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真菌致病基因的标记.docx

花匠小妙招
2024-11-23 16:12

真菌致病基因的标记

真菌感染植物是一个复杂的过程。通过分子遗传突变技术从真菌中分离出许多疾病基因。其中，限制酶诱导移植技术是最常用的方法之一，不仅可以了解真菌的过程，而且可以为控制分子水平的疾病提供有用的线索。不同的遗传因素导致不同的侵蚀过程。一些真菌依靠释放表皮和/或控制寄生虫。有些形成了一种特殊的结构，例如通过表皮的移植。一些人还依靠外部或内部的接触和化学习剂。入侵后的真菌在不同的营养方式下相互参与，整个入侵过程结束。据报道，在真菌中发现了79个疾病基因，这些基因可以根据不同的功能分为几个部分。1分子自身结构基因附着胞是真菌的重要侵染结构.环境和遗传因素决定附着胞的产生.附着胞内膨压很高,受膨压作用,附着胞表面伸出侵染钉穿透寄主表皮.致病型灰梨孢菌(Magnaporthegrisea)中,附着胞含浓度很高的甘油,可达到摩尔级,同时壁上的黑色素(DHN)阻止胞内物质外流维持附着胞的高膨压.反之,缺乏黑色素的附着胞不能形成膨压,也就不具备侵染能力.葫芦刺盘孢菌(Colletotrichumlagenarium)、豆刺盘孢菌(Clindemuthianum)和禾生刺盘孢菌(Cgraminicola)侵入寄主也需要黑色素.已发现灰梨孢菌和葫芦刺盘孢菌中至少3个结构基因与黑色素合成有关.另外,一些基因控制着附着胞的发育.譬如在灰梨孢菌中,mpg1基因所编码的一种疏水蛋白是形成附着胞所必须的,抑制mpg1基因表达将导致灰梨孢菌致病性降低,产孢能力(conidiation)也下降100倍左右.通过互补分析,分离到3个基因NPR1,NPR2,NPR3,它们编码的产物调节着mpg1的转录.Lau和Hamer发现NPR1和NPR2基因与梨孢菌的氮代谢有关.从灰梨孢菌分生孢子中克隆出一个ACR1基因,该基因序列与转录因子有部分同源,ACR1基因突变后导致无法产生正常的分生孢子并影响附着胞形成.同样,灰梨孢菌编码膜蛋白的基因pth11突变后,梨孢菌无法正确识别寄主叶面,影响了附着胞产生.通过转座子标记技术,Villalba等从灰梨孢菌中克隆出ORP1基因,此基因与附着胞形成无关,但是突变后灰孢菌致病性也降低,目前还不清楚该基因的作用.最近,Balhadere等通过限制酶介导的插入技术(REMI)从灰梨孢菌中发现了4个基因与分生孢子和附着胞形成有关.但是这些基因的结构特征还不清楚.2果胶酸水解酶基因水解酶是真菌致病的重要酶,大部分是多基因家族或没有同源关系的基因编码的多肽.由于是多基因编码,一个基因突变后可能并不影响病原菌的致病力.一方面,活化的水解酶常伴随产生大量的寡聚糖,这些寡聚糖可以激发植物的防御反应;另一方面,被水解下来的植物胞壁蛋白也可以激发自身的防御反应,所以水解酶的作用很复杂.Enkerli等发现裸异木霉(Trichodermareesei)编码木聚酶Ⅱ的基因突变后,木聚酶Ⅱ活性下降了1000倍,但是木霉仍能感染番茄和烟草.角质酶也属于多基因家族,在需要直接穿透寄主表皮的真菌中是重要的致病因子.Rogers等和Stahl等分别对腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)研究发现,当角质酶合成受抑制后,腐皮镰孢菌失去了致病能力.果胶酸水解酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶是真菌致病的重要酶.植物胞壁含有大量的果胶和中间层,真菌成功侵入寄主需要克服这些障碍.譬如盘长孢刺盘孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)中编码果胶酸水解酶的pelB基因突变后,对鳄梨的致病性就会降低.但是也有例外.Bowen等研究发现围小丛壳菌(Glomerellacingulata)果胶水解酶基因plnA突变后不影响致病能力.Rogers等研究腐皮镰孢菌发现,编码果胶酸水解酶的基因pelA和pelD同时受到抑制时,致病力才会降低,1个基因受到抑制不会影响致病力.编码腐皮镰孢菌果胶酸水解酶的基因有4个,现在发现2个和致病性有关.Rogers等提出一个腐皮镰孢菌致病的模型:当镰孢菌接触到寄主表面,组成型pelB和pelC基因开始转录,然后翻译产物果胶诱导pelA基因表达,pelA产物协助镰孢菌侵入寄主,最后pelD基因在寄主体内表达.Shieh等研究黄曲霉菌发现,当内源多聚半乳糖醛酸酶基因pecA表达时,棉铃上病斑很大.同样,灰葡萄菌(Botrytiscinerea)侵染番茄和苹果的叶和果实也存在类似情况.有些真菌的内源多聚半乳糖醛酸酶是由多基因控制,抑制一个基因并不影响致病性.Gao等发现栗疫霉菌(Cryphonectriaparasitica)内源多聚半乳糖醛酸酶的主效基因enpg-1突变后致病性并未改变.Isshiki等发现侵染柑橘果实的链格孢菌(Alternariacitri)内源多聚半乳糖醛酸酶基因突变后致病力减弱,而侵染柑橘的另一链格孢菌Alternariaalternata多聚半乳糖醛酸酶基因却与致病力无关.他分析认为不同病菌有不同的侵染方式,侵染方式决定了是否需要这种酶参与侵染.致病力也受真菌生理活动的影响.Tonukari等对玉米旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)代谢物阻抑基因的调节因子研究发现:当编码调节因子的基因ccsnf1突变后,旋孢腔菌对玉米的致病力减弱.同时发现ccsnf1基因至少影响10个胞壁降解酶基因的转录.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中ccsnf1同源基因SNF1的作用与ccsnf1不同,该基因调节许多代谢活动,诸如糖原、甾醇和脂肪酸合成以及脂肪酸β-氧化,通过不同的生理活动控制酵母的致病力.Sweigard等在灰梨孢菌中克隆出pth1基因,该基因编码葡萄糖阻抑调节因子,通过调节因子控制梨孢菌的致病力.这和酿酒酵母中的GRR1基因的功能很相似.3有关氰化物、氰化物和硫氰酸类的致病性研究寄主产生许多次生代谢物抵抗真菌的侵染,包括组成型代谢物和诱导产生的植物抗毒素.真菌通过避开、降解或改变生理活动克服这些阻碍,以便顺利在寄主体内定植.皂角苷和碱性糖苷属于组成型寄主防御物质.Bowyer等发现引起禾谷类全蚀病的禾顶囊壳菌(Gaeumannomycesgraminis)产生燕麦素酶分解燕麦根表皮细胞内的皂角苷燕麦素A-1,编码该酶的基因突变后禾顶囊壳菌也就失去了对燕麦的致病力.由于小麦不产生燕麦素,所以无论有无该酶,禾顶囊壳菌均可以致病.也有人不认为燕麦素酶是致病因子.Hernandez等研究番茄壳针孢菌(Septorialycopersici)的番茄素酶基因发现,该基因序列与燕麦素酶基因有很高的同源性,但是抑制该基因表达并不影响壳针孢菌对番茄的致病性.同样,Morrissey等在研究燕麦壳多孢菌(Stagonosporaavenae)发现,抑制β-葡糖苷酶,一个专门分解2、6-脱葡糖燕麦素苷的酶,并未减少叶片上病害的严重度,而是发现另有两个酶分解寄主的组成型防御物质.生氰糖苷类和β-硫代葡糖苷类也是寄主分泌的组成型防御物质.这两类代谢产物多存在于寄主受伤部位,诸如有毒氰化物、腈类和硫氰酸类.也有人发现它们的防御作用并不明显,许多含高浓度生氰葡糖苷和硫代葡糖苷的寄主照样对病菌很敏感.降解氰化物的酶在致病中的作用还不清楚.Wang等对离体高粱细胞研究发现胶尾孢菌(Gloeocercosporasorghi)氰化物水解酶被抑制后该菌对氰化物的敏感性增强,但是在栽培的高粱上却并不如此,抑制酶活性后并不影响致病力.真菌含有降解植物抗毒素的酶,其中一些酶的部分基因已被克隆.Wasmann和VanEtten研究丛赤壳菌(Nectria)发现6个豌豆素脱甲基酶PDA1-6基因中,PDA1基因突变引起病害严重度降低,另外几个基因的作用还不清楚.该酶可以降解植物抗毒素-豌豆素.PDA1基因大小是1.6Mb.如果丢失该基因的染色体,丛赤壳菌的致病力将大为降低.最近,Han等研究PDA1发现序列周围有3个潜在的致病基因簇PEP1、PEP2和PEP5.每个基因簇称作一个“致病岛”(pathogenicityisland),这与细菌中很相似.当3个基因被构建到其它菌株,就会增强工程菌的致病性.数据库中查不到与PEP1和PEP2相匹配的序列;PEP5与多药物因子转移蛋白基因序列很相似.另外,Covert等也在丛赤壳菌中鉴定出4个基因MAK1-4负责编码降解鹰嘴豆植物抗毒素的酶.抑制MAK1基因表达,丛赤壳菌致病性就会减弱.当MAK1构建到其它菌株后也会增强该菌的致病力.与PDA1基因不同的是,丢失MAK1染色体的菌株与MAK1基因突变的菌株比较,致病力差异不大.转运蛋白对真菌致病性有重要影响.有些转运蛋白基因突变后,真菌的代谢过程发生改变造成无法泵出寄主毒素.Urban等发现灰梨孢菌ATP盒式(ATP-bindingcassette,ABC)转运蛋白基因ABC1突变后,梨孢菌致病性就会丧失.有毒化合物和植物抗毒素可以诱导ABC1基因表达.最近,Schoonbeek等发现灰葡萄孢菌ABC转运蛋白基因BcatrB突变后增加了对葡萄藤中的植物抗毒素—白藜芦醇的敏感性.丛赤壳菌PEP5基因和多药物因子转移蛋白基因序列同源,而且该基因紧邻豌豆素脱甲基酶基因表明它可能在泵出豌豆素中发挥作用.灰梨孢菌pth9非致病突变主要是缺乏海藻糖酶,因为该酶调节细胞内海藻糖的浓度,抵抗寄主体内胁迫环境,促进孢子萌发.灰梨孢菌pth2突变体缺乏肉碱乙酰转移酶,该酶转移脂肪酸乙酰CoA到线粒体.营养状况也影响着真菌侵染.基因突变后,真菌变成营养缺陷型从而失去致病能力.Sweigard等发现灰梨孢菌非致病突变是因为咪唑甘油磷酸脱氢酶基因pth3上插入了一段DNA,造成组氨酸无法合成.通过限制酶介导的插入技术,在灰梨胞菌中发现了非致病甲硫氨酸营养缺陷型.Kahmann和Basse发现玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)营养缺陷型和丧失致病性有直接关系.尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)精氨酸营养缺陷型也没有致病力.Bailey发现小禾壳多孢菌(Snodonum)中鸟氨酸脱羧酶基因突变导致产生非致病小种.也有些真菌营养缺陷型可以诱导致病基因表达.这些基因除致病外可能还有其它的作用.最近,Segers等克隆出黄枝孢菌(Cladosporiumfulvum)2个饥饿诱导基因—乙醇氧化酶基因Aox1和乙醛脱氢酶基因Aldh1.当这两个基因突变后,Aox1-小种产孢量减少,生长缓慢;但是,Aldh1-小种不同,产孢量和生长未发生变化.乙醇氧化酶的作用还不清楚.据认为负责分解寄主发酵产生的乙醇以保持氧化还原平衡.4toxf基因真菌产生毒素使寄主细胞的正常生理功能失调或直接杀死寄主细胞.根据寄主范围,真菌毒素分为非专化性毒素(nonspecifictoxins)和寄主专化性毒素(host-specifictoxins).腔菌纲真菌大多数都产生寄主专化性毒素.相比较而言,真菌毒素比较容易测定.毒素基因常常成簇存在,但并非所有成簇的基因都与毒素有关,并且有些毒素基因发生改变,真菌仍能致病.譬如,玉米旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)合成HC-毒素基因.HC-毒素合成涉及到多个基因,这些基因成簇存在,大小是600kb,簇上至少有6个基因的重复单位.与HC-毒素产生有关的基因主要包括:HTS1基因,编码一种多肽合成酶,该酶负责将4个氨基酸残基装配成多肽四聚体构成HC-毒素,而且装配过程不需要核糖体;TOXC毒素基因,负责编码脂肪酸合成酶β-亚基;TOXF基因,编码支链氨基酸转氨酶,该酶是合成毒素和致病所必须的;TOXG基因,编码丙氨酸消旋酶蛋白,该蛋白为HC-毒素提供丙氨酸D-型异构体.TOXG基因所有拷贝突变后,组成HC-毒素的氨基酸将改变,但突变体仍可致病;TOXEp基因,属于调节基因,调控TOXA、TOXC和TOXD表达;TOXA基因,编码HC-毒素分泌蛋白;TOXD的功能还不清楚.致病型链格孢菌(Alternariaalternata)分泌寄主专化性毒素.Johnson等在日本梨和苹果上发现AK-毒素和AM-毒素是链格孢菌分泌的致病因子.已经克隆出合成AK-毒素的2个基因AKT1和AKT2.合成链格孢菌毒素的基因属于一个基因组.最近,Tanaka和Tsuge对AKT-1和AKT-2的侧翼测序后发现了另2个基因AKTR-1和AKT3-1,推测这2个基因也和毒素合成有关.通过靶标突变阻抑2个基因表达将产生非致病性链格孢菌小种.燕麦草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)寄主专化性毒素ToxA或Ptr分子量很小,只有13kD,该菌在感病小麦品种上引起黄褐色的病斑.体外重组发现Ptr基因在大肠杆菌中也产生寄主专化性毒素.通过重组将ToxA基因导入ToxA-真菌中,转化的真菌就会对小麦有致病性.最近,在燕麦草核腔菌中新克隆出一个编码寄主专化性毒素的基因ToxB(6.6kDa),该基因在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中异源表达也表现毒性.单孢菌素(trichothecines)属非专化性毒素.赤霉菌和露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)可以分泌这种毒素.Tri5基因是控制单孢菌素合成的第一步,阻断该基因表达将导致虱状赤霉(Gpulicaris)在欧洲防风上致病力下降.在玉蜀黍赤霉(Gzeae)上也造成同样的结果.缺乏单孢菌素的禾谷类镰孢菌对玉米的致病力下降.Brown等从禾谷类镰孢菌和拟分枝孢镰孢菌中克隆出11个与单孢菌素合成有关的基因,其中10个基因成簇存在.有几个已经确定在单孢菌素合成中的作用,包括编码Cys2His2锌指结构蛋白的调节基因.5g蛋白亚基基因和map激酶基因的基因文化真菌依靠信号级联放大对环境变化做出反应并调整基因表达.侵染过程中涉及的信号基因主要包括异三聚体G蛋白基因、促细胞分裂活化蛋白激酶(MAP)基因以及依赖于cAMP蛋白激酶基因.阻断信号基因表达将导致真菌致病性丧失或减弱,另一个影响是侵入后导致多营养效应(pleiotrophiceffects).多营养效应使我们很难决定致病性丧失是真菌的那些生理变化引起的.信号转导基因属于不同的家族.从灰梨孢菌克隆出3个G蛋白α亚基基因和3个MAP激酶基因:G蛋白α亚基基因中只有magB和致病性有关;MAP激酶的pmk1基因真菌突变体和mps1突变体不产生附着胞,也就没有致病性;Hog1基因与pmk1和mps1不同,Hog1真菌突变体对渗透压很敏感但仍产生附着胞并有致病性.虽然信号转导基因的氨基酸组成高度保守,但是不同真菌的转导途径不同,不同途径之间的关系也不一样,所以,同一基因在不同真菌突变后的效果是变化的.灰梨孢菌PMK1突变体仍产生正常的菌丝和分生孢子,但影响了附着胞形成,从水稻叶片伤口接种也不致病.CMK1是葫芦刺盘孢菌的致病基因,序列和PMK1基因同源.Takano等发现CMK1-刺盘孢菌从伤口接种后致病性减弱,附着胞形成也受到影响,产孢能力下降,孢子萌发减少,附着胞褐化程度减弱.异旋孢腔菌CHK1基因与同源基因PMK1作用不同,PMK1-不影响生殖器官的接合(mating),而CHK1-的异旋孢腔菌不能受精,并且致病性也降低.真菌的生殖过程也受信号传导影响.担子菌诸如玉蜀黍黑粉菌(Umaydis)和大麦坚黑粉菌(Uhordei)在2个菌种接合后的双核阶段也可以致病.Herrera等发现黑粉菌中控制自宗配合和异宗配合的a、b两个位点也间接控制着致病性.在单核的玉蜀黍黑粉菌中,bE1和bE2基因控制着致病性.这2个基因在玉蜀黍黑粉菌生活史循环中也起重要作用.所以,还不能将它们归于致病基因.6基因型mdv1和mcd3在真菌中还发现了一些致病基因,这些基因在数据库中找不到它的同源序列或者在寄主-病原菌互作中有独特的功能.通过紫外线诱变,从玉兰刺盘孢菌(Cmagna)中发现path-1致病基因,抑制该基因表达致病性丧失,但是该菌可以充当内寄生菌在寄主体内活动,保护寄主免受其它真菌的侵染.这从一个侧面说明致病菌是从内寄生菌发展而来.Redman等对14400个真菌侵染的寄主细胞进行插入突变扫描分析,发现了176个细胞表现非致病内寄生菌表型,可以提供寄主不同程度的耐病性.从豆刺盘孢菌中发现CLTA1基因编码蛋白含有锌指结构Zn[n]22[n]Cys6可以调控豆刺盘孢菌活体营养生长和死体营养生长之间的互换,所以属于调节基因.禾生刺盘孢菌(Cgraminicola)非致病突变体在信号肽酶复合体亚基基因的启动子区含有插入序列.该酶主要负责分泌信号蛋白,由于插入序列的影响,蛋白分泌减少.而分泌蛋白与寄主-病原菌互作有直接关系.CgDN3是另一类新的致病基因.在盘长孢刺盘孢菌(Cgloeosporioides)中编码54个氨基酸残基的分泌蛋白.该基因的突变种不能从叶面直接侵入热带豆科牧草,但从伤口仍可以入侵.通过显微镜发现接种点有大量的枯死细胞,类似于寄主过敏性反应.表明CgDN3基因是避开寄主表达过敏性反应所必须的基因.在黄枝孢菌中发现2个分泌蛋白ECP1和ECP2.这2种蛋白由致病基因编码.通过番茄单显性位点cf-ECP2发现ecp2基因编码的是无毒蛋白.在栽培6周的番茄苗上,任何一个基因的突变种接种将导致致病性降低.同时,用缺失ecp2基因的突变种接种2周龄的番茄不表现症状.7致病基因的研究通过突变技术,目前已发现了79个真菌致病基因,大部分序列已录入到数据库.通过查询数据库,79个基因中有60个属于新序列,其中在灰梨孢菌中就发现了16个.按照致病基因作用方式的不同,79个基因划分成几大类,包括侵染结构基因、细胞壁降解基因、寄主内环境应答基因、毒素基因、信号级联基因和其它一些基因.其中从子囊菌中发现了许多致病基因.从担子菌的玉蜀黍黑粉菌中发现了许多与信号转导有关的致病基因.致病基因鉴定技术也很重要.随机插入突变比靶标突变更容易获得致病基因.当然,随机突变技术也存在一些问题,诸如非标记背景突变、多插入位点和插入点不具专一性等.现在,利用根癌农