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原核细菌光诱导基因表达系统及其调控基因表达的方法

花匠小妙招
2024-08-29 10:18

专利名称：原核细菌光诱导基因表达系统及其调控基因表达的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的遗传工程或合成生物学领域，具体地涉及基因表达调控领域更具体地涉及原核细菌细胞中基于光敏蛋白的光诱导基因表达系统，及采用该表达系统调控原核细菌细胞中基因表达的方法。
背景技术：
在遗传工程领域，准确控制基因的表达对于研究基因的功能以及生命体的生命活动均具有非常重要的意义。相对于真核细胞复杂的基因表达系统，原核细菌的基因表达系统则简单很多。以原核细菌中被使用最广泛的大肠杆菌为例，基因表达的第一步是由RNA聚合酶完成的DNA转录为RNA。大肠杆菌的RNA聚合酶有五个亚基组成，其分子量为约为480Kd,含有α , β , β ’，σ等4种不同的多肽,其中α为两个分子,所以全酶(holoenzyme)的组成是％^3 0’ σ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心(α2β β ’)的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的结合位点；β ’亚基含有与DNA模板的结合位点；而σ因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系。一旦转录开始，σ因子就被释放，链的延伸则由四聚体核心酶(core enzyme)催化。所以，σ因子的作用就是识别转录的起始信号,并使RNA聚合酶结合在启动子部位。DNA分子上的起始信号，即“启动序列”称为启动子。大肠杆菌的启动子序列主要由-10区和-35 区组成，-10区位于转录起点上游大约IObp处，含6个碱基的TATATA保守序列，它是RNA聚合酶的紧密结合位点；位于转录起点上游大约35bp处还有6个碱基的TTGACA保守序列，-35区提供了 RNA聚合酶全酶识别的信号；大肠杆菌启动子的强弱主要取决于-10区和-35区的剪辑碱基组成以及彼此的间隔长度。虽然单独的核心酶能与DNA结合，但主要是由于碱性蛋白质与酸性核酸之间的非特异性静电引力造成的，DNA仍保持双螺旋形式，而σ亚基能改变RNA聚合酶与DNA之间的亲和力，大大地增加酶与启动子的结合常数和停留时间。因此开始时核心酶在σ亚基参与下与DNA分子接触，形成非专一性复合物，这样的复合物是很不稳定的，酶分子可在DNA链上滑动。在σ亚基作用下帮助全酶迅速找到启动子，并与之结合生成较松弛的封闭型启动子复合物。这时酶与DNA外部结合，识别部位大约在启动子的-35位点处。接着是DNA构象改变活化，得到开放型的启动子复合物，此时酶与启动子紧密结合，在-10位点处解开DNA双链，识别其中的模板链。由于该部位富含A-T碱基对，故有利于DNA解链。开放型复合物一旦形成，DNA就继续解链，酶移动到起始位点。使用比较广泛的另一原核细菌是芽孢杆菌，它是一种革兰氏阳性细菌。与大肠杆菌不同的是，芽孢杆菌含有多种RNA聚合酶和σ因子，它们分别识别不同的启动子序列。原核细菌的基因表达系统主要分为两种，一种是组成型表达，即在不需要诱导的条件下，使目的蛋白自主连续性的表达。另一种是诱导表达系统，在诱导表达系统中，根据诱导物的不同又可分成化学小分子诱导表达系统和物理方法诱导表达系统两种。化学小分子诱导表达系统中，IPTG是最常用的一种诱导剂。IPTG作为乳糖的类似物，是一种极强的诱导剂，它不被细菌代谢且十分稳定。目前最常用的一些表达载体中，多数含Τ7启动子、Lac启动子、Tac启动子、grac启动子的，其诱导剂均是IPTG。阿拉伯糖和色氨酸诱导表达系统现在也越来越被更多的采用，小分子阿拉伯糖和色氨酸具有对细胞没有毒性且能达到紧密调控等优点。Mn2+、Fe2+、Cu+等金属离子感受蛋白的发现使得人们的视线也渐渐投入到金属离子结合相应的感受蛋白来诱导蛋白表达的方向。物理方法诱导表达系统中常用的是利用温度变化来诱导蛋白表达，例如大肠杆菌中的LacI的温度敏感突变体，在30°C时具有抑制启动子的活性，在42°C时失活从而失去抑制启动子的活性。紫外线(UV)调控的“囚笼(caged)”技术是另一种常用的物理诱导表达方法[Keyes, W.M.等，TrendsBiotechnol, 2003. 21 (2) : 53-55. ] [I]。以上所述原核细菌诱导表达系统虽已获得较广泛应用，但是仍存在一些缺点(I)诱导剂本身对细胞有较大的毒性、且价格偏贵(如IPTG)，在制备医疗目的的重组蛋白时并不合适；(2)金属离子诱导表达系统中，金属离子感受蛋白识别金属离子的特异性不强，同一家族或同一周期的不同金属离子可被同一感受蛋白结合而激活转录，因此原核细菌细胞内部坏境中存在的多种金属离子会对转录产生一定的干扰，而且原核细菌细胞本身的氧化环境会对低价金属离子产生氧化作用，从而干扰对氧化环境要求较高的金属离子的激活转录；(3)温度诱导表达系统中，外界温度的升高会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定，很多目的蛋白质在高温下也难以正确折叠，因而UV诱导的囚笼技术可能造成对细胞的不可逆性损伤；(4)最重要的是，化学诱导物只能在时间上调节基因的表达，不能在空间上特异性调控某些细胞及组织的基因表达。然而，光是一种易于时间和空间操作的诱导物，一般对细胞无上述毒性，且易获取。近些年来，人们也发现了一些生物体内调节生物钟系统中存在光可调节蛋白(也称为光敏蛋白)，光照对其功能存在重要的影响。我们设想通过分子设计的方法，改造天然存在转录因子去合成具有光反应性的人工转录因子，进而在原核细菌细胞中构建光调控基因表达系统。目前在原核细菌中这方面的报道很少，共涉及两个系统。Anselm Levskaya等在2005年报道了一个基于光敏色素Cphl和大肠杆菌自身EnvZ/OmpR双组分信号通路的光调控蛋白质表达系统[Levskaya, A.等，Nature, 2005. 438 (7067) :ρ· 441-2. ] [2]。在黑暗条件下，光敏转录因子发生自磷酸化后结合到OmpR依赖的ompC启动子上，从而启动目的基因的转录与表达。在红光的照射下，光敏转录因子的自磷酸化作用被抑制，不能结合到ompC启动子，因而不能激活目的基因的转录与表达。随后的几年里，同一研究小组对这种光诱导表达系统进行了一些改变，得到可用多种颜色的光共同调节目的蛋白的表达[Tabor，J. J.等，JMol Biol, 2011. 405(2) :ρ· 315-24,Tabor, J. J.等，Cell, 2009. 137(7) :ρ· 1272-81. ] [3，4]。Keith Moffat课题组开发了另一个新的重组光敏转录因子YF1，它是基于来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的YtvA蓝光光敏蛋白和来自慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的 FixL 蛋白[Moglich，A.等，J Mol Biol, 2009. 385(5) :p. 1433-44,Ohlendorf, R.等，J Mol Biol，2012. 416，534-542. ] [5，6]。基于 YFl 的光诱导基因表达系统在蓝光存在的情况下目的蛋白的表达受到抑制，没有蓝光存在时目的基因则高水平表达。然而，这两种原核基因表达系统都有较大的局限性。前者的系统非常复杂，它除了需要光敏转录因子和报告系统外，还需要引入hoi和pcyA两个基因才能将血红素(haem)转化成系统正常工作所必需的藻蓝素(phycocyanobilin)，大大增加了构建系统时的工作量。后者的系统在蓝光照射下依旧有较多的泄漏表达，诱导倍数仅有几十倍，这样就不能对目的基因的表达量进行非常精确的调控。以上所述缺点限制了这两个光诱导表达系统在原核细菌中的使用。到目前为止，除了上述系统使用的Cphl和YtvA光敏蛋白外，已知的其它光敏蛋白还有以黄素类物质为生色团的光敏蛋白(亦称为黄素蛋白家族蓝光受体)，分为三类一是含光-氧-电压(light-oxygen-voltage, LOV)结构域的光受体蛋白，如光敏色素；二是类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-like cryptochromes);第三类是近些年来才发现的利用 FAD 的蓝光蛋白(blue light using FAD, BLUF) 光敏色素是含LOV结构域的光受体蛋白质最多的一类，研究较多的有photl、WC-1> WC-2> PYP (光敏黄色蛋白，photoactive yellow protein)、Phy3、VIVID 等。光敏色素通常是膜偶联激酶蛋白，在蓝光照射下发生自磷酸化改变激酶活性而调控相关的生理过程。大多数光敏色素的C端为丝氨酸/苏氨酸激酶结构域N端为结合黄素分子的两个LOV结构域，蓝光照射时LOV结构域与黄素分子共价结合生成黄色-半胱酰胺加成产物引起黄素结合口袋空间构象变化，导致C端激酶结构域改变其激酶活性，但此过程完全可逆。迄今，在真核生物细胞中已建立的最成功的光诱导表达系统正是基于VIVID光敏蛋白。Yang课题组[Wang, X.等，Nat Methods, 2012. p. 266-269. ] [7]利用粗糙链孢霉菌的VIVID蓝光光敏蛋白经蓝光照射后会形成同源二聚体的原理构建了一个真核光调控基因表达系统。在这个系统中，光敏转录因子由三个或者四个多肽组成，蓝光照射后重组光敏转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子可结合于靶转录单元核苷酸序列中的反应元件，并通过该融合蛋白的第三多肽的转录激活/阻遏结构域和募集的宿主细胞本身的其它转录辅因子，一起协同作用于该靶转录单元中的启动子，从而调节(启动或阻遏)目的基因的转录和表达。该系统组分简单且具有诱导迅速、诱导倍数高、可逆性好、时间和空间特异性高等优点而被认为是迄今最优秀的真核生物细胞基因表达系统。但遗憾的是，由于原核细菌和真核生物细胞的转录翻译机理的不同，因此该系统不能应用于原核细菌中。此外,MasayukiYazawa等[Yazawa, Μ.等,Nat Biotechnol, 2009. 27 (10) :ρ· 941-5. ] [8]利用拟南芥的 FKFl(flavin-binding, kelch repeat, fboxl)与 GI (GIGANTEA)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用的原理也构建了一个真核光调控基因表达系统，但其低诱导倍数和稍显复杂的系统组分大大限制了它的应用。

来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的隐花色素是第一个被分离得到的植物蓝光光敏蛋白，研究比较多的有隐花色素I (CryptochromesI, CRYI)、隐花色素2(Cryptochromes2, CRY2)、光敏色素 A (phytochrome A, phyA)和光敏色素 B (phytochromeB, phyB)等，主要功能是接受:昼夜节律光调节闻等植物的生长和运动。隐花色素的氣基酸序列和生色团组成与光裂解蛋白很相似，多数隐花色素的大小为70kD-80kD，包含相对保守的N端PHR (光裂酶相关)结构域和长度差异较大的C端未知结构域，其PHR结构域可非共价结合黄素。有研究利用拟南芥CRY2 (隐花色素2)与CIBl (隐花色素2相互作用的螺旋环螺旋)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用，构建了一个真核生物细胞内的光诱导表达系统[Kennedy, M. J.等，Nat Methods, 2010. 7 (12) :ρ· 973-5. ] [9]。包含BLUF结构域的蓝光受体蛋白和包含LOV结构域的光受体蛋白与隐花色素不同的是，前者光照激活后不会与黄素生色团反应生成共价产物，而是导致生色团构象变化引起黄色吸收光发生IOnm红移。包含BLUF结构域的光受体蛋白研究最多的是ΑρρΑ，它是球状红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)的一种转录抗阻遏蛋白，黑暗时AppA与细胞中的一种PpsR转录因子结合形成AppA-PpsR2复合物，使PpsR不能结合DNA ;强蓝光照射可使AppA从复复合物上解离而释放PpsR形成四聚体结合于特定DNA序列导致抑制相关基因的转录[Pandey, R.等，FEBS J, 2012. ] [10]。Haifeng Ye 等人[Ye, H.等，Science, 2011. 332 (6037) :ρ· 1565-8. ] [11]利用黑视素(melanopsin)及细胞内信号通路构建得到一个蓝光激发的真核生物细胞光诱导表达系统。黑视素是一种在某些视网膜细胞表面的感光色素。在蓝光存在下，黑视素会触发钙离子快速地涌入细胞内，经过细胞内一系列信号级联反应后，I丐调蛋白(calmodulin)激活具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的钙调神经磷酸酶(calcineurin)，后者将转录因子NFAT去磷酸化，去磷酸化的NFAT转录因子进入细胞核内与NFAT特异性的启动子结合后启动目的基因的转录与表达。该系统最大的缺点是系统复杂且参与了细胞内的信号通路，因而系统本身稳定性差，并且有可能通过影响细胞的信号通路而影响细胞的正常生命活动。相对于真核生物细胞，原核细菌具有增殖快、培养成本低、能够高效表达外源蛋白(甚至可以达到细菌总蛋白量的90%以上)等多种优点，这些优点使得原核细菌更适合作为大量表达目的蛋白的宿主细胞。然而如上所述，目前已有的广泛用于原核细菌的基因表达系统大多数采用化学诱导剂调控，虽然其诱导效果较好，背景低、表达强度高，但许多系统具有多效性因而副作用广泛并有潜在的细胞毒性。更为重要的是，化学诱导剂不能在空间上精确调控基因的表达；而物理方法(如温度)调节基因表达的系统目前很少，且温度的升高带来的副作用很多。少数几种基于光敏蛋白的基因表达系统，由于系统本身的复杂性或者诱导倍数低等原因限制了其应用。综上所述，我们认为有可能综合这些系统的优点在原核细菌中创造出一种新的更优秀的光诱导基因表达系统，以克服前人研究的缺陷而广泛用于生物医药研究中。经过潜心研究，发明了一种新型的原核细菌光诱导基因表达系统，它具有良好的基因表达调控能力，可以在时间和空间上共同调控基因的表达。

因此，本发明的第一个目的是提供一种新型原核细菌光诱导基因表达系统。本发明的第二个目的是提供用所述光诱导基因表达系统调节原核细菌细胞中基因表达的方法。本发明的第三个目的是提供含有所述光诱导基因表达系统的原核细菌表达载体。本发明的第四个目的是提供所述光诱导基因表达系统在调节原核细菌的生命活动(如细菌的移动、裂解等)上的用途。本发明的第五个目的是提供装有所述原核细菌光诱导基因表达系统的表达载体或基因组上整合了所述表达系统中光敏转录因子表达框的原核细菌菌株的试剂盒。发明概述本发明涉及提供一种原核细菌光诱导基因表达系统，包括a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽和作为光敏结构域的第二多肽山)靶转录单元，包括被第一多肽识别/结合的包含至少一个反应元件的启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子和待转录核酸序列。本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子是一种重组光敏DNA结合蛋白，在光照前后这种光敏DNA结合蛋白与相应反应元件的结合能力发生显著变化，从而直接抑制或者启动基因的转录与翻译。
重组光敏转录因子的第一多肽为DNA结合结构域，它能够特异性地识别反应元件，单独不能够结合到反应元件上或者是结合能力很弱，需要第二多肽来辅助其结合到反应元件。第一多肽与第二多肽之间可操作性连接。第一多肽可选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3DNA结合结构域。第二多肽为光敏结构域，通常来自以黄素类为生色团的光敏蛋白。第一多肽和第二多肽之间可以直接连接，也可操作性地通过接头肽连接。接头肽的氨基酸个数是可变的(如O - 10个或更多)。第一多肽可进一步选自大肠杆菌LexA DNA结合结构域、λ曬菌体cl阻遏蛋白的DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、酵母Gal4DNA结合结构域、四环素组合蛋白TetR的DNA结合结构域，及其截短体或/和氨基酸序列同源性80%_99%的突变体。第二多肽选自含黄素类生色团的光敏蛋白的光敏结构域和含LOV结构域的光敏蛋白的光敏结构域。进一步可选自粗糙链孢霉菌的VIVID的LOV结构域、燕麦光敏色素I基因的L0V2结构域AsL0V2、无隔藻金色素蛋白I的LOV结构域AuLOV和假单胞菌的LOV结构域PpSBl-LOV及其截短体或氨基酸序列15%-99%相同或氨基酸序列36%_99%相似的突变体。本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，靶转录单元中的启动子-待转录核酸序列之间，或者启动子-反应元件-待转录核酸序列之间，或者反应元件-启动子与待转录核酸序列之间均可直接或操作性连接。所述反应元件为可被第一多肽特异性识别和结合的DNA基序。反应元件选自LexA结合元件、Cl结合元件、LacI结合元件、Gal4结合元件和TetR结合元件。所述启动子选自大肠杆菌的colE启动子、sulA启动子、recA启动子、umuDC启动子、Iac最小启动子、T7噬菌体的T7启动子、λ噬菌体的012启动子，枯草芽孢杆菌的grac启动子。按照本发明的原核细菌光诱导基因表达系统，重组光敏转录因子还可进一步包含附加的多肽，如可以招募RNA聚合酶其他组分的第三多肽。第三多肽与第一、第二多肽可直接连接或通过接头肽连接。第三肽可选自大肠杆菌的ω因子、α因子或氨基酸序列36%-99%相似的突变体。本发明还涉及含有本发明的光诱导基因表达系统的原核细菌表达载体。所述表达载体可以是单独含有重组光敏转录因子编码基因的原核细菌表达载体，也可以是单独含有靶转录单元的原核细菌表达载体，所述靶转录单元中含有启动子但待转录核酸序列空缺或启动子-反应元件但待转录核酸序列空缺或反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺。或者，也可以是同时含有重组光敏转录因子编码基因和靶转录单元的原核细菌表达载体。所述表达载体中的所述重组光敏转录因子编码基因选自序列48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106,109ο本发明还涉及基因组上整合了本发明的光诱导基因表达系统中光敏转录因子表达框的原核细菌菌株。
本发明也涉及用本发明的光诱导基因表达系统在原核细菌细胞中调控基因表达的方法，包括以下步骤a)将所述原核细菌光诱导基因表达系统构建在原核细菌表达载体中；b)引入含被调控基因的原核细菌细胞；和c)光照诱导所述原核细菌细胞，使原核细菌细胞中的被调控的核苷酸进行表达。本发明的在原核细菌中调控基因表达的方法，涉及光源的选择和照射方法的选择。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光；照射方法包括光照量、光照时间、光照强度及光照频率的选定。用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。本发明还涉及用本发明的光诱导基因表达系统来调控原核细菌生命活动的方法，如移动、裂解等。本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒装有含本发明光诱导基因表达系统的原核细菌(如大肠杆菌)表达载体或基因组上整合了本发明光诱导基因表达系统中光敏转录因子表达框的原核细菌菌株，及相应的说明书。本发明试剂盒中的原核细菌表达载体所包含的靶转录单元中待转录核酸序列可以是空缺的。发明详述本发明提供一种基于光敏多肽的、光诱导的原核细菌基因表达系统，用于在时间和空间上调节目的基因在原核细菌细胞中基因的表达。本发明的光诱导基因表达系统涉及至少两个部分第一部分是能够在原核细菌细胞中表达的重组光敏转录因子融合蛋白的编码核苷酸序列，该融合蛋白由两个多肽组成，其中第一多肽是其DNA识别/结合域，第二多肽为光敏多肽；第二部分是由`含启动子-待转录核苷酸序列或者启动子-反应元件-待转录核苷酸序列或者反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的祀转录单元核苷酸序列，其中反应元件是与上述重组光敏转录因子融合蛋白第一多肽所识别/结合的DNA核苷酸序列。第一部分的两个多肽优选采用有关蛋白的截短的功能活性片段(即结构域)。可通过基因工程技术将本发明的光诱导基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个原核细菌表达载体中或分别构建在二个原核细菌表达载体中。在具体使用过程中，利用常规转化的方法将上述的两个组分转化到原核细菌细胞中去，或者将第一部分利用常规的基因敲除的方法整合到原核细菌细胞的基因组上去，使之表达本发明的重组光敏转录因子融合蛋白，用适当波长的光照射可导致其第二光敏多肽二聚化能力改变，二聚化的光敏多肽可以结合到本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列中的反应元件上去，通过阻碍RNA聚合酶与启动子区域的结合来直接抑制下游目的基因的转录和表达，或者通过招募RNA聚合酶的其他组分到启动子区域来启动下游基因的转录与表达。本发明提供的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可利用不会损伤细胞的光照射，在时间上和空间上调节目的蛋白基因在原核细菌细胞中的表达。本发明的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可利用不同的光照强度等光照条件的差异来调节目的蛋白基因在原核细菌细胞中的表达。本发明的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可通过光来诱导一些蛋白的表达来控制原核细菌的生命活动，如运动、裂解等。所用的光廉价、易于获得、对细胞没有毒性。本文所用术语的定义和解释
“宿主细胞”在本专利中特指原核细菌细胞，可以是原始的未经改造的原核细菌细胞，也可以是基因组经过改造的商业化原核细菌菌株，如实验常用的BL21、JM109 (DE3),DH5a、枯草芽孢杆菌WB800等，也可以是在这些商业化菌株的基础上再进行基因组改造的得到的原核细菌菌株，如本发明中敲除了基因组中sulA基因、LexA基因得到的JM109 (DE3, SulA_，LexA_)大肠杆菌菌株，或者基因组上整合有本发明重组光敏转录因子的JM109 (DE3, sulA_，LexA: : Amp-LV-LO)大肠杆菌菌株；也可以是其他和本发明的光诱导基因表达系统相容的宿主细胞均可以。“目的蛋白”也可称为“感兴趣蛋白”，指任何有用的蛋白，例如可用于预防或治疗目的或其他用途的、需要在大肠杆菌细胞中表达的有用生物蛋白质，包括天然的或人工修饰或突变的有用蛋白质。“报告蛋白”为目的蛋白的一种，指其表达容易被检测的有用蛋白质。为便于检测本发明基于光敏多肽的、光可诱导的目的蛋白基因表达系统的效果，可以选择以下已知的广泛应用的报告蛋白红色突光蛋白(mCherry), β _半乳糖苷酶(LacZ)等。但本发明的光可诱导目的蛋白基因表达系统不限于表达报告蛋白，而可用于表达任何有用的目的蛋白。“基因”、蛋白质的“编码核苷酸序列”、“待转录核苷酸序列”在本文中含义相同可互换使用，指天然或重组的携带蛋白质氨基酸序列信息密码子的DNA序列。“目的蛋白基因”、“目的蛋白的编码核苷酸序列”或简称为“目的基因”在本文中含义相同，可互换使用，指编码目的蛋白的基因，通常为脱氧核糖核酸DNA双链序列。这种基因可包含在宿主细胞的基因组DNA序列中或包含在人工构建的表达载体中，如本发明的靶转录单元序列中。同样，“报告基因”指编码报告蛋白的基因。“转录”在本文中专指原核细菌细胞中通过RNA聚合酶将目的基因转录产生携带该基因信息的RNA。 “表达”、“目的蛋白基因表达”、“基因表达”在本文中含义相同可互换使用，指目的基因的DNA序列转录产生携带该基因信息的RNA CmRNA或反义RNA)和该RNA携带的信息在核糖体中被翻译产生目的蛋白二者，即转录产生信息RNA和翻译产生目的蛋白都叫做表达。本文包括这二种含义，主要指产生目的蛋白。“转录调节”本文专门指原核细菌细胞中基因转录的调节。“转录因子”或“转录因子融合蛋白”在本文中含义相同可互换使用，指原核细菌的转录因子，一般情况下是一个蛋白质，可以是天然的或人工改造的或人为融合的，包括能识别/结合靶转录单元核苷酸序列中的反应元件的多肽，通过与靶转录单元中反应元件的结合和相互作用，本身就能或者募集RNA聚合酶其他组分一起调节目的蛋白基因的转录。转录因子视其组成的不同可分为“转录激活因子”或“转录抑制因子”，二者简称“转录因子”。“靶转录单元”指人造的由含反应元件的启动子和目的基因组成的DNA序列(不是蛋白质)，其中反应元件位于启动子序列内部或者位于启动子的-35区的上游或者位于启动子-10区的下游，目的基因位于启动子下游，彼此可直接相连或操作性(即可隔开若干个核苷酸)相连。“反应元件”指转录因子特异性识别/结合的一个或多个顺式DNA基序，不同的转录因子有与其相对应的不同的反应元件，转录因子包含能与这种DNA基序结合的结合结构域。当转录因子与其相对应的反应元件特异性结合后，该反应元件即向启动子传达反应性，转录因子本身就可以或者通过招募RNA聚合酶的其他组分一起抑制或者激活启动子活性，阻碍或激活下游目的基因转录产生相应的RNA。在本发明中，反应元件指能够与重组光敏转录因子的第一多肽特异性识别/结合的DNA基序，例如LexA识别/结合的反应元件为长16bp的DNA基序(序列11)。“启动子”指启动和指导其下游目的基因转录产生RNA的DNA序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子可以是天然基因的启动子或人工修饰的启动子。原核细菌的启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5 IObp处，有一段由6 8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或一 10区。来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35bp处，有一段由IObp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶σ亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。“载体”、“表达载体”、“基因表达载体”、“重组基因表达载体”或“质粒”在本文中含义相同可互换使用，指能在原核细菌细胞中表达重组目的蛋白的载体。“转化”指利用化学方法或者物理方法使外源质粒DNA分子进入原核细菌细胞中。具体的方法可参见Sambrooka等人(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社(1989))，和其它有关教材。本发明的光诱导原核细菌基因表达系统中，第一部分的重组光敏转录因子是由两种或三种功能性多肽片段直接通过肽键串联连接或通过短肽接头串联连接形成的融合蛋白。在适当波长的光照射下，该融合蛋白能结合于本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列的反应元件，并通过其自身或者募集宿主细胞中RNA聚合酶其他组分，一起协同作用于启动子区域，从而阻遏或启动靶转录单元中目的蛋白基因的转录与表达。本文中，“重组光敏转录因子融合蛋白”与“重组光敏转录因子”含义相同，可互换使用。本发明的重组光敏转录因子含有第一多肽，该多肽虽能特异性识别所述靶转录单元核苷酸序列中的反应元件但不能与其结合或结合能力弱，只有在第二多肽的协助下同质二聚化后方能结合反应元件；该多肽可衍生自任何已知的蛋白质DNA识别/结合结构域，优选氨基酸序列更短的DNA识别/结合结构域，包括天然的和合成的这种DNA识别/结合域或其类似物(如保留了甚至增强了结合能力的结合域突变体或截短体)。可用作本发明的第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3DNA结合结构域。第一多肽优选包括但不限于=LexA蛋白的DNA识别/结合域(序列2)、λ噬菌体CI阻遏蛋白cl蛋白的DNA识别/结合域(序列4)、Lac阻遏蛋白LacI的DNA识别/结合域(序列6)、酵母Gal4DNA识别/结合结构域(序列8)、四环素组合蛋白TetR的DNA识别/结合域(序列
10)等，及其截短体或/和氨基酸序列同源性80%-99%的突变体。更优选LexA的DNA识别/结合域和Cl的DNA识别/结合域。LexA蛋白是存在于大肠杆菌细胞内的一种转录抑制因子，能调控细胞内20多种基因的转录，同源二聚化后的LexA 二聚体能够识别/结合启动子中的反应元件16个碱基的CTgT(N)8ACAg回文结构，从而阻止RNA聚合酶对后面基因的转录。LexA含有202个氨基酸，其中1-87位氨基酸是其DNA识别/结合结构域，88-202位氨基酸是二聚化结构域，只有同源二聚化的LexA才能特异性结合相应的反应元件，LexA单体蛋白则不能。正常情况下大肠杆菌细胞中的LexA是二聚体形式存在，当细胞受到内部或外部SOS信号刺激时，二聚化的LexA被细胞内某些酶(如RecA)切断分开并从反应元件上解离，使得原来被LexA抑制的基因激活，大肠杆菌启动针对SOS的修复功能[12，13] [Schnarr, M.等，Biochimie, 1991. 73(4) :ρ· 423-31，Little, J. W.等，Cell, 1982. 29(1) :ρ· 11-22.]。基于LexA的双杂交系统也被用于研究基因表达与蛋白质相互作用。例如,Clonetech公司生产的酵母双杂交系统(MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System)就是基于此系统。d蛋白是λ噬菌体Cl基因编码的一种转录抑制因子，它可以阻止λ左、λ右两个早期起动子的转录导致不能产生复制及细胞裂解的蛋白。Cl蛋白含有236个氨基酸，其N端为DNA识别/结合域(1-102位氨基酸)和C端为二聚化域(132-236位氨基酸)。cl蛋白同源二聚体识别/结合匕和Pk两个操纵子序列上，每个操纵子各含有Cl三个识别结合位点，分为PL的0L1、0L2和0L3以及PR的0R1、0R2和0R3。cl与ORl的结合能力相对强些，ORl的保守DNA序列为TACCTCTGGCGGTGATA，单体Cl蛋白几乎无这种结合能力[Burz，D.S.等，Biochemistry33 (28)，8399-8405 (1994)，Hu, J. C.等，Science250 (4986)，1400-1403(1990)][14， 15]。Lac阻遏蛋白LacI能特异性识别/结合大肠杆菌乳糖操纵子系统，进而调节相关基因的转录与表达。LacI蛋白包含N端的DNA识别/结合域(1_62位氨基酸)、核心蛋白域(63-340位氨基酸)和C端四聚化域(341-357位氨基酸)。其特异性识别/结合的DNA保守序列为GAATTGTGAGCGCTCACAATT，只有二聚化或者四聚化的LacI才能与之结合，单体LacI蛋白几乎不能结合[Lewis, Μ.等,Science271 (5253), 1247-1254 (1996)，Friedman, A. M.等，Science, 1995. 268 (5218):p. 1721-7. ][16，17]。

Gal4是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌的转录激活蛋白(其编码基因写成GAL4)，能识别/结合基因启动子的上游反应元件-激活基序UASJ长17bp的一段序列
-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3; (R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示脱氧核苷酸)]。它可介导半乳糖诱导的基因，如GAL1，GAL2, GAL7, GALlO和MELl转录和表达。Gal4的N末端为DNA识别/结合域，C末端为转录激活结构域(AD)。此DNA识别/结合域含一个锌簇(Zinc cluster),即Zn(2)-Cys(6)双核簇，需形成同质二聚体才能结合反应元件发挥其作用[Kraulis，P.J.等，Nature, 1992. 356 (6368) :ρ· 448-50. ,Marmorstein, R.等，Nature, 1992. 356 (6368):p. 408-14. ] [18，19]。基于GAL4/UAS的双杂交系统是用于研究基因表达的一种有效工具。例如，普洛麦格公司(Promega)公司生产的哺乳动物双杂交系统(CheckMate MammaI ianTwo-Hybrid System)就采用了此 GAL4/UAS 系统。TetR阻遏蛋白是存在于很多革兰阴性菌中的一种转录因子，通过结合特定DNA基序抑制相关基因的转录。TetR蛋白的N端为DNA识别/结合域和C端为二聚化域。单体TetR蛋白可形成同质二聚体而识别/结合含有特定DNA序列的操纵子上，单体TetR几乎无结合能力[ffissmann, A.等·，EMBO JlO (13), 4145-4152 (1991), Ramos, J. L.等·，MicrobiolMol Biol Rev69(2)，326-356(2005)][20，21]。
在本发明一优选实施方式中，第一多肽为LexA蛋白的1_87位氨基酸，即其DNA识别/结合域(其核酸和蛋白质序列分别为序列I和序列2)，其单独不能结合反应元件(序列
11)。在另一优选实施方式中，第一多肽为Cl蛋白的1-102位氨基酸，即其DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列3和序列4)，其单独不能结合反应元件(序列12)。在另一优选实施方式中,第一多肽为LacI蛋白的1-62位氨基酸，即其DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列5和序列6)，其单独也不能结合反应元件(序列13)。在另一优选实施方式中，第一多肽为Gal4蛋白的1-65位氨基酸,即其DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列7和序列8)，其单独也不能结合反应元件(序列14)。在另一优选实施方式中，第一多肽为TetR蛋白的1-63位氨基酸，即其DNA识别/结合结的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列9和序列10)，其单独也不能结合反应元件(序列15)。本发明的光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子中的第二多肽是光敏多肽，来自以黄素类(FMN或FAD)为生色团的光敏结构域。如含有光-氧-电压(LOV)结构域的光敏蛋白、类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-like cryptochromes)、利用FAD的蓝光蛋白(blue light using FAD, BLUF)0优选含LOV结构域的光敏蛋白，经适当波长光照射后，第二多肽的二聚化能力发生改变，使转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子结合于相对应的反应元件，从而直接调节目的基因的表达水平。本发明包括但不限于以下几种优选光敏蛋白或其功能活性截短体。一个优选的第二多肽是粗糙链孢霉菌的VIVID(VVD)蛋白的光敏结构域及其突变体。VVD是存在于粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)细胞内参与蓝光调控细胞信号传导通路的一种光敏蛋白质。在蓝光照射下它能与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD, Flavin AdenineDinucleotide)发生蛋白分子间反应形成二聚体。全长VVD蛋白含有186个氨基酸,只含一个对光敏感的LOV结构域。研究表明VVD蛋白缺失了 N端36个氨基酸的截短体蛋白(VVD36)稳定性比全长蛋白更好，而蓝光照射后形成的VVD36 二聚体不光照恢复其单体形式的半衰期为 18000s，含点突变 C71V 的 VIVID36 二聚化能力更强[Zoltowski, B. D.等，Biochemistry, 2008. 47 (27) :ρ· 7012-9，Schwerdtfeger, C.等，EMBO J, 2003. 22 (18) :ρ· 4846-55.][23，24]。在本发明一优选实施方式中，第二多肽是含一个点突变的删除前1-36个氨基酸的VVD(C71V)、VVD(N56K)、VVD(Y50W)突变蛋白(核酸序列分别为16、18、20，氨基酸序列分别为17、19、21)。在本发明一个更优选实施方式中，第二多肽是含二个点突变的删除前1-36 个氨基酸 VVD (N56K C71V)、VVD (I52A C71V)、VVD (I52S C71 V)和 VVD (N56R C71V)突变蛋白(其核酸序列分别为22、24、26、28，氨基酸序列分别为23、25、27和29)。第二个优选的第二多肽是燕麦(Avena sativa)光敏色素I基因的L0V2结构域(简写为AsL0V2，其核苷酸和氨基酸序列分别为30、31) [Peter, E. , B.等，NatCommun, 2010.1 (8) : 122，Halavaty, A. S.等，Biochemistry, 2007. 46 (49) :p. 14001-9.][25，26]。燕麦细胞光敏色素I的N端为LOVl和L0V2光氧电压(LOV)结构域，在蓝光照射下均能与黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)结合生成一种加成产物。本发明将燕麦光敏色素I的L0V2结构域连接于第一多肽，成功导致可用光照调控转录因子的第一多肽与对相应的反应元件的结合能力。本发明含有AsL0V2第二多肽的转录因子LA，在黑暗时可以结合其对应的反应元件导致目的基因表达，而在光照下这种结合减弱导致目的基因表达水平上调。第三个优选的第二多肽是无隔藻(Stramenopilealgae Vaucheria frigida)金色素I (aureochromel)蛋白C端的LOV结构域(简写为AuLOV,其核酸和蛋白质序列分别为序列32和序列33) [Takahashi, F.等，Proc Natl Acad Sci U SA, 2007. 104(49) :19625-19630] [27]。本发明含有AuLOV第二多肽的重组转录因子LAu光照后二聚化能力增强使目的基因的表达水平下调。以上所述第二多肽中，VVD和AuLOV用适当波长光照射可使由其构成的重组光敏转录因子二聚化增强，导致其结合到反应元件上，从而抑制下游基因的转录；而AsL0V2构成的重组光敏转录因子，在黑暗时二聚化而结合反应元件，从而抑制下游基因的转录。对来自光敏蛋白的6种不同的LOV结构域用Accelry Discovery Studio2.1进行同源性分析，这几种LOV结构域分别来自VIVID (Ne VVD)、白领-l(Nc WcI),FKFl (At FKF1)、金色素I (Vf AureolLOV)、燕麦向光素I (As phot LOVl和As phot L0V2)。结果显示，这几种蛋白完全相同的氨基酸约为15%，具有相似性的序列约为36% (图36)。本发明的光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子还可包括第三多肽，该多肽可以招募RNA聚合酶其他组分。可用作本发明的第三多肽包括但不限于来自大肠杆菌的ω因子结构域和α因子结构域，这两种结构域在先前的大肠杆菌单杂交系统中已广泛被人们采用[Dove, S. L.等，1998. 12(5) :ρ· 745-54，Dove, S. L.等，Nature, 1997. 386(6625) :p.627-30. ] [28，29]。第三多肽可与第一、第二多肽直接或通过接头肽相连。如上所述，重组光敏转录因子所含的两种或三种多肽之间可以有多种选择，将两种或者三种多肽连接成融合蛋白又可以有多种组合选择，本发明优选具有良好活性的两种或者三种多肽的功能结构域片段制备尽可能短的重组转录因子融合蛋白，通过在原核细菌细胞中选择对目的基因的表达调控效果好的，即光照和黑暗时导致目的基因表达量差异大的该光敏转录因子，以调节目的基因的表达，但不论何种选择与组合，只要能实现本发明所设想的光调控基因表达性能的的重组光敏转录因子，各种组合都包含在本发明的范围内。本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，第二部分靶转录单元由转录因子特异性识别/结合的启动子-待转录核苷酸序列组成，或由启动子-反应元件-待转录核苷酸序列组成，或由反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成。其中启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子的核苷酸序列视不同实施方式所选重组光敏转录因子的第一多肽不同而不同。换言之，必须根据所选择的第一多肽来选择与其相对应的启动子或者启动子-反应元件或者反应元件-启动子序列。例如，第一多肽为LexA蛋白的DNA识别/结合域时，其对应的反应元件为“序列11” ;第一多肽为Cl蛋白的DNA识别/结合域时，其对应的反应元件为“序列12”基序；第一多肽为LacI蛋白的DNA识别/结合域时，其对应的反应元件为“序列13”基序；第一多肽为Gal4蛋白的DNA识别/结合结构域时，其对应的反应元件为“序列14”基序；第一多肽为TetR蛋白的DNA识别/结合域时，其对应的反应元件为“序列15”基序。本发明中与光敏转录因子相对应的反应元件一般是包含在启动子核苷酸序列内部，或者位于启动子的-10区下游，光敏转录因子与之结合后通过阻止RNA聚合酶与启动子区域的结合而下调下游目的基因的转录。在本发明具体的实施方式中，启动子是大肠杆菌colE启动子、sulA启动子、recA启动子、umuDC启动子、λ噬菌体012启动子、噬菌体Τ7启动子和枯草芽孢杆菌的grac启动子(核酸序列分别为34、35、36、37、38、39、40)。另外，反应元件也可以位于启动子-35区的上游，通过光敏转录因子的第三多肽招募RNA聚合酶的其他组分来启动下游基因的转录。分析相关文献，这类启动子包括但不限于Iac最小启动子(核酸序列为41)，其中上游反应元件的个数可以是I 一 5个或者更多。在本发明的实施方式中，启动子以选择大肠杆菌Iac最小启动子为佳。本领域技术人员知道,所谓“操作性连接”指反应元件与启动子之间或多个反应元件之间不是直接相连而可以隔开若干个核苷酸，只要仍能协同作用即可。本发明靶转录单元启动子下游是待转录的核苷酸序列，指编码目的蛋白的核苷酸序列。如上所述，目的蛋白可以是目前已知和将来发现的任何有用的蛋白。为了验证本发明系统的效果和便于检测，在本发明的实施例中，采用了示范性的报告蛋白红色荧光蛋白mCherry (其核酸和氨基酸序列分别为序列42和序列43)、β -半乳糖苷酶(LacZ，其核酸和氨基酸序列分别为序列44和序列45)、Erol巯基氧化酶(其核酸和氨基酸序列分别为序列46和序列47)作为目的蛋白，但本发明的目的蛋白不限于这些报告蛋白。可用标准重组DNA技术将本发明光诱导基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个原核细菌表达载体中或分别构建在二个原核细菌表达载体中。可用标准技术将这种表达载体引入各种原核细菌细胞中以表达所需目的蛋白。本发明提供含有所述两种或者三种多肽各种组合的多种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体。在本发明一优选实施方式中，提供含不同LexA(l-87)与VVD36(C71V)间接头肽的重组光敏转录因子LexA(l-87)-VVD36(C71V)基因原核细菌表达载体 pLV-LO、pLV-L1、pLV_L2、pLV_L3、pLV_L4、pLV_L5、pLV_L6、pLV_L7、pALV-LO、pALV-L1、pALV-L2、pALV-L3、pALV_L4、pALV_L5、pALV_L6、ApLV_L7 (重组光敏转录因子简写为 LV-L0、LV-LU LV-L2、LV-L3、LV-L4、LV-L5、LV-L6、LV-L7，核苷酸序列分别为 48、50、52、54、56、58、60、62，氨基酸序列分别为49、51、53、55、57、59、61、63)。在另一优选实施方式中，提供其中VVD含有单个点突变的重组光敏转录因子LexA (1-87) -VVD基因的原核细菌表达载体pALV - LO (Y50W)、pALV-LO (N56K)，其中括弧中为VVD中的突变位点，这两种重组光敏转录因子的编码核酸序列分别为64、66，氨基酸序列分别为65、67。在另一优选的实施方式中，提供其中VVD含有双突变点的重组光敏转录因子LexA(1-87)-VVD基因的原核细菌表达载体 pALV-LO (N56K C71V)、pALV-LO (I52A C71V)、pALV-LO (IS2SC71V)和 pALV-LO (N56RC71V)，这四种重组光敏转录因子的核苷酸序列为68、70、72、74，氨基酸序列分别为69、71、73、75。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LeXA(l-87)-AsL0V2 (简写为LA，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列76和序列77)基因的原核细菌表达载体pALA。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LeXA(l-87)-AuL0V (简写为LAu，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列78和序列79)基因的原核细菌表达载体pALAu。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子cI(l-102)-VVD36(C71V)(简写为CV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列80和序列81)基因的原核细菌表达载体pACV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LacI(l-62)-VVD36(C71V)(简写为LaV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列82和序列83)基因的原核细菌表达载体pALaV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子Gal4 (1-65)-VVD36(C71V)(简写为GV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列84和序列85)基因的原核细菌表达载体pAGV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子TetR(l-63)-VVD36(C71V)(简写为TV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列86和序列87)基因的原核细菌表达载体pATV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LexA(1-87) _VVD36(C7IV)-α (简写为LV α，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列88和序列89)基因的原核细菌表达载体pALVa。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子ω-LexA (1-87) _VVD36(C7IV)(简写为ω LV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列90和序列91)基因的原核细菌表达载体pAcoLV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子cI(l-102)-VVD36(C71V)-a (简写为CV a，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列92和序列93)基因的原核细菌表达载体pALVa。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子ω-Cl (1-102) _VVD36(C71V)(简写为ω CV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列94和序列95)基因的原核细菌表达载体pAcoCV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LacI(l-62)-VVD36(C71V)-a (简写为LaV a，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列96和序列97)基因的原核细菌表达载体pALaV a。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子ω-LacI (1-62) _VVD36(C71V)(简写为ω LaV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列98和序列99)基因的原核细菌表达载体pAcoLaV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子Gal4(l-65)_VVD36(C71V)-a (简写为GV a，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列100和序列101)基因的原核细菌表达载体pAGVa。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子o-Gal4(l-65)-VVD36(C71V)(简写为ω GV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列102和序列103)基因的原核细菌表达载体pAcoGV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子TetR(l-63)-VVD36(C71V)-a (简写为TVa，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列104和序列105)基因的原核细菌表达载体pATV a。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子ω-TetR(1-63)_VVD36(C7IV)(简写为ω ，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列106和序列107)基因的原核细菌表达载体ρΑω 。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LV-LO基因以及祀转录单元colE-mCherry的原核细菌表达载体 pD_coIEnCherry-Amp-LV(其中 ter-colE-mCherry-Amp-LV-ter 核苷酸序列为108)。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LacI(l-62，wt)-VVD36(C71V)基因(简写为LaV (wt)，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列109和序列110)以及靶转录单元Pgrac-mCherry 的原核细菌表达载 pHTOl-LaV (wt) -PgracmCherry (其中 LaV (wt) -Pgrac-mCherry核苷酸序列为111)。本发明提供含待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的原核细菌表达载体，待转录的核苷酸序列空缺是让用户可以自行选择所需的待转录的核苷酸序列，例如目的蛋白的编码基因，用标准的重组DNA技术将其插入本发明的这种表达载体中，与上面所述含重组光敏转录因子基因的表达载体共同转化原核细菌细胞，来调节待转录核苷酸序列(基因)的表达。在本发明的一些实施方式中，原核细菌表达载体的靶转录单元中空缺的待转录核苷酸序列分别是LexA对应的colE-待转录核苷酸序列、LexA对应的sulA-待转录核苷酸序列、LexA对应的RecA-待转录核苷酸序列、LexA对应的umuDC-待转录核苷酸序列、LexA对应的LexA反应元件-1ac最小启动子-待转录核苷酸序列、cl对应的PA()1；r待转录核苷酸序列、Cl对应的Cl反应元件012-lac最小启动子-待转录核苷酸序列、IacI对应的T7_lacl反应元件-待转录核苷酸序列、IacI对应的IacI反应元件-1ac最小启动子-待转录核苷酸序列、Gal4对应的T7-Gal4反应元件-待转录核苷酸序列、Gal4对应的Gal4反应元件-1ac最小启动子-待转录核苷酸序列、TetR对应的T7_TetR反应元件-待转录核苷酸序列、TetR对应的TetR反应元件-1ac最小启动子-待转录核苷酸序列。本发明也提供分别转化了各种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体或者基因组上整合了各种重组光敏转录因子表达框的原核细菌菌株，同时提供含有启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子而待转录核苷酸序列空缺的原核细菌表达载体。用户可用标准重组DNA技术将自行选择的待转录核苷酸序列(目的蛋白基因)插入该表达载体中，然后用该重新构建的载体转化已转化了各种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体或者基因组上已整合了各种重组光敏转录因子表达框的原核细菌菌株，并培养这种原核细菌细胞表达他们所需的目的基因，或供他们研究如何调节目的基因的表达。本发明还提供装有各种表达载体或已转化了这种载体或者基因组上整合了各种重组光转录因子表达框的原核细菌细胞的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒中一些容器分别装有含一种或多种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体。在另一个实施方式中，该试剂盒中的一些容器分别装有含一种或多种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体，另一些容器分别装有含靶转录单元(其中启动子-待转录核苷酸序列空缺或启动子-反应元件-待转录核苷酸序列空缺或反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺)的原核细菌表达载体。在还有一个实施方式中，该试剂盒中一些容器装有已转化了含重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体或者基因组上已整合了各种重组光敏转录因子表达框的原核细菌细胞，另一些容器装有启动子-待转录核苷酸序列空缺或者启动子-反应元件-待转录核苷酸序列空缺或者反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的原核细菌表达载体。本发明的试剂盒还可以包含相应的光照控制设备，例如LED灯及其调控装置。所有试剂盒都装有相应的说明书，以说明盒中的各成分、使用目的和使用方法，并提供有关的参考文献目录。本发明还包括光诱导基因表达系统在原核细菌细胞中调控基因表达的方法，包括步骤a)将所述原核细菌光诱导基因表达系统构建在原核细菌表达载体中；b)引入含被调控基因的原核细菌细胞；和c)光照诱导所述原核细菌细胞，使所述原核细菌细胞中的被调控的核苷酸进行表达。光照诱导所述原核细菌细胞的方法包括光源的选择和光源的使用。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光。在本发明的一个实施方式中，光源选用蓝色LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照强度、光照时间、光照频率以及用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。在本发明的一个实施方式中，光照强度为0-0. 125mff/cm2不等；在另一个实施方式中，用打印的投影片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平；在另一个实施方式中，用中性灰度片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平。附图简要说明

图1是重叠PCR的示意图。图2是同源重组连接示意图。图3为反向PCR的原理。
图4为以T7启动子进行表达的含不同接头肽的重组光敏转录因子原核细菌表达载体构建示意图。上方为不同接头肽重组光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为P⑶FDuetl。图5为以Amp启动子进行表达的含不同接头肽的重组光敏转录因子原核细菌表达载体构建示意图。上方为不同接头肽重组光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为P⑶FDuetl。图6为含以不同VVD突变体、AsL0V2和AuLOV为第二多肽的光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为P⑶FDuetl。图7为含以cl、Lac1、Gal4、和TetR为第一多肽的光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。上方为光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pCDFDuetl。图8为含以ω因子为第三多肽的重组光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。上方为光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为 pCDFDuetl。图9为含以α因子为第三多肽的重组光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为 pCDFDuetl。图10为含有LexA、cl、Lac1、Gal4和TetR相对应反应元件的靶转录单元的原核细菌表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pRSETb。图11为以ω因子或α因子为第三多肽的重组光敏转录因子所对应的含有LexA、cl、LacI> Gal4和TetR相对应反应元件的祀转录单元的原核细菌表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pRSETbο图12为以Cl阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pRSETb。图13为以T7启动子表达不同接头肽的光敏转录因子的JM109(DE3，sulA_，LexA_)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图14为以Amp启动子表达不同接头肽的光敏转录因子的JM109(DE3，SulA_，LexA_)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图15为光敏转录因子LV-LO对LacZ表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为LacZ相对表达水平。图16为光敏转录因子LV-LO对其他三种含LexA相对应反应元件的原核表达载体中mCherry表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图17为在表达以几种VVD突变体的第二多肽的转录因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图18为在表达以Cl、LacI, Gal4、和TetR为第一多肽的转录因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图19为在表达以AsL0V2和AuLOV第二多肽的转录因子的JM109 (DE3, sulA_，LexAO细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图20为在表达以ω因子为第三多肽的转录因子的JM109(DE3，suM—，LexA—)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图21为在表达以α因子为第三多肽的转录因子的JM109(DE3，SulA_，LexA_)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图22为光敏转录因子LV-LO在不同温度条件下对mCherry表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图23为光敏转录因子LV-LO对以cl阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体中mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图24为含光敏转录因子LV-LO和靶转录单元的单表达载体在光照前后mCherry表达量的差异。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图25为了检测含光敏转录因子LaV(Wt)和靶转录单元的原核表达质粒在枯草芽孢杆菌细胞中对mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图26为检测JM109(DE3，sulA_，LexA Amp-LV-LO)菌株自身表达光敏转录因子LV-LO对mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。图27为表达重组光敏转录因子LV-LO的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，表示样品在该时间点由光照转移到黑暗条件，纵轴为mCherry的表达水平。图28为表达重组光敏转录因子LV-LO的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，表示样品在该时间点由黑暗转移到光照条件，纵轴为mCherry的表达水平。图29为在表达重组光敏转录因子LV-LO的细胞中，不同的光照强度对目的基因表达水平的调节。横轴为光照强度，纵轴为mCherry的相对表达水平。图30为用打印图案投影片给表达重组光敏转录因子LV-LO细胞“拍照”得到的“Stop”图案。左图为贴有培养板底部的投影片的照片，右图为克隆长出来后对平板进行成像的荧光图像。图31为表达了重组光敏转录因子LV-LO对细菌移动的调节的白光成像结果，左边为黑暗条件下，右边是光照条件下的，1、2、3代表不同的共转化质粒。图32为表达了重组光敏转录因子LV-LO对细菌细胞裂解的调节结果。横轴为共转化质粒名称，纵轴为细胞的裂解效率。图33为AKTA purifier的离子交换柱洗脱峰图。横轴为洗脱管号，纵轴为紫外吸收值。图34为离子交换柱洗脱后部分管蛋白的12%SDS_PAGE蛋白电泳图。图35为合并后最终蛋白溶液的12%SDS_PAGE蛋白电泳图。图36为6种来自光敏蛋白的不同LOV结构域的同源性分析，其中黑色表示100%相同的氨基酸序列，深灰色表相似性较高的序列，浅灰色表示相似性中等的序列。
具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。实施例中所用的pCDFDuetl质粒载体购自Novagen公司，pRSETb、pBAD/His A质粒载体购自Invitrogen公司，pKD3、pKD4、pCP20、pKD46由华东理工大学鲍杰老师实验室慷慨馈赠。所有用于PCR的引物均由上海杰瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和 dNTP。BamH1、BglI1、HindII1、Nde1、Xho1、Sac1、EcoR1、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆试剂盒(含同源重组酶)购自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。除非特别声明，无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin)购自Ameresco公司；氨节青霉素(Amp)购自Ameresco公司；链霉素购自Ameresco公司；0NPG购自Ameresco公司；384孔发光检测白板、384孔突光检测黑板购自Grenier公司。实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株Machl购自Invitrogen公司。JM109 (DE3)表达菌株购自Promega公司，BL21 (DE3)菌株购自Novagen公司。实施例中用到的主要仪器Biotek Synergy2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司),PCR扩增仪(德国Biometra公司),活体成像系统(美国Kodak公司),光度计(日本和光公司)，核酸电泳仪(申能博彩公司)。缩写词意义如下“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“d”指天，“ μ L”指微升，“ml”指毫升，“L “指升，“bp”指碱基对，“mM”指毫摩尔，“μΜ”指微摩尔。20种氨基酸及简称
权利要求
1.一种原核细菌光诱导基因表达系统，包括a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽和作为光敏结构域的第二多肽；b)革巴转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的包含至少一个反应元件的启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子，及待转录核酸序列。
2.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述第一多肽与第二多肽之间可直接或操作性连接，和/或所述祀转录单元中的所述启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子与所述待转录核酸序列之间可直接或操作性连接。
3.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域，和B3DNA结合结构域。
4.如权利要求3所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述第一多肽选自大肠杆菌LexA DNA结合结构域、λ噬菌体CI阻遏蛋白的DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、Gal4蛋白的DNA识别/结合域、四环素阻遏蛋白TetR的DNA结合结构域、色氨酸阻遏蛋白TrpR的DNA识别/结合域，及其截短体或/和氨基酸序列同源性80%_99%的突变体。
5.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述第二多肽选自含黄素类生色团的光敏蛋白的光敏结构域和含LOV结构域的光敏蛋白的光敏结构域。
6.如权利要求5所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述第二多肽选自粗糙链孢霉菌的VIVID的L0V2结构域、燕麦光敏色素I基因的L0V2结构域AsL0V2和无隔藻金色素蛋白I的LOV结构域AulOV和假单胞菌的LOV结构域PpSBl_L0V及其截短体或氨基酸序列15%-99%相同或氨基酸序列36%-99%相似的突变体。
7.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中还包含招募RNA聚合酶其他组分的第三多肽，所述第三多肽与第一、第二多肽直接或通过接头肽相连。
8.如权利要求7所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述的第三多肽选自大肠杆菌的ω因子、α因子或氨基酸序列36%_99%相似的突变体。
9.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述反应元件为可被所述第一多肽特异性识别和结合的DNA基序,选自LexA结合元件、cl结合元件、LacI结合元件、Gal4结合元件和TetR结合元件。
10.如权利要求1所述的原核细菌光诱导基因表达系统，其中所述的启动子选自大肠杆菌的colE启动子、sulA启动子、recA启动子、umuDC启动子、Iac最小启动子、T7噬菌体的T7启动子、λ噬菌体的012启动子，枯草芽孢杆菌的grac启动子。
11.含有权利要求ι- ο之一所述原核细菌光诱导基因表达系统中所述重组光敏转录因子编码基因和/或所述靶转录单元的原核细菌表达载体。
12.如权利要求11所述的原核细菌表达载体，其中所述靶转录单元中待转录核酸序列空缺。
13.如权利要求12所述的原核细菌表达载体，其中所述重组光敏转录因子编码基因的核苷酸序列选自序列 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、.86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、109 ;氨基酸序列选自序列 49、51、53、55、57、.59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、.107,110ο
14.用权利要求1-10之一所述原核细菌光诱导基因表达系统在原核细菌细胞中调控基因表达的方法，包括步骤a)将所述原核细菌光诱导基因表达系统构建在原核细菌表达载体中；b)引入含被调控基因的原核细菌细胞；和c)光照诱导所述原核细菌细胞，使所述原核细菌细胞中的被调控的核苷酸进行表达。
15.如权利要求14所述的调控基因表达的方法，其中还包括光源的选择和照射方法的选择，所述光源包括LED灯、荧光灯、激光和白炽灯，所述照射方法是持续的光照或不连续的光照。
16.如权利要求14所述的调控基因表达的方法，包括用光扫描、投影、光模具在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。
17.如权利要求14所述的调控基因表达的方法，其中还包括用打印的投影胶片、中性灰度片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。
18.—种试剂盒，装有权利要求11所述原核细菌表达载体或基因组上整合了权利要求1所述表达系统中光敏转录因子表达框的原核细菌菌株，及相应的说明书。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述原核细菌表达载体中待转录核酸序列空缺。
20.权利要求1所述原核细菌光诱导基因表达系统在调节原核细菌的生命活动上的用途，所述生命活动包括细菌的移动、裂解。
全文摘要
本发明提供一种原核细菌光诱导基因表达系统，包括a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽和作为光敏结构域的第二多肽；b)靶转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件的启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子和待转录核酸序列。本发明还提供包含这种光诱导基因表达系统的原核细菌表达载体，和用这种光诱导基因表达系统在原核细菌中调控基因表达的方法，以及装有所述光诱导基因表达系统各组分的试剂盒。本发明的原核细菌光诱导基因表达系统诱导快速、高效且强，比其他诱导剂安全，毒性小或无毒性；它可在时间和空间上控制基因的表达；可用于调节原核细菌的生命活动。
文档编号C12N15/75GK103031327SQ201210274040
公开日2013年4月10日申请日期2012年8月2日优先权日2012年8月2日
发明者杨弋, 陈显军, 马正才, 刘韧玫申请人:华东理工大学