TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统接种牡丹花器官的方法与流程
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及病毒诱导基因沉默中trv载体侵染花器官的方法。
背景技术
牡丹(paeoniasuffruticosa)属于芍药科芍药属牡丹组，是重要的观赏花卉和药用植物，近年来，人们发现牡丹除了其花大色艳的观赏特性，也是一种优良的油料作物，其籽油具有产油量高、油用品质好的特点。然而，牡丹作为木本植物，其遗传转化体系尚不成熟，且牡丹生长年限长，从实生苗到开花需要3～4年的时间，研究牡丹花发育以及果实发育相关的基因存在极大的瓶颈。
病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing,vigs)是一种转录后的基因沉默技术，其作为一种有效的反向遗传学技术已经被广泛的应用于多种植物。vigs的作用原理是植物在抵御病毒侵染的过程中会产生特异性核酸内切酶dicer，将病毒复制过程中产生的双链rna切割成21～24个核苷酸的小分子干扰rna(sirna)。sirna在植物细胞内进一步扩增后，以单链形式与agronaute1(ago1)蛋白等结合，形成rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)。risc能够特异地引起植物细胞质中与sirna同源的mrna的降解，从而导致目的基因的沉默。
vigs技术主要借助病毒载体来实现对内源基因的沉默。烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,trv)是一类应用比较广泛的病毒载体，具有寄主范围广、沉默效率高、维持时间长等优点。vigs实验常用沉默载体为烟草脆裂病毒(trv)的rna1和rna2cdna的双元表达载体trv1和trv2(wangsb,tiansl,shahsn,etal.cloningandcharacterizationofthecarbclgenerelatedtochlorophyllinpepper(capsicumannuuml.)underfruitshadestress.frontiersinplantscience,2015,6(6):850.)。trv1包括编码rna依赖的rna聚合酶、运动蛋白和16kd蛋白的基因，是vigs体系的辅助病毒载体。trv2包括衣壳蛋白(cp)基因、多克隆位点(mcs)等，用于插入目的基因。
但牡丹作为木本植物，突变体不易获得，给这类植物的分子育种带来了诸多不便。目前有关vigs在牡丹花发育过程中的应用并没有相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种trv载体介导的病毒诱导基因沉默系统接种牡丹花器官的方法，该方法可以简单、高效、低成本的使trv病毒载体浸染发育中的牡丹花器官。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)将病毒载体trv1以及trv2或者将病毒载体trv1以及插入有目的基因的重组trv2分别转化农杆菌，将转化得到的含有trv1的阳性农杆菌与含有trv2或重组trv2的阳性农杆菌经培养后于侵染缓冲液中混合，得混合菌液；
2)经过步骤1)后，用带针头的注射器吸取混合菌液，然后将针头于发育中的牡丹花器官处插入牡丹植株内部并进行注射接种，直至该牡丹花器官表面有液体渗出(水渍状)时停止注射；
3)注射结束后采用以下条件对牡丹植株进行培养：温度为21～25℃，湿度为60～70％，光照强度为1800～2000lx，16h光照/8h黑暗。
优选的，所述步骤3)中，在牡丹植株培养过程中对牡丹花器官进行表型观测，并采样、提取rna后用半定量的方法检测花器官各组织结构的trv病毒载体的积累情况。
优选的，所述转化采用冻融法。
优选的，所述侵染缓冲液包括以下组分：10mm2-吗啉乙磺酸(mes)、100μm乙酰丁香酮(as)及10mmmgcl2。
优选的，将含有trv1的阳性农杆菌与另一种阳性农杆菌(例如含有trv2)分别培养至od600值为0.6～0.8后，经侵染缓冲液重悬并调节od600为1～1.5，然后按照体积比为1:1进行混合。
优选的，所述花器官在接种时的发育阶段处于显蕾期至圆桃期之间。
优选的，所述针头的插入位置具体为萼片基部，与花梗连接处，细胞组织较厚。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用带针头注射器对发育过程中的花器官进行trv病毒载体接种，不需要长周期的稳定表达和无菌操作即可达到侵染目的，能够用于在短时间内验证目的基因在花器官的不同结构中的功能，以及对花发育和果实发育的影响，本发明成本低、操作简便，适合在牡丹等本体植物中验证基因的功能，尤其是牡丹中与花和果实发育的相关基因，为牡丹中基因功能的研究提供了新的依据和方向。
进一步的，从萼片基部位置进行注射，可以方便、快捷的将包含病毒载体的侵染缓冲液运送至花器官的各组织结构中，并且使整个花苞出现明显的水渍状，提高侵染效果。
附图说明
图1为trv1、trv2载体(ptrv1、ptrv2)结构图。
图2为接种方法示意图；其中：(a)接种时期；(b)接种方法；(c)接种完成。
图3为接种12天后的花器官表型；其中：下方视图为上方视图的纵向局部剖开。
图4为接种12天后花器官不同结构的解剖图。
图5为半定量检测花器官不同结构的病毒载体的积累情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，其目的在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
本发明基于vigs系统，提出了一种可以在研究牡丹花发育相关基因中使用的trv载体介导的病毒诱导基因沉默系统接种牡丹花器官的方法。
(一)原料和试剂来源
1)牡丹植株：牡丹品种为凤丹(种子购买自陕西中资国业牡丹产业发展有限公司)，种植于相同环境下(种植地点：西北农林科技大学资源圃)。
2)vigs实验所用沉默载体trv1和trv2(参见图1)，由清华大学刘玉乐教授馈赠(2011年10月)，但均可根据现有文献自行构建。
3)农杆菌gv3101购于上海生物。
4)lb液体培养基配方：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/lnacl；
lb固体平板培养基：制作平板，则在lb液体培养基中再加入15g/l琼脂粉即可。
5)yep液体培养基配方：10g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/lnacl；
yep固体平板培养基：制作平板，则在yep液体培养基中再加入15g/l琼脂粉即可。
(二)接种方法
1、农杆菌的转化及培养
1.1)将trv2、trv1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，液氮冻融法转化农杆菌的具体方法为：取1～2μl病毒载体质粒加入到1管感受态gv3101中，冰上放置30min；再放入液氮中速冻5min，取出置于28℃的水浴中5min，之后冰浴2min。加入900μlyep液体培养基，180rpm，轻摇2～4h。室温下4000rpm离心1min，弃800μl上清，再轻轻吸打使细胞悬浮，得转化液。吸取转化液200μl均匀涂布于yep固体平板培养基(含50μg/mlrif+50μg/mlgen+50μg/mlkan)上，28℃倒置避光培养2天。从平板上挑取单菌落于300μlyep液体培养基(含50μg/mlrif+50μg/mlgen+50μg/mlkan)中，培养5h(28℃，250rpm)。然后以菌液做模板，pcr检测阳性克隆。将得到的阳性菌株保菌备用。
1.2)将含有trv2、trv1病毒载体的gv3101农杆菌分别接种于5mlyep液体培养基(含50μg/mlkan+50μg/mlrif+50μg/mlgen)中，分别于28℃振荡培养过夜。
1.3)第二天取500μl菌液接种于25mlyep液体培养基(含50μg/mlkan+50μg/mlrif+50μg/mlgen)中，28℃振荡培养过夜，至od600值为0.6～0.8(od600值与培养物的侵染活性有关)，4000r/min离心20min，倒掉上清，保留菌沉淀。
1.4)用20ml侵染缓冲液(10mmmes+100μmas(acetosyringone)+10mmmgcl2，溶剂是水)重悬菌体，并用侵染缓冲液调节od600值为1.2～1.5。
1.5)经过1.4)后，将含有trv1的gv3101菌液与含有trv2的gv3101菌液按1:1的比例(体积比)混匀，28℃、90r/min下放置3h(充分混匀)，得混合菌液。
2、侵染
于牡丹圆桃期，选取生长发育正常、未受病菌感染的花苞，进行接种(2018年3月)。用带针头的注射器吸取混合菌液，针对牡丹萼片基部，进行注射接种。从2到3个角度(周向上)进行注射，直至花苞表面充满水渍。接种结束后，将盆栽植株移到人工气候室中，培养条件为：温度为23±2℃，湿度为60～70％，光照强度为1800～2000lx，16h光照/8h黑暗(该培养条件有利于trv病毒载体的繁殖，以达到良好的侵染效果)。
3、检测
于接种后12天，对接种后的花器官进行表型观测，并分组织采样提取rna，用半定量的方法检测病毒载体的积累情况。
3.1)牡丹花器官各组织的rna的提取
①取2ml离心管，加入700μl裂解液(665μlsl和35μlβ-巯基乙醇)；
②取100mg组织，液氮中研磨组织成细粉，震荡混匀，样品较多时震荡后于冰上放置。12000rpm，2min(4℃)；
③吸取上清液，并转移至cs过滤柱中，12000rpm，2min(4℃)，轻轻吸取上清液，并转移到新的rnase-free的离心管里。
④轻轻加入无水乙醇(为上清液体积的0.4倍)，混合均匀后，将所有液体转入cr3吸附柱中，12000rpm，15sec(4℃)，弃废液，将cr3吸附柱重新放回收集管。
⑤在cr3吸附柱中加入350μl的去蛋白液rw1，12000rpm，15sec(4℃)，弃废液，将cr3吸附柱重新放回收集管。
⑥加80μl的dnasei(提前配好)于cr3吸附柱中央处，静置15min(室温)。
⑦加入350μl的去蛋白液rw1于cr3吸附柱中，静置1min，12000rpm，15sec，弃废液，将cr3吸附柱重新放回收集管。
⑧向cr3吸附柱中加入500μl漂洗液rw(用前加乙醇)，12000rpm，15sec，弃废液。
⑨重复⑧步骤一次。
⑩之后12000rpm，2min(4℃)，将cr3吸附柱放入新的离心管，在吸附膜的中央滴加30～50μlddh2o，静置3min(室温)，12000rpm，1min，即为rna提取液。
3.2)cdna的合成
通过电泳检测rna质量，核酸蛋白定量仪测定rna含量。cdna第一链的合成参照
3.3)半定量检测病毒积累情况
取2μl上述合成的cdna为模板，用trv2-u/trv2-l引物pcr扩增，检测trv2，反应体系如下：
trv2-u：5’-ttacgacgaaccaagggagtactac-3’
trv2-l：5’-agtcacaattagccctatttagatgt-3’
pcr反应程序：94℃2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，28个循环；72℃5min。
3.4)结果与分析
如图2所示，在牡丹显蕾期进行接种，直到花蕾外苞充满水渍状。接种后，牡丹花朵与对照(未接种)呈现明显的差异(图3、图4)。接种后12天，花瓣出现显著的扭曲症状(病毒感染导致)，且相比于对照，接种过病毒载体的牡丹花瓣出现褪色现象。接种后12天，雄蕊顶端发黑，且不散粉，接种后20天，雄蕊全部变黑、焦枯。萼片顶端出现失水现象。提取花器官不同结构的rna进行病毒载体检测，均能检测到病毒载体的积累(图5)。
总之，本发明公开的接种方法，可以简便、快速的将trv病毒载体接种到发育中的牡丹花器官中，使牡丹花器官在花瓣、雄蕊、雌蕊、萼片等组织结构中均可以检测到病毒载体的存在。本发明为病毒诱导基因沉默技术在牡丹花发育过程相关基因研究中的应用提供了一种快捷、高效的侵染方法。对于研究牡丹花发育以及果实发育相关基因提供了新的思路。
<110>西北农林科技大学
<120>trv载体介导的病毒诱导基因沉默系统接种牡丹花器官的方法
<160>2
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
ttacgacgaaccaagggagtactac25
<210>2
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
agtcacaattagccctatttagatgt26
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植物病毒载体系统研究及应用.doc
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