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东方百合‘Vivian’高效离体快繁体系的建立

花匠小妙招
2024-11-26 04:38

百合是百合科百合属多年生球根花卉，是世界重要的切花，具有极高的观赏价值和经济价值。近些年来，东方百合‘Vivian’凭借其花大色艳，深受消费者喜欢，种植面积逐年提高，市场对其种球的需求也与日俱增。

分球繁殖和鳞片扦插是百合种球生产的常见方式，但普遍存在繁殖系数较低[1-3]以及病毒（CMV、LMoV和LSV等）、真细菌性病害（灰霉病、枯萎病等）和虫害（蚜虫、线虫等）发生严重导致种性退化等问题[4-6]。离体快繁技术因其繁殖系数高，而且通过茎尖脱毒可以获得无病毒植株等优点[7-9]，已成功应用于百合‘黄天霸’、‘水晶布兰卡’和‘Strawberry and Cream’等品种的种球繁育[10-15]、欧洲百合、金黄花滇百合、宜昌百合和新疆百合等野生百合资源保存[2-4, 16]以及百合新品种培育研究中。本研究以东方百合‘Vivian’的鳞片为外植体，在本实验室已有的离体快繁体系的基础，对不定芽的诱导、增殖、小鳞茎膨大、生根等步骤进行系统研究，旨在建立更为高效的东方百合‘Vivian’离体快繁体系，为其种球的规模化生产提供技术保障。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

东方百合‘Vivian’无菌组培苗为本实验室保存。

1.2 试验条件

基本培养基为MS或1/2 MS培养基。所有培养基的pH为6.0，琼脂浓度为6.0 g·L−1，121 ℃高压灭菌20 min冷却备用，培养温度为25 ℃。

1.3 试验方法 1.3.1 不定芽的诱导

基于实验室前期的不定芽诱导配方（MS+0.5 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+30 g·L−1蔗糖+6.0 g·L−1琼脂，pH值=6.0）设置不同激素和浓度组合6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L−1）、NAA（0.1、0.2 mg·L−1）的不定芽诱导培养基。将鳞片切成1 cm×1 cm的方块接种在各个不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导。45 d后观察统计不定芽诱导情况。每个处理30个鳞片，生物重复3次。

1.3.2 不定芽的增殖

基于实验室前期的增殖培养基配方（MS+1.0 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+60 g·L−1蔗糖+6.0 g·L−1琼脂，pH值=6.0）设置不同激素和浓度组合6-BA（0.8、1.0、1.2 mg·L−1）、NAA（0.1、0.15 mg·L−1）的增殖培养基。待诱导出的不定芽长至直径1 cm左右后，将不定芽分别接种至不同的增殖培养基中进行增殖。45 d后观察统计不定芽增殖情况。每个处理30个不定芽，生物重复3次。

1.3.3 小鳞茎的膨大

将直径1 cm左右的小鳞茎转接至表3不同浓度蔗糖的培养基中进行小鳞茎的膨大培养，30 d转接一次，60 d后统计鳞茎的直径。

表 3 不同浓度蔗糖对鳞茎膨大的影响

Table 3. Effecdts of different concentrations of sucrose on bulblet enlargement

基本培养基蔗糖/(g·L−1)直径/cm MS300.91±0.08c601.43±0.14b901.95±0.21a1201.33±0.23b 1.3.4 鳞茎的生根培养

将直径2~3 cm的鳞茎转接至表4的不同生根培养基中（蔗糖浓度为60 g·L−1），20 d后观察统计根系生长情况。

表 4 不同浓度NAA对生根的影响

Table 4. Effecdts of different concentrations of NAA on rooting

基本培养基NAA/(mg·L−1)生根系数 1/2MS0.01.22±0.78d0.12.76±1.31c0.23.62±1.10b0.34.63±0.39a0.42.92±1.11c 1.3.5 炼苗与移栽

待鳞茎根长到2 cm左右，在温室中开瓶炼苗3~5 d，将组培苗从瓶中移出，洗净根系附着的琼脂，移入表5不同草炭与蛭石比例的基质中，保持70~75%左右湿度，60 d后观察生长情况并统计成活率。

表 5 不同基质对试管苗移栽的影晌

Table 5. Effecdts of different media on the survival of plantlets

基质成活率/% 草炭∶蛭石（2∶1）71.12±4.12b草炭∶蛭石（1∶1）95.31±1.21a草炭∶蛭石（1∶2）67.21±4.14c

2. 结果与分析

2.1 不定芽的诱导培养

外植体在分化培养基上大概6~8 d开始进行分化，鳞片表面出现凸起，20 d左右逐渐分化出不定芽，随后逐渐发育成小鳞茎，如表1和图1A可知，当NAA的浓度不变时，不定芽诱导系数随着6-BA的浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，当6-BA为1.0 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1时，不定芽分化的诱导系数为3.65，比实验室已有的不定芽诱导体系（6-BA为0.5 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1）的诱导系数1.01高出了2.64，此浓度组合的诱导率最高并且不定芽健壮，因此，此激素浓度组合的培养基为最佳不定芽诱导培养基。

表 1 不同浓度6-BA、NAA对不定芽诱导的影响

Table 1. Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud induction

基本培养基6-BA/(mg·L−1)NAA/(mg·L−1)诱导系数 MS0.50.11.01±0.43d0.50.21.83±1.14c1.00.13.65±0.31a1.00.22.63±0.02b1.50.12.34±0.04b1.50.21.32±0.23d

图 1 东方百合‘Vivian’组织培养再生体系

A：不定芽诱导；B：不定芽增殖；C：小鳞茎膨大；D：鳞茎生根；标尺=1 cm

Figure 1. In vitro propagation of Oriental hybrid lily cultivar ‘Vivian’

A: Adventitious bud induction; B: Adventitious bud proliferation; C: Bulblet enlargement; D: Bulblet rooting; Bar=1 cm

2.2 不定芽的增殖培养

将不定芽转接到不同增殖培养基后约7~9 d，在鳞茎基部出现不同数量的小的不定芽，随后逐渐长成新的小鳞茎。由表2和图1B可知，不同激素组合培养基中，不定芽的增殖情况差异较大，当6-BA为0.8 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1时，增殖系数为1.21，增殖情况最差；当6-BA为1.0 mg·L−1、NAA为0.15 mg·L−1时，增殖效果最好，增殖系数为4.63，比比实验室已有的不定芽增殖体系（6-BA为0.5 mg·L−1、NAA为0.1 mg·L−1）的诱导系数3.21高出了1.42，因此，此激素浓度组合的培养基为最佳不定芽增殖激素培养基。

表 2 不同浓度6-BA、NAA对不定芽增殖的影响

Table 2. Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud proliferation

基本培养基6-BA/(mg·L−1)NAA/(mg·L−1)增殖系数 MS0.80.11.21±1.31d0.80.152.53±2.12c1.00.13.21±1.23b1.00.154.63±0.21a1.20.13.34±1.31b1.20.151.16±0.21d 2.3 鳞茎的膨大培养

如表3和图1C所示，在蔗糖浓度为30~90 mg·L−1时，随着蔗糖浓度的不断提高，不定芽的膨大的越明显。当蔗糖浓度为90 mg·L−1时，鳞茎膨大最明显，而当蔗糖浓度为120 mg·L−1时，不定芽的膨大速度开始下降。

2.4 鳞茎的生根培养

将鳞茎接种至不同浓度的生根培养基中3 d左右开始从鳞茎基本生长出根。如表4和图1D所示，呈现出低浓度NAA促进根的发生而高浓度NAA抑制根发生。在NAA浓度为0.0~0.3 mg·L−1时，随着浓度的不断提高，生根系数不断提高，NAA浓度为0.3 mg·L−1时，生根系数最高，达4.63；而当NAA浓度为0.4 mg·L−1，生根系数开始下降。

2.5 练苗与移栽

组培苗鳞茎移栽至消毒完全的不同基质中，10 d左右出现鳞片叶，同时有新根产生。由表5可知，在草炭与蛭石比例为1∶1的基质中的组培苗移栽苗长势健壮且成活率最高达95.31%。

图 2 移栽成活的组培苗

Figure 2. Survival plantlets after transplanting

3. 结论与讨论

在百合组培快繁技术中，培养基中激素的种类及不同激素浓度配比是核心[17-18]。研究表明，以MS为基本培养基，用6-BA和NAA两种激素可以实现东方百合‘Vivian’的不定芽诱导、增殖、小鳞茎膨大及生根培养。最佳不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+30 g·L−1蔗糖；最佳不定芽增殖培养基为MS+1.0 mg·L−1 6-BA+0.1 mg·L−1 NAA+60 g·L−1蔗糖；最佳小鳞茎膨大培养基为MS+90 g·L−1蔗糖；最佳生根培养基为1/2 MS+0.1 mg·L−1 NAA+60 g·L−1蔗糖。

蔗糖浓度对百合鳞茎的膨大起着重要作用。钱剑林等（2004）研究表明当培养基中蔗糖含量为75 g·L−1时，东方百合‘Sorbonne’小鳞茎的体积膨大系数最大[20]。张延龙等（2006）以‘Siberia’小鳞茎为试材，研究了不同蔗糖含量对组培苗的影响，发现蔗糖含量大于50 g·L−1时，鳞茎体积开始增大，到90 g·L−1时直径能够达到最大1.59 cm[21]。李雪艳等（2016）对蔗糖浓度对东方百合‘Tiger Woods’小鳞茎膨大的研究表明，当MS基本培养基中加入75 g·L−1的蔗糖时，能有效促进试管小鳞茎直径的增加[22]。本研究表明，MS基本培养基含90 g·L−1的蔗糖最有利于东方百合‘Vivian’小鳞茎的膨大，蔗糖含量继续升高则小鳞茎体积不会继续增大，而且发生部分小鳞茎产生褐死现象，原因可能是培养基中过高浓度蔗糖使培养基渗透压过大，对小鳞茎产生了胁迫，从而不利于其膨大。综上所述，不同百合品种由于遗传差异，适合各自小鳞茎膨大的最适蔗糖浓度有所不同，所以，在对新品种小鳞茎膨大培养过程中，对其蔗糖浓度进行优化至关重要。

本研究建立的东方百合‘Vivian’的不定芽诱导、不定芽增殖、鳞茎膨大、鳞茎生根等过程的组织培养快繁体系，可为其种球规模化生产提供技术保障。