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蝉虫草（蝉花）来源的化合物鉴定与抗菌活性检测

花匠小妙招
2024-11-26 11:29

蝉虫草Cordyceps cicadae (Miq.) Massee（无性期为蝉棒束孢Isaria cicadae Miq.）,俗称蝉花,又称蝘花、蝉茸、土虫草,感染蝉科昆虫蝉若虫时形成的虫菌复合体（罗靖和宋捷民 2007）。多分布在温度区间18-24℃、湿度大于80%的亚热带到热带地区。在我国,常见于江苏、浙江、云南、四川及台湾省等（Zhang et al. 2013）。蝉虫草是我国传统的中药材,有着广泛的药理活性,如提升免疫能力（Weng et al. 2002;金丽琴等 2007;张艳聪等 2017）、改善肾功能（朱戎等 2005;刘玉宁等 2012）、抗肿瘤（Wang et al. 2014a,2014b）和抗氧化（Ren et al. 2014;宋佳敏等 2018）等,其地上部分子实体（或称子座）及地下部分寄主昆虫的尸体（菌核）均可药用。不同于其他种类的广义虫草菌,蝉虫草子实体为无性繁殖体,成熟时会产生大量的分子孢子而非有性生殖及产生子囊孢子（Lu et al. 2017）。

目前为止,人们对于蝉虫草的活性成分仍所知不多。20世纪日本科学家从蝉虫草中分离了活性多糖、腺苷、甘露醇和多球壳菌素（myriocin）（Furuya et al. 1983;Ukai et al. 1983;Fujita et al. 1994）。本世纪我国科学家又从中分离到了环羧酚酸肽、麦角甾醇类、芳香族化合物的甲基葡萄糖苷以及脂肪酸（Zhang & Xuan 2007;Wang et al. 2014a）。其中虫草多糖具有免疫调节活性,由此发挥抗衰老、抗病毒及保护肝功能的作用（Weng et al. 2002;肖朝华等 2011）;多球壳菌素具有较强的抗动脉粥样硬化、抑制肾小球系膜细胞肥大的功能（Ukai et al. 1983）;而细胞膜成分麦角甾醇具有抗肿瘤、免疫调节及抗炎症等重要作用（Wang et al. 2017）。近期,高通量的代谢组分析表明,不同发育时间的蝉虫草中没有检测到多球壳菌素（Lu et al. 2017）。抗菌作用是众多生理活性中研究最普遍的活性之一（Dai et al. 2009）。蝉虫草的活性成分组成及其抗菌等不同活性仍需要深入分析。

本研究以蝉虫草子实体为材料,充分研磨后经乙酸乙酯提取、分离得到3种成分,即不饱和酮酸(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid（1）、麦角甾醇ergosterol（2）和白僵菌酮bassiatin（3）。针对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌活性试验表明,不同化合物对细菌或病原真菌具有程度不同的抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

1.1.1 实验材料：蝉虫草子实体样品由上海泛亚生物医药股份有限公司提供,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli和人类病原真菌白色念珠菌Candida albicans均为实验室保藏菌种。实验使用培养基包括：LB固体培养基（胰蛋白胨,酵母提取物,氯化钠,琼脂粉）;YPD固体培养基（酵母提取物,蛋白胨,葡萄糖,琼脂粉）;MH（mueller-hinton broth）肉汤培养基;萨氏葡萄糖培养基（Sabouraud dextrose broth,SDB）。

1.1.2 试剂与主要设备：甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷等均为分析纯试剂,氘代甲醇、氘代氯仿（美国CIL稳定性同位素公司）,乙腈（安谱实验科技股份有限公司）,超纯水（密理博上海贸易有限公司）,Sephadex LH-20（Amersham Biosciences）,200-300目硅胶（上海易利生化试剂有限公司）,十八烷基硅烷键合硅胶（ostadecylsilane,ODS;加拿大Silicycle公司）。

实验中使用的仪器包括：超声清洗机（Scienti SB-5200 DTD）、恒温培养箱（Vazyme MGC-350HP-2）、高速离心机Eppendorf centrifuge（New Brunswick 5415R）、HPLC液相色谱（Shimadzu LC-20AD）、分析柱Shimadzu intertsil ODS-3（C18,5μm,4.6mm×250mm）、LC-MS液质联用仪（Agilent 1200 HPLC tandem 6520 Q-TOF mass spectrometry）、NMR核磁共振仪（Bruker-Avance-500-spectrometer）和真空浓缩仪（Martin Christ RVC-2-25）。

1.2 成分萃取、分离与鉴定

取蝉虫草子实体粉末约4kg,经10L乙酸乙酯浸泡超声提取3次,每次2h。过滤、减压浓缩后,得粗提物65g,经硅胶柱层析初步分离、Sephadex LH‐20凝胶柱、ODS柱层析再分离,最后由高效液相色谱HPLC分离纯化后,利用LC-MS液质联用仪与核磁共振仪NMR进行结构鉴定。

1.3 抗菌活性检测

利用微量肉汤稀释法检测不同化合物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抗菌活性,测定化合物的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）（燕心慧等 2016）。以甲醇为溶剂制备每个化合物的母液,倍比稀释,得到一系列浓度的待测液。分别取10μL待测药液加入96孔板的1-10号孔中,11号孔为阴性对照（只加化合物不加菌液）,12号孔不加化合物作为生长对照。以氨苄青霉素（ampicillin,抑制细菌）和制霉菌素（nystatin,抑制真菌）处理组作为阳性对照,每组药物重复3次。将供试菌种接种到相应的固体培养基上,24h后,挑取单菌落接种到相应液体培养基中,于37℃、180r/min下在恒温摇床培养12h,用MH肉汤（细菌）或沙氏肉汤（真菌）稀释至105cfu/mL,取100μL的菌液加入到96孔板中,使试验菌与药液能充分接触,1-10号孔的药液终浓度依次为128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50和0.25μg/mL。密封后置于37℃的普通培养箱中,孵育20h。以培养基不发生浑浊变化的药物浓度作为该化合物对病原菌的最低抑菌浓度MIC。

2 结果与分析

2.1 化合物分离

蝉虫草接种米饭或小麦培养基,约25d后可形成成熟的子实体（图1A）。实验用蝉虫草子实体充分研磨后经乙酸乙酯提取,获粗提物65g。经200-300目硅胶柱层析,先以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱（100:0-0:100,V/V）,继以二氯甲烷:甲醇梯度洗脱（100:0-0:100,V/V）,等分法接样,通过薄层层析检测合并馏分,得到Fr. C1-Fr. C18组分。Fr. C9（4.2g）经ODS柱色谱,甲醇-水梯度洗脱（60:100-100:0,V/V）,得到Fr. C9A-Fr. C9F组分。Fr. C9B经RP-HPLC再分离（A:乙腈/B:水,流速4mL/min,0-20min,15%-100% A;20-30min,100%-100% A;30-32min,100%-15% A;32-40min,15%-15% A）分离得到化合物1（3.3mg）。Fr. C9F经RP-HPLC分离（乙腈/水,90:10,V/V）纯化得到化合物3（4.5mg）。Fr. C14经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇/水,85:15,V/V）分离得到化合物2（5.7mg）。

图1 蝉虫草米饭培养子实体形态（A）及其分离化合物的结构（B）

Fig. 1 Fruiting body of Cordyceps cicadae cultured on a rice medium (A) and the structures of three compounds isolated from fruiting bodies (B).

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2.2 结构鉴定

化合物1：无色油状（甲醇）。HR-ESI-MS：m/z [M-H]- 293.2（calcd for C18H29O3,293.2273）。 1H-NMR（500MHz,CD3OD）：δ 7.25（1H,m,H-11）,6.28（2H,m,H-12,13）,6.14（1H,d,J = 15.3Hz,H-10）,2.61（2H,t,J = 7.3Hz,H-8）,2.29（2H,t,J = 6.7Hz,H-2）,2.05（2H,s,H-14）,1.61（4H,m,H-3,7）,1.31-1.36（12H,m,H-4,5,6,15,16,17）,0.93（3H,t,J = 6.9Hz,H-18）;13C-NMR（125MHz,CD3OD）：δ 202.5（C-9）,176.3（C-1）,145.9（C-13）,143. 9（C-11）,128.9（C-12）,127.4（C-10）,39.6（C-8）,33.5（C-2）,32. 7（C-14）,31.2（C-16）,28. 8（C-6）,28.7（C-5）,28.4（C-4,15）,24.6（C-3）,23.9（C-7）,22.1（C-17）,12. 9（C-18）。以上波谱数据与Kawagishi et al.（2002）的报道一致,确定化合物1为不饱和酮酸(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid（图1B）。

化合物2：黄色晶体（乙酸乙酯）。HR‐ESI‐MS：m/z[M-H]- 395.6（calcd for C28H43O,395.6467）。1H-NMR（500MHz,CDCl3）：δ 5.59（1H,m,H-6）,5.41（1H,m,H-7）,5.22（2H,dd,J = 11.0,7.0Hz,H-22,23）,3.66（1H,m,H-3）,1.06（3H,d,J = 6.6Hz,H-21）,0.97（3H,s,H-19）,0.94（3H,d,J = 6.8Hz,H-28）,0.86（3H,d,J = 7.1Hz,H-27）,0.85（3H,d,J = 7.3Hz,H-26）,0.65（3H,s,H-18）;13C-NMR（125MH,CDCl3）：δ 141.4（C-5）,139.8（C-8）,135.6（C-22）,132.0（C-23）,119.6（C-6）,116.3（C-7）,70.5（C-3）,55.8（C-17）,54.6（C-14）,46.3（C-9）,42.9（C-24）,42.8（C-13）,40.8（C-4）,40.4（C-20）,39.1（C-12）,38.4（C-1）,37.0（C-10）,33.1（C-25）,32.0（C-2）,28.3（C-16）,23.0（C-15）,21.1（C-26）,21.1（C-11）,20.0（C-27）,19.7（C-21）,17.6（C-28）,16.3（C-19）,12.1（C-18）。以上波谱数据与Vladimir et al.（1997）的报道一致,确定化合物2为麦角甾醇ergosterol（图1B）。

化合物3：黄色油状（甲醇）。HR‐ESI‐MS：m/z[M+H]+ 262.1（calcd for C15H20NO3,262.1473）。1H-NMR（500MHz,CD3OD）：δ 7.37（2H,m,H-13,H-15）,7.35（1H,m,H-14）,7.18（2H,m,H-12,H-16）,4.64（1H,t,J = 4.3Hz,H-3）,3.33（1H,dd,J = 14.0,4.8Hz,H-10a）,3.27（1H,dd,J = 14.0,4.0Hz,H-10b）,3.05（3H,s,H-17）,3.01（1H,d,J = 2.2Hz,H-6）,2.24（1H,m,H-7）,0.83（3H,d,J = 7.1Hz,H-8）,0.76（3H,d,J = 6.8Hz,H-9）;13C-NMR（125MHz,CD3OD）：δ 167.6（C-2）,166.0（C-5）,134.9（C-11）,129.6（C-12,16）,128.7（C-13,15）,127.7（C-14）,80.7（C-6）,62.3（C-3）,36.4（C-10）,31.3（C-17）,29.4（C-7）,17.5（C-8）,14.0（C-9）。以上波谱数据与Kagamizono et al.（1995）的报道一致,确定化合物3为白僵菌酮bassiatin（图1B）。

2.3 抗菌活性检测

抗菌试验表明,化合物1-3对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌均具有明显的抑菌活性。相对于氨苄青霉素,化合物1-3抗大肠杆菌的MIC值要低4-8倍;对于枯草芽孢杆菌,3个化合物均表现抗菌活性,但它们的MIC值高于氨苄青霉素,尤其是化合物3的相对抑菌活性最低。抗真菌活性测定表明,化合物1、3对白色念珠菌有显著的抑菌活性,这2个化合物的MIC值同制霉菌素相同或偏高。不奇怪的是,作为真菌细胞膜成分的麦角甾醇2对白色念珠菌没有表现出抑菌活性（表1）。

表1 化合物1-3抑菌活性测定

Table 1 Antimicrobial activity assays of the compounds 1-3

化合物
Compounds 最低抑菌浓度Minimal inhibitory concentration (μg/mL) 大肠杆菌Escherichia coli 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 白色念珠菌Candida albicans 制霉菌素Ampicillin 32 2 - 氨苄青素Nystatin - - 8 化合物1 Compound 1 8 4 8 化合物2 Compound 2 4 8 >128 化合物3 Compound 3 8 32 16

3 讨论

本文以蝉虫草子实体为材料,利用色谱学方法,从中分离到了3种具有抗菌活性的成分,分别是不饱和酮酸(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoicacid（1）、麦角甾醇ergosterol（2）和白僵菌酮bassiatin（3）。化合物1曾从大型真菌棒柄杯伞Clitocybe clavipes中被分离报道（Kawagishi et al. 2002）。本研究为首次从蝉虫草中发现该化合物。据报道,该不饱和酮酸可以抑制乙酰CoA羧化酶的活性,可能通过与半胱氨酸巯基共价结合来抑制酶活（Kawagishi et al. 2002）。韩国科学家还曾报道,该不饱和脂肪酸具有抗黑色素形成的功能（Kim et al. 2010）。抗菌活性测定表明,化合物1对细菌和真菌都表现出明显的抑菌活性,这可能因为不饱和脂肪酸及其衍生物可作用于微生物细胞膜,引起电子传递链中断、细胞内容物溶出、氧化磷酸化解偶联,同时也可抑制胞内酶活性,减弱细胞对营养物质的吸收利用;也可通过自身过氧化、自动氧化反应产生的H2O2以及活性氧杀死细菌（Kim et al. 2010）。该化合物的合成及活性机理还需要进一步研究。

化合物2麦角甾醇是常见的真菌细胞膜成分之一,在生物体内有多种存在形式,是维生素D2的前体物质,能够有效促进钙的吸收,并具有抗氧化、降胆固醇和预防心脏病等功效（Shu & Lin 2011）。我国科学家曾在蝉虫草发酵产物中分离到了8种麦角甾醇类化合物（Wang et al. 2017）,进一步证明了该类化合物是蝉虫草主要的药效成分之一。

白僵菌酮3最早在白僵菌中分离得到,活性研究表明其具有抗血小板凝集的功能（Kagamizono et al. 1995）。白僵菌酮被认为是迭代型非核糖体肽白僵菌素（beauvericin）合成过程中形成的非迭代副产物,D-2-羟基异戊酸和L-苯丙氨酸形成脂肽,经3次迭代然后环合形成白僵菌素,而未经迭代的脂肽中间产物直接环化,形成白僵菌酮（Xu et al. 2009）。基于蝉虫草基因组的次级代谢基因簇研究表明,该菌具有白僵菌素合成基因簇（Lu et al. 2017）,为在该菌中发现白僵菌酮提供了佐证。白僵菌酮具有与白僵菌酮A（bassiatin A）类似的药理作用,是一种血小板聚集抑制剂,对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集有明显的抑制作用（IC50= 0.19mmol/L）（Kagamizono et al. 1995）。本研究表明,白僵菌酮对于细菌和真菌均有较好的抑制作用,丰富了该化合物的活性范围。

对蝉虫草的基因组分析表明,其基因组中非核糖体多肽合成酶（non-ribosomal peptide synthase,NRPS）、聚酮合成酶（polyketide synthase,PKS）、NRPS-PKS杂合酶和萜类合成酶（terpene synthase）等次级代谢基因簇达34个,相比同样作为传统中药材的近缘种蛹虫草C. militaris具有更多的次级代谢合成基因簇（Zheng et al. 2011;Lu et al. 2017）。我们前期的代谢组分析发现,蝉虫草可以合成原来没有报道到过的具有药理活性的不同小分子,如cordysinin A、fumimycin和lichenicolin A,以及其他一些未知的次级代谢产物（Lu et al. 2017）。由此可见,蝉虫草作为中国传统的中草药,其药理活性物质尚有待进一步发掘。另一方面,与使用人工培养基培养相比,蚕蛹培养的蝉虫草子实体中次级代谢产物基因簇表达量明显上调（Lu et al. 2017）。因此,未来对蝉虫草活性成分的研究可以使用昆虫寄主进行培养,结合基因表达信息和基因缺失等实验研究,将有利于发现更多新型的活性产物,从而为蝉虫草来源的新型化合物鉴定及药理活性研究提供新资源。

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