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我国部分百合野生资源的亲缘关系及其分布特点

花匠小妙招
2024-11-26 04:36

百合是单子叶植物亚纲百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物的总称，为多年生球根草本植物[1]。中国是世界百合属植物的自然分布中心，全世界百合属植物约有110 ~ 115个种，而中国有55个种、18个变种[2]。我国的野生百合资源丰富、分布广、种类多。目前，在百合资源调查、引种、形态、杂交育种等方面，我国已经取得了一些进展，如何将野生资源应用于百合育种，实现种质创新是亟待解决的问题，而对百合种质资源的亲缘关系进行评价是种质创新的前提和基础。

百合分类系统研究是对其亲缘关系评价的基础，而对亲缘关系的研究也是对百合系统分类的检验与佐证。一直以来，对于百合属的属下类群划分、起源、进化等问题存在较多争议，基于形态特征，已经提出了几种百合分类。目前国内和国际上普遍使用的分类系统是在1949年Comber[3]依据百合15个形态特征提出的，1980年经过Wang和Tang[2]修改后的分类系统，该系统将百合属分成7个组：卷瓣组（Sect. Sinomartagon）、百合组（Sect. Liriotypus）、轮叶组（Sect. Martagon）、根茎组（Sect. Pseudolirium）、喇叭组（Sect. Leucolirion）、具叶柄组（Sect. Archelirion）、钟花组（Sect. Lophophorum），后有研究提出将豹子花属（Nomocharis）并入百合属（Sect. Lilium-Nomocharis）这一观点[4]。近年来，对于百合分类系统和亲缘关系评价的研究有很多，顾欣等[5]利用扫描电镜对中国西部陕西、四川、甘肃和云南4省15种野生百合花粉进行了系统观察和比较分析，证明了花粉形态对于区分不同种具有重要的分类学价值。张艺萍等[6]对4个百合品种和2个百合野生种的染色体核型进行分析，证明了核型分析对于百合分类系统的研究价值。与此同时，国内外利用分子标记对百合属亲缘关系的研究多集中在RAPD、AFLP、SRAP等分析上。Lee[7]等利用ITS变异序列分析方法对来自朝鲜的83个种和14个变种的亲缘关系进行了研究。同年智丽等[8]采用SRAP分子标记对百合属23种野生百合进行遗传多样性以及遗传关系分析。杜运鹏[9]对百合的98个种，5个变种构建了ITS进化树，对百合属的喇叭花组的修正、分类系统subsect. 5c Comber的划分以及南川百合（Lilium rosthornii）的系统位置进行了研究。

SSR标记技术目前已经发展成熟，并在花卉遗传育种领域中被广泛应用，已应用于遗传多样性分析的有牡丹（Paeonia suffruticosa）[10]、芍药（Paeonia lactiflora）[11]、月季（Rosa chinensis）[12]、杜鹃（Rhododendron simsii）[13]。杨素丽[14]利用NCBI数据库中EST序列，开发出18对百合EST-SSR标记，建立了EST-SSR标记体系，并对5个杂种系的13个百合品种进行了多态性分析；Lee等[7]利用NCBI数据库中百合EST序列，开发出19对EST-SSR标记，并对84个品种进行了亲缘关系分析；葛亮[15]以转录组测序为基础，开发出20对EST-SSR标记，对百合的22个原生种、74个品种进行了标记分析，并对其亲缘关系进行分析；杜方[16]利用NCBI的EST库筛选出了61个具有多态性的SSR位点，开发出的61对引物在32个百合基因型中共扩增了153个等位基因。

本研究采用SSR技术，结合野生百合在我国的分布，从分子层面对其亲缘关系及其分布特点进行评价，以期从分子水平上探讨百合野生种间的遗传关系，旨在为百合野生资源的合理利用、杂交育种及新品种培育提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料包括25个野生种、2个变种，共计69份样品，其中大百合作为外类群，具体材料的种源地分布及其编号的详细信息见表1。

表 1 百合资源种源地分布及编号

Table 1. Provenance distribution and No. of lily resources

序号
No.种名　
Species　种源地及编号
Provenance and No.序号
No.种名　
Species　种源地及编号
Provenance and No. 1 玫红百合
L. amoenum 云南 Yunnan（84、85） 15 麝香百合
L. longiflorum 福建 Fujian（66） 2 滇百合
L. bakerianum 云南 Yunnan（81、82、86、91） 16 山丹
L. pumilum 内蒙古 Inner Mongolia（10）、
陕西 Shaanxi（11） 3 野百合
L. brownii 湖北 Hubei（26、28、31）、
河南 Henan（8）、湖南 Hunan（87）、
陕西 Shaanxi（9） 17 卷丹
L. lancifolium 陕西 Shaanxi（16、17、40）、
湖北 Hubei（33、41、53、54、62）、
重庆 Chongqing（27）、辽宁 Liaoning（60、68）、
西藏 Tibet（64） 4 条叶百合
L. callosum 河南 Henan（19） 18 尖被百合
L. lophophorum 云南 Yunnan（83） 5 垂花百合
L. cernuum 辽宁 Liaoning（49） 19 岷江百合
L. regale 四川 Sichuan（39、5、57、61） 6 有斑百合
L. concolor var. Pulchellum 辽宁 Liaoning（70） 20 南川百合
L. rosthornii 重庆 Chongqing（34）、湖南 Hunan（88） 7 川百合
L. davidii 重庆 Chongqing（22）、
甘肃 Gansu（44）、云南 Yunnan（89） 21 泸定百合
L. sargentiae 陕西 Shaanxi（2）、湖北 Hubei（23）、
四川 Sichuan（30、69）、重庆 Chongqing（45、67） 8 青岛百合
L. tsingtauense 山东 Shandong（18） 22 淡黄花百合
L. sulphureum 云南 Yunnan（71） 9 东北百合
L. distichum 吉林 Jilin（4）、辽宁Liaoning（47） 23 大理百合
L. taliense 云南 Yunnan（56、80）、重庆 Chongqing（59） 10 宝兴百合
L. duchartrei 四川 Sichuan（32、55）、
重庆 Chongqing（51） 24 毛百合
L. dauricum 辽宁 Liaoning（6）、吉林 Jilin（7） 11 绿花百合
L. fargesii 陕西 Shaanxi（38） 25 卓巴百合
L. wardii 西藏 Tibet（50、58） 12 台湾百合
L. formosanum 台湾 Taiwan（93） 26 湖北百合
L. henryi 湖北 Hubei（25） 13 大百合
Cardiocrinum giganteum 云南 Yunnan（13） 27 滇蜀豹子花
Nomocharis forrestii 云南 Yunnan（92） 14 大花卷丹
L. leichtlinii var. maximowiczii 陕西 Shaanxi（12）、辽宁 Liaoning（20）、
重庆 Chongqing（29）、湖北 Hubei（46） 1.2 基因组DNA的提取

取新鲜的上部幼嫩叶片为材料，− 80 ℃保存。基因组DNA提取的具体方法参考天根公司植物基因组通用提取试剂盒（DP320-02)。提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用核酸浓度测定仪（NanoDrop 2000）检测DNA质量及浓度，− 20 ℃保存。

1.3 荧光SSR分析

参考杨素丽[14]和葛亮[15]以及本课题组百合转录组数据（数据未公开）所开发的11对核心SSR引物，送北京睿博兴科生物技术有限公司进行荧光标记引物合成。具体信息见表2。

表 2 11对百合SSR引物信息

Table 2. Information of 11 SSR primers of Lilium

引物
Primer 5′修饰
Modification序列（5′−3′）
Sequence (5′−3′)重复单元
Motif引物
Primer 5′修饰
Modification序列（5′−3′）
Sequence (5′−3′)重复单元
Motif L1 5′-FAM GCTCTTCCTCGTCTGTGGTCGACATCAGTTACGCCCCTGT ACCAAC L7 5′-FAM GCGAGCGTGTCAATAATAAC CATCCCTACATCAAGACCGT GCG L2 5′-FAM TGGCTCGAACCTTCTGAGTTCCTCGGArTGTTGATCCTGT TGAAGA L8 5′-FAM GCATAAGTACCCACAACACA TCGTGTGAATCTTGCCAAT CCA L3 5′-FAM CAAAGCCTATGATAAACGCA GCTCGTTCTCAAGTTATCCAT CTGTTG L9 5′-FAM GCTGCTCACCGCCTCTATC ATCCACAGCCACCGCAAC CAGCT L4 5′-FAM GCTTGTCTTTCTCTGCTGTCT GAGATCCGACGTTATTTATGC CCTTCT L10 5′-FAM CATACATCCATCCGATTACA TGGTTTCATGACGTTCGT AAAGA L5 5′-FAM TCTCTTCGTCTTCCATTGTG ATCCTTGCTCACCTCCTCTG ACGCCG L11 5′-FAM AACAAACATCGGCAATCA ATGCGATGGGAGTAGGAG CGC L6 5′-FAM ATCCCTGGTCTTCTTCATTGGACTGTCTGGAGAGGGATGT GTCAAC

PCR反应体系（25 μL）：13.8 μL ddH2O，5 μL10 × PCR buffer，2.5 μL Mg2+，0.5 μL 10 μm dNTP，正反向引物各1 μL，Taq 酶0.2 μL，DNA模板1 μL。

用于PCR的反应程序：（1）95 ℃ 预变性5 min，（2）94 ℃ 变性45 s，（3）退火（退火温度以引物Tm值而定）45 s，（4）72 ℃延伸45 s，循环35次，（5）72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。PCR扩增产物中加入GeneScanTM-500LIZ（ABI，USA），在AB3730XL遗传分析仪中进行测序分析，具体要求按照说明书进行，获得每个样品的等位基因数据后，人工对获得的数据和峰图进行校对，最后得到69份样品的峰图和基因型。

1.4 遗传多样性分析

将整理好的SSR位点基因型数据导入软件Powermarker 3.25进行处理，计算以下参数：等位基因频率（Allele frquency）、观测等位基因数（Allele number.）、基因多样性（GD）、观测杂合度（He）、位点多态性信息含量（PIC）、固定指数（F）。

1.5 系统发育树构建及主坐标分析

用软件Powermarker 3.25进行数据整理和计算，通过NTsys 2.11构建遗传相似性矩阵及系统发育树进行聚类分析和亲缘关系评价，并进行主坐标分析。

2. 结果与分析

2.1 遗传多样性参数统计

利用11对核心引物对69份野生百合资源进行荧光毛细管电泳检测，结果显示（表3），共检测到107个等位基因，最多的为L9，等位基因数为19；最少的为L4，等位基因数为2；平均每对引物有9.727 3个等位基因；野生百合资源整个群体平均等位基因频率为0.453 3；基因多样性（GD）的范围为0.494 9 ~ 0.827 0，平均值为 0.687 8；平均观测杂合度（He）0.273 3；位点多态性信息含量（PIC）范围为0.372 4 ~ 0.804 9，平均值为0.642 7，引物具体信息见表2。

表 3 野生百合资源SSR位点遗传学参数统计

Table 3. Genetic parameters of SSR loci from wild lily resources

引物
Primer 等位基因频率
Allele frequency等位基因数
Allele number基因多样性指数
Gene diversity index杂合度
Heterozygosity多态性信息含量
PICF 值
F value L1 0.537 3 11.000 0 0.667 3 0.626 9 0.640 6 0.068 1 L2 0.376 8 11.000 0 0.775 8 0.014 5 0.749 1 0.981 6 L3 0.381 8 9.000 0 0.694 0 0.109 1 0.641 3 0.845 5 L4 0.550 7 2.000 0 0.494 9 0.087 0 0.372 4 0.826 6 L5 0.514 7 12.000 0 0.689 6 0.338 2 0.664 3 0.515 0 L6 0.597 6 7.000 0 0.571 4 0.195 1 0.519 5 0.665 4 L7 0.263 2 8.000 0 0.827 0 0.350 9 0.804 9 0.581 6 L8 0.375 0 13.000 0 0.777 7 0.203 1 0.750 7 0.742 4 L9 0.447 0 19.000 0 0.769 7 0.439 4 0.756 8 0.435 4 L10 0.532 3 5.000 0 0.540 1 0.000 0 0.439 7 1.000 0 L11 0.410 4 10.000 0 0.758 6 0.641 8 0.730 3 0.161 3 均值 Mean 0.453 3 9.727 3 0.687 8 0.273 3 0.642 7 0.607 8 标准差 SD 0.028 0 1.244 7 0.030 9 0.063 3 0.041 6 0.085 4 2.2 遗传相似性分析

遗传相似矩阵显示69份样品的遗传相似性系数范围为0.289 7 ~ 0.981 3。不同种之间，卷丹（L. lancifolium）和玫红百合（L. amoenum）、卷丹和大理百合（L. taliense）之间的相似性系数最小，平均值是0.289 7（表4）；淡黄花百合（L. sulphureum）和泸定百合（L. sargentiae）的遗传相似性系数最大，平均值是0.953 3（表5）。

表 4 不同种百合的遗传相似系数最小值

Table 4. Genetic similarity coefficient minimum value of different Lilium species

编号 No.846062 640.289 70.803 70.803 7800.308 40.289 70.289 7

表 5 不同种百合的遗传相似系数最大值

Table 5. Genetic similarity coefficient maximum value of different Lilium species

编号 No.6926710.953 30.729 0310.747 70.953 3

从同种不同种源来看，4个种源地的大花卷丹（L. leichtlinii var. maximowiczii）相似系数在0.747 7 ~ 0.934 6之间，其中分布于辽宁的种与其他种源地相似系数明显较小，分布于陕西、重庆和湖北的种相似系数较大（表6）；分别源于重庆、甘肃、云南3个种源地的川百合（L. davidii）相似系数在0.757 0 ~ 0.775 7之间，地域差异较大，相似系数较低（表7）。6个种源地的野百合（L. brownii）相似系数在0.672 9 ~ 0.953 3之间，其中种源地在湖北的野百合相似系数较大，而种源地分别在陕西和湖北的野百合相似系数较小（表8）。6个种源地的泸定百合相似性系数在0.775 7 ~ 0.943 9之间，其中种源地位于四川和重庆的种相似系数在0.859 8 ~ 0.943 9之间，位于陕西的泸定百合与其他种源地百合相似系数在0.794 4 ~ 0.869 2（表9）；12个种源地的卷丹的相似系数在0.729 0 ~ 0.981 3之间，其中分布于湖北、陕西、重庆和辽宁的卷丹相似性系数在0.906 5 ~ 0.981 3之间，遗传相似性较大，只有位于西藏的卷丹与其他种源地卷丹之间的相似性系数在0.729 0 ~ 0.803 7之间，明显出现了遗传变异（表10）。由此可见，地域差异加大会导致遗传相似系数降低，进而导致其进化上产生分歧。

表 6 不同种源地大花卷丹间的遗传相似系数

Table 6. Genetic similarity coefficients of L. leichtlinii var. maximowiczii in different provenances

编号 No.12202946 121.000 0200.803 71.000 0290.934 60.775 71.000 0460.869 20.747 70.915 91.000 0

表 7 不同种源地川百合间的遗传相似系数

Table 7. Genetic similarity coefficients of L. davidii in different provenances

编号 No.224489221.000 0440.775 71.000 0890.757 00.775 71.000 0

表 8 不同种源地野百合间的遗传相似系数

Table 8. Genetic similarity coefficients of L. brownii in different provenances

编号 No.2628318879 26 1.000 0 28 0.897 2 1.000 0 31 0.953 3 0.850 5 1.000 0 8 0.925 2 0.878 5 0.915 9 1.000 0 87 0.831 8 0.747 7 0.822 4 0.831 8 1.000 0 9 0.757 0 0.672 9 0.766 4 0.757 0 0.794 4 1.000 0

表 9 不同种源地泸定百合间的遗传相似系数

Table 9. Genetic similarity coefficients of L. sargentiae in different provenances

编号 No.22330456769 21.000 0230.794 41.000 0300.803 70.934 61.000 0450.775 70.934 60.925 21.000 0670.850 50.869 20.859 80.906 51.000 0690.869 20.869 20.878 50.887 90.943 91.000 0

表 10 不同种源地卷丹间的遗传相似系数

Table 10. Genetic similarity coefficients of L. lancifolium in different provenances

编号 No.161727334041535460626468 161.000 0170.981 31.000 0270.981 31.000 01.000 0330.981 30.981 30.981 31.000 0400.981 31.000 01.000 00.981 31.000 0410.981 30.981 30.981 30.981 30.981 31.000 0530.981 30.981 30.981 30.981 30.981 31.000 01.000 0540.981 30.981 30.981 30.981 30.981 31.000 01.000 01.000 0600.925 20.906 50.906 50.906 50.906 50.906 50.906 50.906 51.000 0620.906 50.906 50.906 50.906 50.906 50.925 20.925 20.925 20.981 31.000 0640.729 00.747 70.747 70.729 00.747 70.729 00.729 00.729 00.803 70.803 71.000 0680.962 60.981 30.981 30.962 60.981 30.962 60.962 60.962 60.887 90.887 90.729 01.000 0 2.3 系统进化树构建

通过遗传相似性分析，得到69份野生百合资源的亲缘关系聚类图（图1），69份材料主要分为5类：

图 1 野生百合样本间UPGMA聚类图

Figure 1. Dendrogram of wild lily samples using UPGMA method

第I类仅包括大百合属的大百合（Cardiocrinum giganteum）（云南）。

第II类又可分为5个亚类：第一个亚类主要包括钟花组的玫红百合（云南）和滇百合（L. bakerianum）（云南），卷瓣组的大理百合（重庆）、川百合（重庆）和毛百合（L. dauricum）（辽宁、吉林），喇叭组的南川百合（湖南）、泸定百合（陕西）和野百合（陕西）。第二个亚类主要包括钟花组的尖被百合（L. lophophorum）（云南），轮叶组的东北百合（L. distichum）（吉林），喇叭组的台湾百合（L. formosanum）（台湾）、野百合（湖南）和麝香百合（L. longiflorum）（福建），卷瓣组的条叶百合（L. callosum）（河南）、有斑百合（L. concolor var. pulchellum）（辽宁）、川百合（云南）和卓巴百合（L. wardii）（西藏）。第三个亚类主要包括卷瓣组的大花卷丹（陕西、重庆、湖北），喇叭组的湖北百合（L. henryi）（湖北）、泸定百合（湖北、四川、重庆）、岷江百合（L. regale）（四川）和淡黄花百合（云南）。第四个亚类主要包括喇叭组的野百合（湖北、河南）和南川百合（重庆），轮叶组的东北百合（辽宁），卷瓣组的垂花百合（L. cernuum）（辽宁）、大花卷丹（辽宁）、山丹（L. pumilum）（内蒙古）和宝兴百合（L. duchartrei）（四川）。第五个亚类主要包括卷瓣组的川百合（甘肃）和同种不同源的卷丹（陕西、重庆、湖北、辽宁）。

第III、IV、V类主要由卷瓣组聚在一起，其中包括豹子花属的滇蜀豹子花（Nomocharis forrestii）。

2.4 百合的空间分布关系

通过主坐标分析，得到69份野生百合资源的三维散点图，结果如下（图2）。

图 2 69个样品主坐标分析三维散点图

Figure 2. Three-dimension principal coordinate analysis plot of 69 accessions

三维散点图中四川、重庆、云南地区的百合大多聚在一起，陕西、湖北、湖南、河南地区的百合大多聚在一起，辽宁、内蒙古地区的百合大多聚在一起，证明了空间地理分布较近的野生种可能因生境相似而对环境有相同的反应，进而有趋同进化的趋势。

3. 讨　　论

从亲缘关系来看（图1），喇叭组b亚组[9]的泸定百合、淡黄花百合、湖北百合和岷江百合聚在第II类的第三亚类，喇叭组a亚组[9]的麝香百合和台湾百合聚在第II类的第二亚类中，很明显喇叭组两个亚组之间的亲缘关系较远，a亚组的麝香百合、台湾百合与卷瓣组的亲缘关系较近。1998年日本及西方研究者通过胚挽救技术，成功将麝香百合与渥丹、毛百合、湖北百合、紫脊百合（Lilium leucanthum var. centifolium）等杂交，因此推测麝香百合杂种系与亚洲百合杂种系关系较近[17]。2012年，葛亮等[18]对百合22个原生种和74个品种进行了SSR标记分析，其中麝香百合杂种系与亚洲百合聚在一起，证明了两者的亲缘关系很近；并且目前市场上的LA百合杂种系列为麝香百合与亚洲百合的系间杂种系，从侧面证实了本结论的正确性。而本研究在一定程度上为LA杂种系的培育成功提供了理论依据。

从地域分布来看，我国野生百合分布大体上可以划分为5个区域[9]：（1）中国西南高山与亚高山地区及喜马拉雅山区和藏东南地区，这个区域是我国野生百合资源的集中分布区；（2）中国中部秦巴山区；（3）中国东北地区；（4）中国华北地区；（5）华中、华东等低山丘陵地区。本研究的材料主要取自于西南地区（重庆、四川、云南、藏东南）、中部巴蜀（陕西秦岭、湖北、湖南）及东北地区（辽宁、内蒙古）。在三维散点图（图2）中，四川、重庆、云南地区的百合大多聚在一起，陕西、湖北、湖南、河南地区的百合大多聚在一起，辽宁、内蒙古地区的百合大多聚在一起，证明了空间地理分布较近的野生种可能因生境相似而对环境有相同的反应，进而有趋同进化的趋势。另外，结合聚类分析图，分布于辽宁、吉林等东北地区的百合与分布于四川、云南、重庆、西藏等中国西南高山及喜马拉雅山区和藏东南地区的百合也存在聚在一起的情况，这可能是高纬度东北地区和低纬度西南的高海拔地区的生存环境趋同造成的，也从侧面印证了关于世界百合起源中心学说，我国东北地区和喜马拉雅地区都是百合的分布中心。

从同种不同种源来看，其遗传多样性的表现不同：卷丹分布范围非常广，共有12个种源地，但分布于不同区域的卷丹均聚在第II类的第五亚类中，结合遗传相似性分析，除西藏地区的卷丹外，其他11个种源地的种间遗传差异很小，这可能与其是三倍体并长期无性繁殖相关。与之相对应的岷江百合、野百合、玫红百合、滇百合、川百合等，同种但不同种源地间存在显著的遗传差异，遗传多样性较高，不同种源地间的遗传相似系数较低，说明环境的不同促使这些野生种在分化上产生了差异，这可能与其进行有性繁殖相关。

除此之外，属外种大百合（Cardiocrinum giganteum）单独聚为一类，说明大百合与百合属间的亲缘关系较远；而滇蜀豹子花和卷瓣组的滇百合和宝兴百合聚在一起，说明其与卷瓣组间的亲缘关系较近，有研究认为，豹子花属是随着青藏高原迅速上升，在剧烈变化的自然压力下从百合属植物中分化形成的[19]，本研究支持将豹子花属并入百合属（Sect. Lilium-Nomocharis）这一观点[4]，且滇蜀豹子花的花型、花色、叶形、茎秆等性状都与百合相似，这也从形态上证明了这个观点。