口服植物来摄入所述的干扰RNA，因此，所述昆虫基因优选地为在昆虫的胃或肠中高表达的基因。选择在昆虫的胃或肠中高表达的基因可以一定程度地避免昆虫其它组织或器官的基因的干扰RNA在行使干扰作用时，受到昆虫体内各种屏障的影响(如被阻断或降解)。
作为本发明的优选方式，所述的昆虫基因选自(但不局限于)：P450基因(GIP)、或谷胱苷肽-S-转移酶基因(GST1)。
作为本发明的优选方式，本发明优选的昆虫基因的片段的长度至少为50bp，比如可以是60bp、80bp、100bp、200bp、500bp、1000bp。当然也可以采用全长基因。
本发明对所采用的间隔序列的长度没有特别的限制。优选地，所述的间隔序列在与正向序列和反向序列形成构建物且被导入到体内后，能够形成式II所示的dsRNA。作为本发明的优选方式，本发明所述的间隔序列的长度为80-300bp；更佳地为100-250bp。
在本发明中，将所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物导入到植物细胞、组织或器官中，并使所述植物细胞、组织或器官生成植物后，在植物体内表达昆虫基因dsRNA，所述dsRNA形成干扰RNA(如siRNA或其它形式)。
通常，所述的构建物位于表达载体上。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。
尽管在本发明的实例中所举例的昆虫为棉铃虫。然而应理解，本发明对于适用于本发明的昆虫没有特别的限制，所述昆虫可以是任何一种能以植物为食的植食性昆虫，比如其可以是鳞翅目昆虫。
本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。
更具体地，所述的植物包括(但不限于)：棉花、烟草、拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱等。
GIP基因
作为本发明的一个实例，本发明人利用GIP基因来制备所述的具有抗虫性的植物(转基因植物)。
GIP基因是一个棉铃虫中肠高表达的基因，该基因开放阅读框包含1578个碱基(bp)，编码526个氨基酸残基，该基因及其蛋白的序列分别见图2A(SEQ ID NO：1)和图2B(SEQID NO：2)。
免疫组化和RT-PCR分析表明，GIP是一个棉铃虫中肠高表达的基因。GIP基因能被外源添加的棉酚类化合物专一诱导，且在棉酚存在的情况下，其表达水平与棉铃虫体重的增加正相关。因此可知，GIP是一个在棉铃虫取食含棉酚的棉株时起解毒作用的关键基因。将表达含GIP序列的dsRNA载体导入植物中，发现取食这类转基因植物的棉铃虫肠组织中GIP的转录水平被显著抑制并伴随过氧化氢酶活性的上升。同时由于棉铃虫中肠内的GIP表达的下调，而使幼虫生长受到抑制，并且对棉酚的耐受性降低。
作为本发明的一个优选例，本发明人以GIP基因为例，构建了dsRNA表达载体，并将之导入植物中，制备转基因植物并喂食棉铃虫。结果发现，在棉铃虫服食所述植物后，生长受到显著抑制。
因此，本发明还提供了一种GIP基因的用途，用于制备抑制棉铃虫生长的制剂或植物。所述的制剂用于下调棉铃虫体内GIP基因的表达。更优选的，所述的制剂通过抑制GIP基因的转录来下调棉铃虫体内GIP基因的表达。例如，所述抑制棉铃虫生长的制剂为含有可下调GIP基因表达的干扰RNA的制剂。
GST1基因
作为本发明的另一个实例，本发明人利用谷胱甘肽-S-转移酶的基因(GST1基因)来制备转基因植物，以验证RNA干扰机制是否存在。GST1基因及其蛋白的序列分别见图2C(SEQ ID NO：3)和图2D(SEQ ID NO：4)。
本发明人以所述的GST1基因为例，构建dsRNA表达载体，导入植物中。结果发现，当植物表达棉铃虫GST1基因序列的dsRNA后，棉铃虫在取食这类转基因植物后，其中肠内的GST1表达水平下调，并且棉铃虫中肠总蛋白中GST的酶活降低(图6)。
大片段dsRNA也能有效的介导基因沉默
作为本发明的一个实施例，本发明人巧妙地利用3个dicer样核酸酶基因突变的拟南芥突变体(dcl2 dcl3 dcl4三突变体)，对介导昆虫基因沉默的植物dsRNA的有效形式进行了研究。拟南芥中有4个dicer样核酸酶(DCL)，DCL1是相对复杂的一个酶，可参与MicroRNAs和siRNAs的产生，其它3个DCL核酸酶主要参与siRNAs的产生。发明人将所述的昆虫基因GIP的dsRNA的构建物导入到dcl2 dcl3 dcl4三突变体植株后，在植物体内表达昆虫dsRNA，所述dsRNA多数没有被加工成siRNA，保持其原长度，但同样可以使其对应的昆虫基因沉默，甚至效果更好(图8)。
综上说明，通过植物介导的RNAi在昆虫中是一种普遍存在的机制，并非限于某一种基因。因此，通过用植物表达昆虫dsRNA来抑制植食性昆虫的基因表达的方法可适用于昆虫的多种基因。
本发明的主要优点在于：
(1)以往的RNA干扰方法均是限于对自体基因的抑制，而本发明首次提出可以利用植物作为媒介、通过RNA干扰机制来抑制昆虫的生长。
(2)首次发现GIP是一个在棉铃虫取食含棉酚的棉株时起解毒作用的关键基因，可通过抑制GIP的表达来抑制昆虫的生长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1GIP基因的表达特征
1.GIP基因在棉铃虫体内的表达情况
为了检测GIP基因在棉铃虫体内的表达情况，本发明人采用RT-PCR方法，检测了GIP在不同组织中的表达情况。方法如下：分别从棉铃虫中肠、脂肪体、马氏管、生殖器、脑组织中抽提mRNA，通过常规的RT-PCR法扩增GIP基因，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测。其中，RT-PCR所采用的引物如表1所示。
表1
GIP+ 5’-GTGCTTTGATGAGACTCTTCG-3’ SEQ ID NO：5 GIP- 5’-TACATTTGCTATTTATAATTTGC-3’ SEQ ID NO：6
RT-PCR产物的电泳结果见图3A。图中，1-5依次代表中肠，脂肪体，马氏管，生殖器，脑组织中GIP基因表达情况，以ACTIN(ACT)作为阳性对照。因此可知，GIP基因在棉铃虫的中肠内高表达。
2.不同化合物对GIP表达的影响
本发明人采用RT-PCR方法检测了不同化合物对GIP表达的影响。方法如下：分别用无添加或添加含0.1％的花椒毒素、单宁、反式肉桂酸、棉酚、β-蒎烯、β-石竹烯、或α-蒎烯的人工饲料饲喂长势一致的5日龄棉铃虫1天后，拿出棉铃虫的中肠组织，抽提mRNA，通过常规的RT-PCR法扩增GIP基因，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，RT-PCR所采用的引物为同前面“1”所述。
结果见图3B。图中，1-8依次代表分别用无添加、添加含0.1％的花椒毒素、单宁、反式肉桂酸、棉酚、β-蒎烯、β-石竹烯、α-蒎烯的食物喂食棉铃虫后，其中肠表达GIP基因情况。因此可知，棉酚对GIP的诱导表达具有专一性。
3.不同浓度棉酚对于GIP转录水平的影响
本发明人用含0.1％或0.2％棉酚的人工饲料喂长势一致的5日龄棉铃虫1天后，RT-PCR(方法同上)检测每一幼虫中肠内的GIP转录水平。
结果见图3C-D。因此可见，在棉酚存在下，GIP的表达与棉铃虫的生长密切相关。
实施例2GIP基因的分离
将1μl亚洲棉铃虫(Helicovepa armigera)(约106pfu)cDNA文库(ZAP express)梯度稀释后，用如下的专一引物作PCR，确定PCR的最低工作浓度：
GIP2+：5’-GAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3’(SEQ ID NO：7)；
GIP2-：5’-ATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3’(SEQ ID NO：8)。
将96孔板用70％乙醇浸泡数小时后甩干，紫外灯照射15～30分钟，然后在每孔中加入200～300μl LB(含10mM MgSO4/0.2％麦芽糖)。取适当稀释度的库(一千倍稀释)溶液与400μl XL1-Blue菌液混匀，37℃振荡培养30分钟左右，在每孔中加入4μl混合物。将平板在37℃培养过夜。扩增后，每列8孔各取5μl菌液混匀，共12列做PCR。再取有扩增条带的列的各孔分别做PCR。选择阳性孔再次做下一轮筛选。
经3轮筛选后，将噬菌体铺于LB平皿，挑取单个噬菌斑到500μl SM溶液中，振荡，PCR鉴定，即获得阳性克隆。对筛选到的阳性克隆进行测序，获得全长基因。
实施例3用于构建dsGIP，dsGST1基因的分离
以亚洲棉铃虫(Helicovepa armiggera)cDNA文库(ZAP express)为模板，分别用基因专一引物对：
用于获得GIP基因片段的引物对：
GIPF：5’-GAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3’(SEQ ID NO：7)，和
GIPR：5’-ATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3’(SEQ ID NO：8)；以及
用于获得GST1基因(GenBank登录号EF033109)片段的引物对：
GSTF：5’-GACCTTGGCAGACCTCAG-3’(SEQ ID NO：9)，和
GSTR：5’-CCAGCTCGAACCACTTTT-3’(SEQ ID NO：10)；
进行PCR扩增，分别得到用于构建dsGIP，dsGST1表达载体的GIP和GST1片段。
实施例4表达载体的构建和转化
1.35S::dsGFP，35S::dsGIP，35S::dsGST1表达载体的构建
所需构建的dsRNA载体如图4A中pBIdsRNA所示，包括一个35S启动子，一个正向的基因片段(即Sense)，一个拟南芥RTM基因的内元(即Intron)(约120bp)和一个反向的基因片段(即Antisense)以及NOS的终止子，其是通过用包含Sense-Intron-Antisense的序列取代pBI121载体(如图4A中pBI121所示)上的GUS片段而构建获得。
本发明人首先将拟南芥RTM基因(AT2G43730)的内元(约120bp，)用含有XbaI和NotI的特异引物RTM+和RTM-用高保真酶KOD进行PCR扩增，用XbaI和NotI限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，克隆到pBSK(购自Clontech公司)的多克隆位点XbaI和NotI之间。
用含有NotI和SacI酶切位点的基因特异引物FGFP+和FGFP-；FGIP+和FGIP-；FGST1+和FGST1-用高保真酶KOD，分别以GFP(来源于质粒pCAMBIA 1302(参见www.cambia.org/daisy/bios/585.html)，该基因不存在于棉铃虫中)以及实施例3制备的GIP或GST1为模板，进行PCR扩增，克隆相应的GFP，GIP和GST1片段。再将克隆到的片段用NotI和SacI进行双酶切，分别插入到含有RTM内元的pBSK载体上的克隆位点(NotI/SacI)之间。
同时，用同样的方法用含有SmaI和XbaI酶切位点的基因特异引物RGFP+和RGFP-；RGIP+和RGIP-；RGSL+和RGSL-用高保真酶KOD，分别以GFP以及实施例3制备的GIP或GST1为模板，进行PCR扩增，将获得的GFP，GIP，GST1片段克隆到前述插入了正向GFP，GIP和GST1片段的pBSK的SmaI和XbaI之间。
将构建好的pBSKK/dsGFP，pBSK/dsGIP，pBSK/dsGSL载体分别用SmaI和SacI进行双酶切，同时将pBI121(购自Clonetech公司)用SmaI和SacI进行双酶切，分别将酶切下来的dsGFP、dsGIP、dsGSL片段取代pBI121上的GUS，插入到SmaI和SacI之间，从而获得分别携带相应的目的片段的重组表达载体，分别称为35S::dsGFP，35S::dsGIP，35S::dsGST1表达载体。
前述制备过程中采用的引物如表2。
表2
代号 序列 SEQ ID NO： RTM+ 5’-CCCTCTAGAACGTTGTAAGTCTGATTTTTGAC-3’ 11 RTM- 5’-CCCGCGGCCGCTCTATCTGCTGGGTCCAAATC-3’ 12 FGFP+ 5’-CCCGAGCTCGAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3’ 13 FGFP- 5’-CCCGCGGCCGCATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3’ 14 FGIP+ 5’-CCCCCCGGGGAAGATTTTCTCGATAAGGAAG-3’ 15 FGIP- 5’-CCCTCTAGAATATAAAGCACTGTGCCACTAAG-3’ 16 FGST1+ 5’-CCCGAGCTCCGATTTCAAGGAGGACGG-3’ 17 FGST1- 5’-CCCGCGGCCGCCCATGCCATGTGTAATCCC-3’ 18 RGFP+ 5’-CCCCCCGGGCGATTTCAAGGAGGACGG-3’ 19 RGFP- 5’-CCCTCTAGACCATGCCATGTGTAATCCC-3’ 20 RGIP+ 5’-CCCGAGCTCGACCTTGGCAGACCTCAG-3’ 21 RGIP- 5’-CCCGCGGCCGCCCAGCTCGAACCACTTTT-3’ 22 RGSL+ 5’-CCCCCCGGGGACCTTGGCAGACCTCAG-3’ 23 RGSL- 5’-CCCTCTAGACCAGCTCGAACCACTTTT-3’ 24
2.根癌农杆菌的转化
根癌农杆菌的转化采用冻融法。一个单菌落LBA4404或GV3101(均购自Invitrogen公司)，3ml LB培养基(含25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif和50μg/ml Gen)，28℃，220rpm，培养到OD600＝0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟，4℃，5000g离心5分钟。重悬于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5分钟。重悬于1ml 20mM CaCl2，50μl/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。
实施例5植物转化以及转基因后代的筛选
在本实施例中，以烟草和拟南芥的转基因为例，其它植物的转化也可以此为参照。
a.烟草的转基因
将含目的基因的农杆菌LBA4404过夜培养(28℃培养过夜，至OD600≈2.0)。将无菌烟草叶片切割成约0.1cm2大小，浸泡在农杆菌培养液中5-10分钟。用无菌滤纸吸去多余的农杆菌培养液，将浸泡过的烟草叶片铺在1/2MS固体培养基上，暗培养两天。然后，将叶片移至MS(含1mg/L 6-BA)固体筛选培养基(Kanr，Cefr)，隔10-15天更换新鲜MS，直至叶片伤口处长出小芽，将新长出的小芽移至不含6-BA的MS培养基，隔10-15天更换新鲜MS，直至其长根后，移至土壤中种植。
MS培养基：4.4g/L Murashige and Skoog basal medium(Sigma，Cat.M5519)，蔗糖15g/L，0.8％琼脂粉，MES 0.5g/L，pH 5.7。
b.拟南芥的转基因
拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743)。一个含双元载体的单菌落GV3101，3ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/mlGen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。50ml菌液，250ml LB培养基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小时。4200rpm(2900g)，15分钟。菌体重悬于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株花芽部分在菌液中浸泡5秒钟，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时，然后温室生长至开花结籽。T0代种子在4℃春化2～4d，用20％漂水(白猫公司，上海)处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(含50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1)中生长。
c.棉花的转基因
棉花R15(野生型棉花，Gossypium hirsutum Linn)种子经常规消毒后置于MS0培养基，在黑暗中萌发培养，5-7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15-20分钟，转移到共培养培养基MSB1上，22℃暗培养2d后，将外植体转移到培养基MSB2上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4)，再生抗性试管苗。待再生株长到3-4片真叶时，通过嫁接或移栽方法移入花盆，人工气候室培养。
MS0：1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉，pH 5.8。
MSB1：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2，4-D+2.2g/LGelrite，pH 5.8。
MSB2：MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素。
MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite，pH 5.8。
MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/L Gelrite，pH 5.8；MS盐中KNO3加倍，去除NH4NO3。
实施例6转基因植物的分子生物学鉴定
在本实施例中，选取实施例5获得的T3代纯合株系转基因植物，采用抗生素筛选、Northern杂交对转基因植株进行验证。
用于干扰RNA Northern检测的转膜：
转膜：采用常规方法提取转基因植物的RNA样品，在RNA样品中加入10×电泳加样液，混匀，65℃放置10min，冰上冷却。电泳使用15％TBE-urea PAGE胶，1×TBE电泳缓冲液。上样前预电泳5-10分钟并用电泳缓冲液冲洗泳道，除去上样孔中析出的尿素。每泳道加样量为10-20μg总RNA，电场强度20V/cm，至溴芬兰染料迁移至凝胶的底部时结束。凝胶在1×TBE中平衡10min。RNA转移采用半干电转移系统(Hofer Semi-DryTransfer Units，Amersham，Cat.80-6211-86)。转移条件：40mA(约7-8V)，2-4h，Hybond-N+(Amersham，Cat.RPN303B)尼龙膜。尼龙膜经6×SSC溶液短暂漂洗，紫外交联(120mJ)，夹在两层滤纸之间，80℃烘烤1h，备用。
电泳胶储存液：15％聚丙烯酰胺(30％Acyl/Bis，19∶1，华舜，Cat.W443)，8M尿素，1×TBE；
15％TBE-urea PAGE胶(10mL)：10mL电泳胶储存液，80μL 10％过硫酸铵，5μLTEMED，混匀；
10×TBE：0.9M Tris，0.9M硼酸，20mM EDTA(pH 8.0)(Sigma，Cat.T4415)；
10×电泳加样液：(Ambion，Cat.8546G)。
探针标记：取25ng纯化PCR产物作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-GeneLabeling System(Promega，Cat.U1100)。37℃温浴1h。标记探针在沸水中放置5min，立刻置于冰上，备用。
预杂交和杂交(采用Clontech的ExpressHyb体系)：将尼龙膜放入杂交管中，以6×SSC润湿，保证膜和管壁间没有气泡。倒掉6×SSC，加入5mL杂交液，37℃预杂交60min。预杂交结束后，更换5mL新鲜杂交液，加入探针，混匀，杂交过夜。
洗膜与压片：杂交结束后，倒出杂交液。在室温下，用2×SSC，0.05％SDS，洗膜两次，每次5分钟，然后用0.2×SSC，0.1％SDS，再洗涤两次，每次20分钟。用保鲜膜包裹，胶带固定，压增感屏和X-ray胶片，-70℃，2天。胶片用D-72液显影。
Northern检测表达含GIP，GFP或GST1序列dsRNA的转基因烟草和拟南芥的结果见图4B。图4B中，WT表示野生型植物对照，具有印迹的泳道表示对应的植物中含有与相应的基因对应的dsRNA。
实施例7检测表达GIP基因的dsRNA转基因拟南芥和烟草对棉铃虫的影响
取生长一致的三日龄棉铃虫，分别喂以dsGFP(对照)，dsGIP转基因烟草或拟南芥，4-7天后，称重记录，并解剖取中肠。提取RNA，Northern检测GIP的表达。
RNA提取：
取材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至1.5ml离心管中，加入1mLTrizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃取沉淀。上清中加入200μL三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入500μL异丙醇沉淀RNA。12,000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥，溶于20-50μL H2O(RNase free)。
将RNA用10mM Tris-HCl(pH 7.5)做适当稀释，测定波长在200nm-300nm之间的UV吸收值。RNA浓度＝40μg/mL×A260×稀释倍数。
用于普通Northern的RNA转膜：
在RNA样品中加入5×RNA样品缓冲液和10×RNA(甲醛)电泳加样液，混匀，65℃放置10min，冰上冷却。每泳道加样量为15μg总RNA，电泳使用1.1％变性琼脂糖凝胶，1×MOPS电泳缓冲液，电场强度8V/cm。电泳至溴芬兰染料迁移至凝胶的2/3时结束。用ddH2O漂洗凝胶，并用20×SSC平衡40min。加筑转移平台，以20×SSC为转移缓冲液，利用毛细管法将RNA转移到Hybond-XL(Amersham，Cat.RPN303S)尼龙膜上(约18h)。转移结束后，用铅笔在膜上标记出加样孔的位置，并剪去膜的左上角作为标记。膜经6×SSC溶液短暂漂洗后，紫外交联(120mJ)，夹在两层滤纸之间，80℃烘烤2h，密封保存备用。
杂交过程与前述干扰RNA的Northern检测一致。
结果显示，进食dsGIP拟南芥AtdsGIP-3(即：通过实施例6中图4B监测到的dsGIP转基因拟南芥中的第3个株系)或烟草NtdsGIP-2(即：通过实施例6中图4B监测到的dsGIP转基因烟草中的第2个株系)的棉铃虫相对于进食dsGFP拟南芥AtdsGFP(即：通过实施例6中图4B监测到的dsGFP转基因拟南芥中的第5个株系)或烟草NtdsGFP(即：通过实施例6中图4B监测到的dsGFP转基因烟草中的第2个株系)的棉铃虫(对照)，其中肠内GIP的转录被抑制，并且生长缓慢，详见图5和图6。
图5A为Northern检测三日龄进食AtdsGIP-3拟南芥两天后的棉铃虫中肠内含GIP序列的小RNA，泳道1和泳道2分别为进食AtdsGFP和AtdsGIP-3的棉铃虫。可见，进食后棉铃虫中肠内含有大量的GIP小RNA分子。
图5B为Northern检测三日龄棉铃虫进食不同的表达dsRNA的转基因植物4天后，中肠内GIP基因的转录变化。其中，在进食拟南芥的棉铃虫的GIP基因的RNA(图中称为GIP)检测结果中，泳道1、2、3、4、5分别代表进食AtdsGFP和进食图4B中所指的dsGIP转基因拟南芥中的第2，3，4，5个株系的棉铃虫的中肠内GIP RNA检测结果，图中，RNA代表对照(即18sRNA)。在进食烟草的棉铃虫的GIP检测结果中，泳道1、2、3分别代表进食野生型烟草和NtdsGFP及图4B中监测到的dsGIP转基因烟草中的第2个株系的棉铃虫的中肠内GIP RNA检测结果。可见，进食含dsGIP的植物后，棉铃虫肠内GIP的转录发生大大下降。
图5C为三日龄棉铃虫分别喂以AtdsGFP，AtdsGIP-3四天后的平均体重增加(uper)以及Northern检测中肠内GIP基因的转录变化，其中，测试I、II、III分别代表三次独立的饲喂实验。可见，在喂食AtdsGIP-3后，体重的增加明显慢于喂食AtdsGFP的情况。并且，进食AtdsGIP-3后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食AtdsGFP的情况。
图5D为三日龄棉铃虫分别喂以NtdsGFP，NtdsGIP-2四天后的平均体重增加(uper)以及Northern检测中肠内GIP基因的转录变化，其中，测试I、II、III分别代表三次独立的饲喂实验。可见，在喂食NtdsGIP-2后，体重的增加明显慢于喂食NtdsGFP的情况。并且，进食NtdsGIP-2后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食NtdsGFP的情况。
图5E为免疫组化分析进食NtdsGFP(a-c)，NtdsGIP-2(d-f)烟草四天后，中肠内GIP蛋白的分布情况。其中，a、b、c或d、e、f分别代表不同个体的检测结果。可见，进食含dsGIP的烟草后的棉铃虫其中肠内的GIP蛋白分布较少。
图5F为Northern分析三日龄棉铃虫进食NtdsGFP(1)和NtdsGIP-2(2)烟草后第1，2，4天时，中肠内GIP的转录水平。可见，随着时间的延长，进食NtdsGIP-2的棉铃虫的中肠内GIP的转录水平越来越低；而进食NtdsGFP的棉铃虫的中肠内GIP的转录水平变化不大。
图5G为三日龄棉铃虫进食NtdsGFP(黑色柱体)和NtdsGIP-2(白色柱体)烟草后第2，4天时的平均体重增长。可见，进食NtdsGIP-2后的棉铃虫的体重增长明显低于进食NtdsGFP的情况。
图5H为三日龄棉铃虫进食AtdsGFP(黑色柱体)和AtdsGIP-3(白色柱体)拟南芥4天和7天时的体重增加(uper)和Northern分析其GIP的转录水平(down)。可见，进食AtdsGIP-3后的棉铃虫的体重增长明显低于进食AtdsGFP的情况。并且，进食AtdsGIP-3后，棉铃虫肠内GIP的转录明显低于喂食AtdsGFP的情况。
实施例8检测表达GIP基因的dsRNA转基因棉花对棉铃虫的影响
取生长一致的三日龄棉铃虫分别喂以R15(对照，野生型棉花，Gossypium hirsutumLinn)，以及转基因棉花ds-2，-7，-9，-10(为图4B中Northern检测表达高的四个株系)四天后，称重记录，结果见图6。
图6A显示了转基因棉花中的dsGIP RNA的Northern检测。R15：野生型棉花(Gossypium hirsutum Linn)，1-10：不同的转基因棉花。
图6B显示了三日龄生长一致的棉铃虫在进食R15和不同的dsGIP转基因棉花4天后，体重的增加量。纵坐标：体重的净增量，单位：mg，经T-test检验，P＜0.01。
从图6的结果，可见棉铃虫进食了表达GIP基因的dsRNA的转基因棉花后，生长受到抑制。
实施例9检测表达GST1基因的dsRNA植物对棉铃虫的影响
取生长一致的三日龄棉铃虫分别喂以dsGFP(对照)，dsGST1转基因拟南芥四天后，称重记录，并解剖取中肠。分成两部分，一部分提取RNA，Northern检测GST1的表达。另一部分提取总蛋白检测GST酶活。
表达含GST1基因的dsRNA转基因拟南芥dsGST1-5(即：通过实施例6中图4B监测到的dsGST1转基因拟南芥中的第5个株系)对棉铃虫的影响见图7。
图7A为Norther检测五日龄生长一致的棉铃虫进食含1mg/g棉酚的人工饲料1天后，中肠内GST1基因的表达变化。其中，泳道1和2分别为进食无添加或添加1mg/g棉酚的人工饲料后的棉铃虫。可见，棉酚对棉铃虫中肠内GST1基因的表达没有显著的影响。
图7B为Northern检测三日龄生长一致的棉铃虫进食AtdsGFP(泳道1)和dsGST1-5(泳道2)的转基因拟南芥4天后，中肠内GST1基因的表达变化。其中测试I，II分别表示两次独立的饲喂实验。可见，GST1基因的表达也受到GST1相应的干扰RNA的干扰。因此，通过植物介导的RNAi在昆虫中是一种普遍存在的机制。
蛋白提取：
棉铃虫中肠总蛋白的提取：将中肠组织用液氮充分研磨后，加入适量预冷PBS，充分混匀，用8层纱布过滤后，离心(10,000rpm，10min)。取上清，用Bradford比色法测定蛋白浓度后，进行酶活分析。
GST酶活测定：
按南京建成生物工程研究所提供的谷胱甘肽-S转移酶测定试剂盒说明书操作。
测定原理：
GST具有催化还原型谷胱甘肽(GSH)与1氯-2，4-二硝基苯(CDNB底物)结合的能力，在一定反应时间内，其活性高低与反应前后底物浓度的变化呈线性关系。
对棉铃虫中肠内的GST酶活测定结果见图7C。可见，在服食了dsGST1转基因拟南芥后，棉铃虫中肠内的GST酶活发生显著下降。
实施例10.大片段dsRNA也能有效的使目的基因沉默
按照实施例5提供的拟南芥的转基因方法及其转基因后代的筛选方法，将dsGIP转入到dcl2、dcl3、dcl4三基因突变的拟南芥突变体植株(dcl2、dcl3、dcl4三突变体获自Z Xie，Center for Gene Research and Biotechnology，Department of Botany andPlant Pathology，Oregon State University，Corvallis，Oregon 97331，USA.)中，获得转基因拟南芥。从中选取4个转基因系，dcl AtdsGIP-11到dcl AtdsGIP-14(图8中简称dcl 11-14)，作为对照，选取实施例6中获得的两个转基因系，AtdsGIP-7和AtdsGIP-8(图8中简称WT 7-8)作为对照，按照实施例7提供的方法，提取RNA，进行Northern检测；同时取生长一致的三日龄棉铃虫，分别喂以dcl AtdsGIP(11-14)和AtdsGIP(7，8)(作对照)3天后，解剖取中肠。同样提取RNA，Northern检测GIP的表达。结果见图8。其中图8a为Northern检测转基因拟南芥中大片段dsGIP；图8b为Northern检测转基因拟南芥中小分子dsGIP；图8c为三日龄生长一致的棉铃虫幼虫在进食不同的转基因植物3天后，其中肠内的GIP转录本。RNA杂交信号用富士磷屏定量，并以ACT为内标，计算相对含量(GIP/ACT)。其中进食非转基因植物的棉铃虫其中肠内GIP的相对含量定义为1。WT：野生型拟南芥(Col0)背景，dcl：dcl2dcl3dcl4三突变体背景。CK：非转基因植物，7-14代表不同的转基因植株。
图8的结果显示在dcl2dcl3dcl4三突变体背景下，大片段dsRNA比野生型背景下的转基因植物有明显积累。其中，AtdsGIP-13转基因植物中检测到了大量的大片段dsRNA，而小分子dsRNA则含量非常低。当棉铃虫进食这类转基因植物后，其中肠内的GIP转录也有明显的抑制，而且抑制效果更加明显。这说明，在植物介导的昆虫基因RNA干扰中，植物体内产生的大片段dsRNA也参与了这一过程，而且更加有效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
相关知识
中国农科院基因所/湖北大学团队提出一种提高质体介导RNAi抗虫效率的新策略
张江教授团队在质体介导RNAi抗虫领域再获突破
植物抗病抗虫品种的育种研究.pptx
RNAi技术25周年：昆虫科学的贡献与挑战
“基因农药”不仅能抗虫，还能让花朵变色
害虫综合治理中抗虫性植物的应用
植物抗虫基因工程课件.ppt
植物抗虫基因工程研究进展
″基因农药″或将上市 能抗虫还能让花变色
基因工程对植物遗传的改良
网址: 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法.pdf https://m.huajiangbk.com/newsview674175.html
| 上一篇: 普通白菜遗传转化研究进展.pdf |
下一篇: 中国农科院从棉花中发现新型高效杀 |
