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专家共识

花匠小妙招
2024-11-24 02:38

2024-03-21 16:04 点击次数：578 关键词：宏基因组；mNGS；测序；质控品

该共识由中国药师协会、中华医学会细菌感染与耐药防治分会、国家卫生健康委临床抗微生物药物敏感性折点研究和标准制定专家委员会共同发起制定。在临床检验、感染、危重症及体外诊断等领域的专家就mNGS-LDT的流程搭建、性能确认、质量控制、报告审核等方面形成共识并提出规范要求和建议。是国内首部针对病原宏基因组高通量测序（mNGS）在LDT规范化应用的专家共识。

全流程的性能确认

确认 mNGS 湿实验和干实验全流程对病原体的检测能力是否能够达到临床预期用途。在全流程性能确认中至少应包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、分枝杆菌、丝状真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA病毒、寄生虫，同时应关注胞内菌和难破壁的病原微生物。

性能确认参数

可参考《分子诊断检验程序性能验证指南》、《临床微生物培养、鉴定和药敏检测系统的性能验证》、《病原宏基因组高通量测序性能确认方案》等，建议实验室 mNGS 检测系统应对方法符合率、交叉反应、精密度、准确度、检出限、抗干扰能力（如针对高人源标本）、稳定性等性能参数进行确认。

样品盘的制备

样品盘要包含模拟参考品和已知病原检测结果的真实临床标本。样品盘的设置应严格遵循临
床预期用途所涉及的标本类型，所含微生物应有代表性，尽可能覆盖预期用途中的病原体。标准微生物菌株可以选用ATCC或CMCC菌株等。应根据不同标本类型来合理地设置模拟参考品中的人源细胞浓度（如支气管肺泡灌洗液的人源细胞浓度中位数为105cells/ml）。模拟参考品中应至少包含革兰阳性菌、革兰阴性菌、丝状真菌、酵母、DNA 病毒、RNA病毒、寄生虫共7类病原微生物。

1、方法符合率

使用已在国家药品监督管理局备案并批准上市的商品化实时荧光定量 PCR 试剂盒、数字 PCR 试剂盒或临床金标准（微生物培养鉴定、病理染色等）作为参比方法，必要时可使用一代测序作为参比。

2、交叉反应

选取同属内近源物种，将其分别按照一定浓度比例进行混合测序，统计近源物种的检出情况、读长比例、相对丰度比例与预期是否一致。

3、精密度

1.批内精密度：将上述参考品在同一时间内用相同批次试剂完成 3个全流程重复，分析批次内结果重复性。
2.批间精密度：用不同批次的试剂分别将上述参考品在 3 个工作日内完成各 3 个全流程重复，分析批次间重复性。
3.可接受标准：对阳性标本，分析结果是指通过生信流程得到的检出病原中包括该参考品中的病原体，则记为正确结果，否则为错误结果。结果一致的实验数占全部实验数比例高于95%，判断为可接受。

4、准确度

采用参考品（模拟参考品）和真实临床标本进行比对。在真实临床标本选择上，应综合病原体分离培养、患者的影像学检查结果、基于宿主反应的检测结果以及靶向治疗后患者的临床表现等综合评价。
1.样本选择：全流程检测不少于 20例标本，包括6例阳性参考品（每例模拟混合参考品包含不少于 4 种微生物），14 例临床标本（不少于 10 例培养阳性）。分析检测结果与已知参考品的内含微生物以及临床综合判断结果是否一致，对于结果不一致的使用qPCR 或者送至另一稳定运行的mNGS实验室进行差异检验。
2.可接受标准：20例标本中物种准确性≥90%，则验证通过。对于临床标本，金标准方法和结合临床信息综合判定的病原体在 mNGS 检测结果列表之中可判定为符合。

5、检出限

mNGS的检出限受宿主细胞浓度、核酸提取效率、病原体种类等多种因素影响，建议以待测标本类型中宿主细胞的中位数浓度对病原体检出限进行评估，以95%的重复均能检测到某一病原体的最低浓度为检出限。
1.浓度选择：使用阳性参考品梯度稀释至拟定的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度标本进行 20 次重复测定（如测定 5 d，每天测定 4 份标本）。可根据情况选用稀释液或阴性标本，该稀释液不得含有被验证的目标病原体。
2.判断标准：如果是 5 次重复检测，必须全部检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少19次（95%检出率）靶核酸。

6、稳定性

1.实验过程：将投入5~10倍LoD病原体的临床模拟标本，在4 ℃、-20 ℃冰箱分别保存1、4、7 d，在-80 ℃冰箱分别冻融 1 和 2 次，评估对检测结果的影响。
2.可接受标准：所有重复均检出目标病原体。

7、抗干扰性

在投入 3~5 倍 LoD 病原体的临床模拟标本中分别额外加入更高浓度（比如 106cell/ml、107cell/ml）的宿主细胞，每份标本重复 2~3 次，以弱阳性参考品无法检出时的内参 RPM值作为阈值。当进行临床报告解读时，若内参RPM低于阈值，需警惕假阴性。

为确保mNGS检测报告的质量，需规范分析前，分析中，分析后三个阶段的质量控制。建议每次测序需要包括阴性和阳性质控品。
质控品作为患者标本的类似物或替代品，完全按照真实标本的检测流程进行操作。不建议用纯水或磷酸盐缓冲液等不含人源细胞/核酸的标本作为阴性对照，阳性质控品可以根据分析性能确认的数据，在人源细胞基质（可与阴性对照标本浓度保持一致）中投入 3~5倍 LoD（弱阳性）的不同类型的灭活微生物来制备，不建议使用质粒作为阳性质控品。

菁良病原分子检测质控品

灭活菌液质控品