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百合无症病毒RT

花匠小妙招
2024-11-24 18:13

【摘要】： 百合无症病毒(LSV)是全世界范围内为害百合的主要病毒病原,LSV经常与CMV、LMoV复合侵染导致百合叶片严重花叶和整株矮化,影响了百合的产量和商业价值,成为限制百合出口和切花出口的重要原因之一。目前,有关百合无症病毒病的快速检测在国内尚未见报道,因此对其进行研究,以及建立一套快速、准确的百合无症病毒检测技术,对搞清百合无症病毒病害的组培脱毒、有效防治、种苗检疫以及增加出口创汇将具有重要的现实意义。本研究包括以下主要内容:运用血清学方法对LSV在我省百合作物上的侵染情况进行检测,了解其发生和复合侵染情况;通过电镜观察LSV 的粒子形态,以及内含体的有无及形态,为LSV的诊断提供依据;植物总RNA提取方法研究及LSV RT-PCR 优化检测体系的建立。 1. ELISA和电镜检测结果表明,我省百合主要受黄瓜花叶病毒(CMV-Li)和百合无症病毒(LSV)的侵染,并且两种病毒存在复合侵染现象。CMV-Li和LSV侵染率分别为40%和80%,复合侵染率为40%。对DAS-ELISA、I-ELISA 和DIBA-ELISA灵敏度比较试验结果表明,DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是I-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4 倍。ELISA田间结果检测结果表明,LSV的检出率是80.95%;百合不同部位带毒量测定结果表明,百合叶片的带毒量明显高于花和鳞茎。 2. 对经血清学检测带有LSV的百合病汁液和组织切片电镜观察发现,有短线状病毒粒子(593.29~639.97×12.15~14.12nm),确定为LSV,但没有发现内含体。 3. 以百合叶片和鳞茎为材料,对百合总RNA 提取方法进行了比较研究,结果表明Trizol法最适合于百合组织总RNA 的提取。建立RT-PCR 的有效检测体系和优化检测体系。主要研究了RT 主要反应成分dNTPs、RNasin、引物、AMV、模板浓度及RT 时间对RT 反应的影响;PCR 主要反应成分dNTPs、Mg~(2+)、引物和Taq DNA聚合酶浓度对PCR反应的影响。结果表明:要获得良好的RT-PCR 扩增,RT 体系中dNTPs、RNasin、引物、AMV、模板浓度要达到0.4mmol/L、0.3U/μl 、0.4μmol/L、0.1U/μl、0.005μg/μl 以上;RT 时间不宜少于40min;PCR 体系中dNTPs 浓度至少要达到0.1mmol/L,在0.2mmol/L～0.3mmol/L 范围内可以获得最好地扩增效果;Taq　E 浓度要达到0.015U/μl 以上;引物浓度不宜低于0.2μmol/L 但不宜高于0.7μmol/L;Mg2+要达到0.8mmol/L。以上各种成分用量的减少有效地降低了病毒检侧的成本。

【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005

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