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大花蕙兰与国兰杂交育种方法与流程

花匠小妙招
2024-11-25 11:50

大花蕙兰与国兰杂交育种方法与流程

本发明具体涉及植物遗传育种技术领域，具体为一种高效的大花蕙兰与国兰杂交育种方法。

背景技术：

广义的兰花是兰科（orchid）植物的统称，侠义的兰花常指兰属(cymbidium)植物及部分具有较高观赏价值的类型。兰花是世界名花和中国家喻户晓的传统名花，也是云南八大名花之一。全世界的兰科植物约800多属，计2.5万余种，可供栽培的约有2,000种，其中兰属植物有50种左右，据《云南植物志》记载，云南兰科植物有135属764种16个变种，占中兰花科属的78.95%和种数的61.27%，其中云南兰属植物有30余种，占全国的90%。也就是说，中国绝大部分兰花分布于云南。兰花按生态类型可分为地生兰、附生兰以及腐生兰三类。传统意义上的中国兰花被称为“国兰”，仅指兰科兰属植物中的地生兰，主要包括兰属中的春兰(cymbidiumgoeringii)、蕙兰(c．faberi)、建兰(c．ensifolium)、墨兰(c．sinense)、寒兰(c．kanran)、莲瓣兰(c．1ianpan)和春剑(c．1ongibracteaturn)7种。我国拥有丰富的兰科植物资源以及悠久的兰文化，孕育着巨大的商品化潜力，但我国兰花开发尚无形成大规模的商品市场。

大花蕙兰（cymbidiumhybrid）是兰属人工杂交种，是园艺栽培种，兰科兰属植物。它是由兰属中的大花附生种、小花垂生种以及一些地生兰经过一百多年的多代人工杂交育成的品种群，其遗传背景十分复杂。世界上首个大花蕙兰品种为cymbidium‘eburneo-lowianum’，是用原产于中国的独占春（c.eburneum）做母本，碧玉兰（c.lowianum）作父本，于1889年在英国首次培育而得。其后美花兰（c.insigne）、虎头兰（c.hookerianum）、红柱兰(c.erythrostylum)、西藏虎头兰(c.tracyanum)等十多种野生种参与了杂交育种。自1889年英国培育出第一个大花蕙兰品种以后，在20世纪40年代，欧美也选育出大量种间和品种间杂种。至今，大花蕙兰的栽培品种已有近2万个。大花蕙兰的来源及遗传背景较为复杂，一般花大色艳，观赏价值较高，其生态型也具多样性，一般与兰属植物中大花亚属的生物学习性相近，自然栽培选择温度15-28℃、湿度在60%—80%环境条件下容易获得成功，设施条件下可周年栽培。

传统大花蕙兰的花虽大却无香味。国兰为中国的传统名花，株型小巧秀气，有阵阵清香。因此，传统的杂交育种手段是目前兰花育种研究工作的重点之一。然而，大花蕙兰在其育种历程中，不断有染色体加倍现象出现，使倍性复杂化，有二倍体，也有三倍体或四倍体，但以三倍体居多；而国兰大多为二倍体。倍性不同的父母本杂交，正常胚的数量很少、合子胚的发育不正常、受精情况不良等都会导致果实败育。此外倍性差异引起无法形成正常配子及生殖隔离也会对杂交果实发育产生影响。目前兰属植物大花蕙兰与国兰的杂交育种技术处于发展阶段，研究方向比较单一，且在杂交育种过程中不断出现的杂交败育问题已严重阻碍了大花蕙兰与国兰杂交新品种的选育。

专利号为zl201410002480.5的发明专利公开了一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法，以春兰为母本，大花蕙兰为父本，母本在开花2天后去雄，父本取开花后3～5天的花粉，通过人工授粉获得杂交种，在杂交种的蒴果未开裂前采收，经表面消毒和种子用营养液前处理后进行无菌播种，经暗培养种子萌发、种子直接成苗或原球茎增殖。该育种方法的亲本选择无特殊要求，其优势在于短期保存花粉采用冷藏花蕊柱的方法，利用植物营养体短期保鲜的方法，使花粉最大程度的保持活力和洁净度，但并未作出亲本亲缘关系的分子遗传背景、大花蕙兰倍性检测、花粉活力及柱头可授性的系统分析，导致杂交育种时败育率较高。

技术实现要素：

针对现有技术兰属植物大花蕙兰与国兰的杂交育种技术存在的问题，本发明提出一种大花蕙兰与国兰杂交育种方法。

本发明的大花蕙兰与国兰杂交育种方法，其实施步骤为：

1.亲本选配：

根据中华人民共和国农业行业标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南（兰属）》对植株的形态进行描述；通过植物基因组dna的ctab法提取植物基因组dna，采用scar标记引物进行pcr扩增，构建系统进化树；通过植物基因组dna的ctab法提取植物基因组dna，采用scar标记引物进行pcr扩增，构建系统进化树；采用parteccyflowspace鉴定大花蕙兰植株倍性；根据亲缘关系和倍性亲本选配；用ttc染色法对测定国兰的花粉活力，用联苯胺—过氧化氢溶液进行大花蕙兰柱头可授性测定；

2.杂交：

以scar分子标记的亲缘关系的数系结构图为基础，结合大花蕙兰的植株倍性，选择其中的二倍体大花蕙兰品种作为母本，同时选择与二倍体大花蕙兰品种亲缘关系较近的国兰品种作为父本：杂交手段为正交杂交法。当花朵开放20-25d开始授粉，取其花葶中上部开放3～7d的1～3朵进行杂交；授粉选择在晴天进行，授粉前先把国兰花粉块顶端的药帽去掉，再把大花蕙兰花粉块用干净的镊子轻轻取下来，之后将国兰的花粉块放入大花蕙兰的蕊腔中。

所述的scar标记引物进行pcr扩增的具体操作包括：

1)取新鲜植物组织100g，加入液氮充分研磨；

2)加入250μlrbi，15μlrnasea充分混匀；

3)55℃水浴孵育15min；

4)12000rpm离心5min，轻轻吸取上清于干净的离心管中；

5)加入100μl溶液pbi中，充分混匀，冰浴5min，12000rpm离心5min；

6)轻轻吸取上清于干净的离心管中，加入375μl溶液bbi。(使用前加无水乙醇)，充分混匀；

7)吸全部的混合液加入离心柱中，12000rpm离心30s，弃去流出液；

8)加入500μl溶液cbi，12000rpm离心30s，弃去流出液；

9)加入500μl溶液wbi，12000rpm离心30s，弃去流出液（使用前加无水乙醇）；

10)重复步骤9一次；

11)12000rpm离心2min，彻底去除残留的wbi；

12)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入100μl预热eb（60-70℃），室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱dna；

13)取5μl的dna样品与2μl的10×lodingbuffer混匀后上样，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×tae缓冲液，电泳条件为：120v，电泳25min；电泳结束后将凝胶放入iquantcapture凝胶成像系统中，进行拍照观察，根据所用marker估测样品dna的浓度和分子量；

14)以提取的所有兰花资源的dna为模板进行pcr的扩增，扩增的引物为之前实验室的研究结果，实验参数如下：

引物序列：

sf:5'-tgcgcccttccatcacctt-3'

sw:5'-tgcgcccttcaatattttaaagaa-3'

pcr反应体系，共计25μl：

dna模板1.0μl

taqdna聚合酶(5u/μl，takara)0.25μl

2.5mmol/ldntps1.5μl

10×pcrbuffer(含mg2+)2.5μl

sf(10mm/μl)1.0μl

sw(10mm/μl)1.0μl

ddh2o17.75μl

pcr的扩增程序：

预变性94℃4min

变性94℃40s

退火55℃40s30个循环

延伸72℃1min

延伸72℃10min

保存16℃

15)取5μl的pcr产物与2μl的10×lodingbuffer混匀后上样，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×tae缓冲液，电泳条件为：120v，电泳25min；电泳结束后将凝胶放入iquantcapture凝胶成像系统中，进行拍照观察，根据所用marker估测样品目的条带的浓度和分子量；

16)pcr产物经电泳检测后，产物进行测序；

17)序列用软件bioedit的clustalw程序进行对位排列后，再进行手工校正。在软件mega4.0中，采用kimura2-parameter方法，计算出国兰品种的遗传距离；用mega4.0中的nj法(neighbor-joiningmethod)构建rdnaits系统树。

鉴定大花蕙兰植株倍性的具体操作包括：

1）检测仪器：parteccyflowspace

2）试剂盒：parteccystainuvprecisep

3）结果判定方法：由样本的荧光强度mean判断倍性，二倍体峰出现在92，则三倍体在138，四倍体峰在184；

4）实验方法：取待测新鲜植物叶片0.5平方厘米，置于培养皿中取400ul细胞核裂解液加于植物叶片之上用刀片将叶片切碎：横向充分切碎后，纵向充分切碎裂解提取1min将液体用30um滤网过滤至样品管中加入1600ul染液，避光染色1min上机检测，确定植株倍性。

ttc染色法对测定国兰的花粉活力的具体操作包括：先用玻棒将花粉块轻轻压碎；新鲜的花粉块因为水分较多，压后容易成为片状，不易散开；可以将轻压过的花粉块放置在阴凉通风或无阳光直射处晾10--20分钟，待花粉块含水量降低后再用玻棒将花粉块压碾成细小的粉末状；为测定花朵开放同一时间不同国兰品种的花粉活力，以授粉当天开放花朵的花粉为材料，用ttc染色法对国兰的花粉活力进行测定，试验重复三次；国兰开放天数为15-25d，选择晴天上午10:00在温室中采集花朵，放入保鲜袋中做上标记，迅速带到实验室中进行检测；将花粉剥离在载玻片上，用牙签将花粉压碎，滴入0．5％ttc溶液染色，盖上盖玻片，放入恒温箱中12h,染色后在100倍体视镜下观察每个品种的染色情况，统计花粉染色率，试验重复三次；花粉活力的算法为：

花粉活力=(有活力的花粉／观察花粉总数)×100％。

大花蕙兰柱头可授性测定的具体操作包括：

柱头可授性的测定用联苯胺—过氧化氢溶液进行测定：兰花接受花粉的部位是药帽下的合蕊柱腔，腔内充满大量无色透明的分泌物，如果分泌物油光发亮，则表示是最好的授粉时间；花朵开放天数为20-25d，选择晴天上午10:00在温室中采集花絮中间花朵，放入保鲜袋中做上标记，迅速带到实验室中进行检测；将采集到的新鲜大花蕙兰花朵剪下舌状花柱头，将其浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液(1%联苯胺-3%过氧化氢-水4∶11∶22)中，观察柱头在溶液中的反应，观察l0min，若柱头有可授性则会使柱头及其周围反应液变蓝并出现大量气泡。这主要是因为柱头内的氧化物酶活性能降解过氧化氢，氧化联苯胺。根据柱头周围变蓝的区域大小以及出现气泡的多少来判断柱头可授性的强弱。

本发明通过对现有的大花蕙兰与国兰杂交技术方法进行创新，构建了植株亲本选配以形态性状结合分子水平的亲缘关系检测、倍性鉴定、花粉活力及柱头可授性分析为条件，提高了果实结荚率，降低了大花蕙兰与国兰亲本选配的盲目性，有效的减少了杂交育种的成本，提高了育种效率。

附图说明

图1为本发明的育种方法的实施流程框图。

具体实施方式

实施例1：

1.试验材料：供试验的兰花品种，所有材料均来自云南省。其中27个大花蕙兰为市场上较为流行和受市场欢迎的商业品种，分别为英雄、红袍、火炬、红酒之恋、绣球、天之骄子、523、红酒、红霞、杨贵妃、金玉满堂、130、黄金岁月、蝶影、福娘、616、桃花、红双喜、大凤、日本香兰、日本樱花、福星、绿翡翠、爱神、光彩、梦境和金光；35个国兰（兰属地生兰类的4个种），分别为如意素荷、红玫瑰、碧龙红素、玉棠春、大富贵、大元宝、奥迪牡丹、红海棠、太极圣梅、宝晶、美丽之冠、素牡丹、红满天、心心相印、红河红、滇荷、玉皇大帝、西蜀道光、如意素、紫熹荷、荷之冠、一代天骄、出水芙蓉、春兰麻壳素、黄花素心、冠神、领带花、碧龙奇莲、大雪素、中华奇珍、宽叶莲瓣、翠荷素、凤羽峡观、肖梅和汗血宝马。

2.实施方法

2．1植株形态描述

供试材料中，国兰品种包括9个春兰（cymbidiumgoeringii）品种，8个春剑（cymbidiumlongibracteatum）品种，1个蕙兰（cymbidiumfaberi）品种，17个莲瓣兰（cymbidiumtortisepalum）品种，植株中小型，花色主要集中为黄色、红色和绿色，具花香，花朵小型；大花蕙兰植株和花朵有大型和中小型，花色主要集中黄色、红色和绿色，花朵鲜艳，6个品种（中小型植株）具有花香。

下表为35个国兰品种和27个大花蕙兰品种材料一览表：

2.2scar分子标记

从检测的结果来看，每个品种提取的条带清晰。说明用该试剂盒提取方法来提取兰花基因组dna是可行的。scar标记的兰属特异片段扩增结果能够清晰地扩增出约为1070bp的特异性条带。

研究兰属植物系统进化树，从整个群体上看，所有样本聚为3支。130、天之骄子、福娘、火炬、523、红袍、碧龙红素、中华奇珍、红海棠、汗血宝马、紫熹荷、冠神、红玫瑰、荷之冠、出水芙蓉、大富贵、玉棠春、大元宝、凤羽峡观、奥迪牡丹、红满天、桃花、大凤、红河红24个品种聚为第一支(a1)，包括8个大花蕙兰品种和16个国兰品种；红酒之恋、金玉满堂、日本樱花、红双喜、红酒、日本香兰、一代天骄、春兰麻壳素、肖梅、宽叶莲瓣、如意素荷、领带花、爱神、金光、福星、红霞、绣球17个品种聚为第二支(a2)，包括11个大花蕙兰品种和6个国兰品种；616、梦境、蝶影、黄金岁月、英雄、光彩、杨贵妃、绿翡翠、宝晶、碧龙奇莲、西蜀道光、太极圣梅、如意素、心心相印、大雪素、素牡丹、黄花素心17个品种聚为第三支(b)，包括8个大花蕙兰品种和9个国兰品种。说明部分大花蕙兰和国兰品种亲缘关系较近。

由样本的荧光强度mean确定材料的倍性，主峰表示相对核ｄｎａ含量，因标样主峰表示２ｃ相对核ｄｎａ含量，且主峰峰值远大于侧峰值出现在92，则三倍体主峰在138，表示3ｃ相对核ｄｎａ含量，四倍体主峰在184，表示4ｃ相对核ｄｎａ含量。其中二倍体有616、桃花、红双喜、大凤、日本樱花、绿翡翠、梦境7个品种，三倍体有红袍、火炬、红酒之恋、绣球、天之骄子、红酒、红霞、杨贵妃、金玉满堂、130、黄金岁月、蝶影、日本香兰、福星、爱神、金光16个品种，四倍体有英雄、523、福娘、光彩4个品种。27个大花蕙兰品种倍性的确定为杂交亲本选育奠定了基础。

在花朵开放0-40d期间，5个国兰品种的花粉活力呈现随着花朵开放天数增加，花粉活力增强，达到一定开放天数后，花粉活力下降的趋势。不同品种花朵开放0～20d，花粉活力处于增长期，开放15-25d花粉活力均出现最高值，随开放时间的增加，5个品种的花粉活力均下降。同一开放天数的不同品种之间花粉活力差异较明显，太极圣梅花朵开放20d花粉活力高达95%，滇荷花粉活力仅为20%。花朵开放期间，5个国兰品种的花粉活力存在显著性差异，其中太极圣梅花粉活力最强，显著高于红海棠、心心相印、美丽之冠和滇荷0.14、0.54、2.14、3.66。综上所述表明了，5个国兰品种花粉活力均在花朵开放20d出现最高峰值，各品种间花粉活力差异显著。因此杂交授粉时选择开放时间在15-25d盛开的花朵花粉，以保证具有较高的结实率。

活力范围为20%-95%.太极圣梅的花粉活力最高为95%，滇荷、宽叶莲瓣、汗血宝马的花粉活力最低为20%。花粉活力在80%以上的有6个品种，花粉活力在50%-79%的有15个品种，花粉活力在50%以下的有14个品种。

花朵开放天数为20-25d时，27个大花蕙兰品种植株的花朵柱头均具备可授性，其中8个品种的柱头最强，13个品种的柱头可授性强，6个品种的柱头可授性弱。

51个杂交授粉组合，授粉30d均表现有花朵迅速枯萎或柱头闭合、子房膨大等授粉反应，其中22个授粉组合获得发育成熟的蒴果，结实组合比率为43.14%；其中结实率为100%的有5个组合，结实率为60%-99%的有5个组合，结实率为60%以下的有12个组合；落果组合比率为56.86%；落果高峰期在授粉45d-80d和95d-146d期间。22个结实组合中蒴果发育成熟的时间有差异，从授粉到蒴果成熟需要约175d-200d。

结合花粉活力与柱头可授性可得：杂交授粉组合中结实率80%-100%的有9个组合，其中6个组合父本花粉活力＞73%，柱头可授性很强，红满天×绿翡翠父本的花粉活力＜50%导致结实率＜100%，凤羽峡观×爱神父本的花粉活力＜50%且母本的柱头可授性弱导致结实率＜100%，但日本樱花×玉皇大帝组合花粉活力与柱头可授性都弱，结实率为100%，具体原因需要进一步研究；结实率50%-80%的有3个组合，其中3个组合父本的花粉活力＞67%，2个母本柱头可授性强，1个母本的柱头可授性弱；结实率＜50%的有10个组合，其中9个组合父本的花粉活力≥50%，柱头可授性强，荷之冠×梦境组合父本花粉活力＜50%，柱头可授性强；结实率为0的有29个组合，其中有4个组合父本的花粉活力＞80%，柱头可授性强，8个组合花粉活力＞50%，柱头可授性强,11个组合父本花粉活力＜50%，柱头可授性强，具体原因需要进一步研究。分析可得：花粉活力和柱头可授性一般表现为越高其授粉成功率越高，反之亦然。