菌种鉴定方法步骤
菌种鉴定方法
根据2015版《中国药典》9204微生物鉴定指导原则,大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中,对所检出微生物需要进行常规特征分析,即可满足要求.对于非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属水平.无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺失败时,对检出微生物鉴定至少进行达到种属水平,必要时达到菌株水平.以下简单介绍一下微生物鉴定方法.
首先通过初筛试验,确定纯化后的待检菌株的基本微生物特征,进行初步分类.常见的初筛试验包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应.其中生化筛选试验包括氧化酶试验、过氧化氢酶试验和凝固酶试验.初筛实验结果将为后续鉴定试验提供依据.
通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行的微生物鉴别,属于微生物表型鉴定,是经典的微生物分类鉴定法.目前已有多种商业化的生化鉴定系统,为实验人员省去了繁琐的实验量,如API试剂条鉴定系统、VITEK全自动鉴定系统、Biolog自动微生物鉴定系统.近年来一种新型的表型方法,介于表型和基因型之间的MALDI-TOF质谱法在微生物检定领域也取得了较快的发展.在表型鉴定时,应注意采用适宜的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响.通常进行生化鉴定需要待检菌为新鲜培养物.
微生物基因型通常不受生长培养基或分离活性的影响,只需分离得到纯菌落便可用于分析.但是技术水平需要保证,还需要昂贵的分析设备和实验材料.基因型鉴定包括16SrDNA、18SrRNA和ITS区测序鉴定、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、MLST、全基因组测序等.RiboPrinter微生物鉴定系统是基于RFLP技术来区分菌株,有助于溯源分析进行风险评估.当然,鉴定的终极手段是包含微生物所有遗传信息的全基因组测序.
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