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西番莲种质资源花粉活力鉴定方法探究

花匠小妙招
2024-11-27 01:10

0. 引言

【研究意义】西番莲属（Passiflora）是西番莲科（Passifloraceae）中最重要的经济物种，有630多个种[1]，它们主要分布于美洲的巴西和哥伦比亚，少量分布于其他热带、亚热带地区[2,3]。西番莲属植物在花、叶、果实形态及抗性等方面具有丰富的遗传多样性[4]，如蓝冠西番莲（Passiflora caerulea）花瓣为浅绿色，开花性能强，果实金黄色，其植株根部分蘖性强，适合盆栽观赏；香蜜西番莲（Passiflora alata）花色艳丽，花朵气味浓郁，果实如木瓜大小，具有潜在的商品价值；红花西番莲（Passiflora alata Aubl）植株叶片密被绒毛，不易受到病虫害，花朵为大红色，具有较好的观赏价值。目前，国内对西番莲种质资源的开发与利用较少，种间杂交是选育新品种的重要来源之一，不同物种的种间的杂交亲和性存在差异性，如文心兰属普遍存在内种间杂交及属间杂交不亲和性及花粉管生长受阻等现象[5]，西番莲种质之间自交亲和性差异较大，如紫果型台农1号为自交亲和品种，而黄果型H6为自交不亲和类型，在花粉在柱头表面萌发会产生胼胝质，导致花粉管不能正常生长[6]。此外。花粉活力、柱头黏性、花粉壁蛋白与柱头的识别作用、花粉管生长情况与物种间的基因型是否接近等都会影响种间杂交的成功率[7]，而花粉活力的高低是影响杂交育种成功率的首要因素，花粉活力低会导致柱头表面的花粉萌发率降低，从而进一步影响授粉受精过程[8]。西番莲种质资源丰富，通过对西番莲属植物花粉活力研究，建立花粉活力快速检测方法以及最佳花粉贮藏条件，能为后续西番莲种质资源花粉活力鉴定、保存与种质创新提供理论基础。【前人研究进展】染色法和离体培养法是测定植物花粉活力的常见方法，由于染色法快速便捷而被广泛应用于各种植物中，例如TTC染色法用于测定枸杞、香榧花粉活力[9,10]，I2-KI染色法测定思茅松花粉活力[11]，亚历山大染色法可用于快速检测卵叶海桑花粉活力[12]；离体萌发法为花粉提供的萌发条件，被认为与花粉在柱头上萌发的条件较为接近，是花粉活力测定最为可靠和稳定的方法，但存在最佳培养条件的筛选也相对复杂，观测时间较长的问题[13]。目前对于西番莲花粉培养基组分的研究相对较少，小黄金百香果花粉培养的最适浓度为20% 蔗糖和6% H3BO3；大黄金百香果花粉最适培养基为100.00 g·L−1 蔗糖+0.02 g·L−1 H3BO3+0.40 g·L−1 Ca(NO3)2，其花粉在自然风干5 h后于4 ℃环境下贮藏花粉活力最佳[14,15]。【本研究切入点】目前国内对西番莲种质资源的花粉离体培养的相关研究较少，现有报道只针对单一栽培品种进行探究，且花粉的离体培养时间较长，不利于种质资源的快速鉴定评价，对筛选西番莲属植物的花粉染色法与最佳贮藏条件的研究还有待进一步研究。【拟解决的关键问题】以翅茎西番莲种香蜜，西番莲种蓝冠、白花，鸡蛋果种钦蜜9号、台农、雅蜜等6个西番莲种质资源为试验材料，探究蔗糖、H3BO3、Ca(NO3)2、PEG-4000等因素对花粉离体萌发的影响，以筛选出西番莲属植物最适通用花粉培养基、花粉离体萌发最佳观测时间、筛选出西番莲属植物花粉最适快速花粉活力检测法与花粉最佳贮藏条件。

1. 材料与方法

1.1 材料

供试材料为蓝冠、白花、香蜜、钦蜜9号、雅蜜和台农西番莲，于2023年10～11月采自福建省特色果树种质西番莲资源圃（26°12'69'' N，119°33'79'' E）。于植株盛花期采样，每份种质选取健康植株10株，采集当天即将开放的花朵，每株3朵，共计30朵。将采集到的花朵迅速插于盛满清水的锥形瓶中，带回实验室培养，待花药开裂后，用镊子取下花药密封于离心管中，用于后续试验。

1.2 方法 1.2.1 正交试验设计

以200 mg·L−1 MgSO4·7H2O+100 mg·L−1 KNO3（pH值5.5）为基本培养基，设计蔗糖（A）、H3BO3（B）、Ca(NO3)2（C）和PEG-4000（D）等4个因素，每个因素设计5个浓度水平（表1），进行4因素5水平正交试验，共计25个组合。

表 1 正交因素及水平

Table 1. Orthogonal factors and levers

水平
Level A.蔗糖
Sucrose /（g·L−1）
B.H3BO3/
（g·L−1） C.Ca(NO3)2/
（g·L−1） D.PEG-4000/
（g·L−1） 1 0 0 0 0 2 50 0.01 0.01 50 3 100 0.02 0.02 100 4 150 0.03 0.03 150 5 200 0.04 0.04 200 1.2.2 花粉离体培养

利用移液枪吸取培养基滴于凹面载玻片中心，用授粉笔将钦蜜9号干燥花粉散播于培养基上，立即盖上盖玻片，再将载玻片放置在含有湿润滤纸的培养皿中，置于人工气候培养箱中，25 ℃黑暗培养3 h，镜检观察花粉萌发情况。

1.2.3 最佳培养时间筛选

将钦蜜9号花粉在最佳培养基上进行离体培养。培养1 、2 、3 h后使用光学显微镜（Nikon Digital Sight 10，日本）拍照记录花粉活力。

1.2.4 花粉萌发率与花粉管长度测量

每个处理3次重复，观察花粉总数不少于300粒。用光学显微镜（Nikon Digital Sight 10，日本）拍照记录。每重复取20个花粉管，使用Nikon软件中折线测量工具测量其长度。

花粉萌发率/%=（已萌发花粉粒数/花粉粒总数）×100；

花粉管长度=测量得到的所有花粉管总长度（μm）/花粉粒数。

1.2.5 花粉染色法

分别采用亚历山大染色液（索莱宝，中国）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC染液（索莱宝，中国）和I2-KI染色液[16]等3种染色液进行花粉染色测定西番莲花粉活力。其中，由于I2-KI染色法对不同种质西番莲花粉染色差异不明显，以着色深浅计算花粉活力。

花粉染色率/%=（已染色的花粉粒数/花粉粒总数）×100。

1.2.6 贮藏方法

将密封了花药的离心管分别置于25、4、−20、−80 ℃的温度下分别贮藏0 、3 、6 、12 、24 、48 、168 h。取出离心管后置于室温15 min后，将花粉散播于最适培养基上培养，25 ℃黑暗条件培养1 h后测定花粉萌发率。

1.3 数据分析

利用Graph Prism 9.0软件处理数据并绘图。采用SPSS 26.0软件进行方差分析。

2. 结果与分析

2.1 最佳培养基筛选

通过4因素5水平正交试验筛选钦蜜9号花粉萌发的最佳培养基，花粉培养3 h后统计花粉萌发率及花粉管萌发长度。试验结果显示（表2），4个因素的极差值（R值）大小依次为D＞A＞B＞C，R值大小反应4个因素的影响强度，由此可知，因素D（PEG-4000）的水平变动对试验结果影响最大。方差分析结果可知（表3），蔗糖（因素A）和PEG-4000（因素D）对钦蜜9号花粉离体萌发率均具有极显著影响，H3BO3（因素B）和Ca(NO3)2（因素C）影响不显著。结合花粉萌发率与花粉管萌发长度，发现组合A3B5C2D4的萌发率最高（85.56 %），花粉管长度均值为157.36 μm，为最佳组合，即最适培养基为：100 g·L−1 蔗糖+0.04 g·L−1 H3BO3+0.01 g·L−1 Ca(NO3)2+150 g·L−1 PEG-4000+200 mg·L−1 MgSO4·7H2O+100 mg·L−1 KNO3，pH值5.5。

表 2 钦蜜9号花粉离体培养基筛选的L25（54）正交试验设计

Table 2. L25(54) orthogonal experimental design for culture medium of passion fruit pollens

编号
No. 因素
Factors 萌发率
Germination rate/% 花粉管长度
Pollen tube length/μm A B C D 1 1 1 1 1 0 j — 2 1 2 2 2 13.81±1.88 i 158.5±4.03 ab 3 1 3 3 3 48.25±3.12 g 152.92±2.73 ab 4 1 4 4 4 64.50±1.68 f 126.24±5.96 e 5 1 5 5 5 75.53±3.07 bcde 108.29±10.29 f 6 2 1 2 3 69.11±11.13 def 147.43±4.46 bc 7 2 2 3 4 79.85±1.03 abc 132.59±8.86 de 8 2 3 4 5 63.65±4.68 f 109.89±5.34 f 9 2 4 5 1 12.99±2.23 i 150.65±13.17 b 10 2 5 1 2 72.26±1.83 cdef 167.15±4.46 a 11 3 1 3 5 45.95±0.61 g 143.76±7.77 bcd 12 3 2 4 1 0 j — 13 3 3 5 2 76.99±5.37 abcde 126.75±5.77 e 14 3 4 1 3 67.23±7.08 f 134.33±12.72 cde 15 3 5 2 4 85.56±1.82 a 157.36±4.01 ab 16 4 1 4 2 6.5±3.04 ij — 17 4 2 5 3 28.73±17.87 h 124.43±12.31 e 18 4 3 1 4 83.08±3.5 ab 120.2±3.76 ef 19 4 4 2 5 0.27±0.47 j — 20 4 5 3 1 0.18±0.17 j — 21 5 1 5 4 0.54±0.47 j — 22 5 2 1 5 1.03±0.4 j — 23 5 3 2 1 0 j — 24 5 4 3 2 1.66±2.88 j — 25 5 5 4 3 25.94±3.2 h 158.54±9.45 ab k1 40.42 24.42 44.72 2.63 k2 59.57 24.68 33.75 34.24 k3 41.64 54.40 34.53 47.85 k4 23.75 29.33 32.12 62.71 k5 5.83 51.89 38.96 37.29 R 53.74 29.98 12.60 60.08 数据表示为平均值±标准差。同列数据用不同小写字母标识表示在0.05水平差异显著。
Data are represented as mean ± standard deviation; those with different lowercase letters on same column indicate significant differences at P＜0.05.

表 3 钦蜜9号离体萌发率方差分析结果

Table 3. Variance analysis on in vitro germination rate of Qinmi 9

变异来源
Source of variation III 类平方和
Class III sum of squares 自由度
Degree of freedom 均方
Mean square F 显著性
Significance（P）蔗糖
Sources 9986.344 4 2496.586 8.365 0.006** H3BO3 4465.681 4 1116.420 3.740 0.53 Ca(NO3)2 505.625 4 126.406 0.424 0.788 PEG-4000 9836.241 4 2459.06 8.239 0.006** 误差
Error 2387.782 8 298.473 **表示在0.01水平差异极显著。
**indicates extremely significant difference at 0.01 level. 2.2 花粉离体萌发最佳观测时间筛选

将花粉在最适培养基上进行花粉离体培养，观察培养时间对花粉萌发率的影响。试验结果（图1）显示培养1 、2 、3 h的花粉萌发率无显著差异。图1-B为花粉离体萌发图，第4 h时花粉管相互缠绕，不便于观测，因此花粉离体培养1 h后可进行拍照镜检，有利于提高试验效率。

图 1 花粉离体培养时间对花粉萌发率的影响

A：不同时期花粉萌发率；B：a、b、c、d分别代表1、2、3、4 h等花粉萌发观测结果。

Figure 1. Effect of culture time on pollen germination rate

A: pollen germination rate at different times. B: a, b, c, and d represent observed results on pollen germination at 1, 2, 3, and 4 h, respectively.

2.3 最佳花粉活力快速检测法筛选

利用6份种质的西番莲花粉筛选最佳的花粉活力快速检测法。花粉染色效果如图2所示，3种活力快速检测法均能使所有种质的花粉着色。I2-KI染色法是利用淀粉遇碘变色的原理，同时变色情况受淀粉中直链淀粉和支链淀粉比例的影响，直链淀粉遇碘变蓝色，支链淀粉遇碘变紫红色[17]。I2-KI染色法对西番莲花粉的染色时间为10 min，花粉均呈现深棕色或浅棕色，但有活力的花粉与无花粉的色差不明显，无法清晰快速判断花粉活力；TTC染色法是靠呼吸作用产生的NADH2或NADPH2使花粉着色，对西番莲花粉染色时间为30 min，有活力花粉呈现红色或淡红色，失活花粉呈现浅绿色，且花粉管在该染色液中能离体萌发，花粉活力观测便捷准确；亚历山大染液是利用酸性染料与细胞中的碱性成分发生化学反应，形成一种紫红色的染色体色素，对西番莲花粉的染色时间为15 min，染色颜色深，有活力花粉呈紫红色，无活力或者发育不良花粉呈浅红色。

图 2 不同方法检测西番莲花粉活力镜检效果。

A：蓝冠；B：白花；C：香蜜；D：雅蜜；E：钦蜜9号；F：台农。

Figure 2. Microscopic examinations on passion fruit pollen viability detected by different methods

A: Blue Crown; B: White Flowers; C: Xiangmi; D: Yami; E: Qinmi 9; F: Tainong.

花粉离体萌发法以其长度大于花粉粒直径的花粉为有活力花粉，目前被认为是最可靠的检测花粉活力的方法[18]。在筛选出最适培养基上，6份西番莲种质资源的花粉在此培养基上均有较好的萌发状态（图2）。表4结果显示，钦蜜9号的萌发率最高，为79.76%，蓝冠的萌发率最低，为60.79%。以花粉离体萌发率为依据来判定，不同染色法所测得的花粉染色率的准确性。由表4可知，TTC染色法中台农、钦蜜9号、雅蜜、蓝冠、白花、香蜜的活力测定结果与离体萌发率无显著性差异；除台农以外的5个种质的亚历山大染色法结果均高于离体萌发结果，与离体萌发结果有一定差异性。I2-KI染色法对所有花粉染色均为棕褐色，且不同西番莲种质资源的花粉活力均无显著性差异，而亚历山大染色法所测定的活力均偏高，因此认为不适合西番莲种质活力测定。综上，根据染色效果与染色活力，认为TTC快速活力检测法可以快速有效地检测西番莲属植物。

表 4 不同方法检测的西番莲花粉活力

Table 4. Passion fruit pollen viability detected by different methods

种质
Germplasm 染色率
Staining rate/% 离体萌发率
In vitro
germination
rate/% I2-IK TTC 亚历山大
Alexandria 台农
Tainong 83.83±3.76 a 67.69±5.29 a 81.19±2.78 a 74.13±2.89 a 钦蜜9号
Qinmi 9 81.79±7.75 b 70.29±4.47 b 97.95±1.14 a 79.76±7.80 b 雅蜜
Yami 87.85±3.22 b 69.97±5.92 c 95.42±2.16 a 63.71±2.84 c 白花
White Flowers 84.32±7.73 b 77.41±6.33bc 97.22±1.89 a 63.7±1.00 c 蓝冠
Blue Crown 80.41±3.26 a 64.85±4.41 b 78.50±5.28 a 60.79±4.61 b 香蜜
Xiangmi 84.32±7.70 b 63.78±1.11 c 98.75±1.88 a 71.34±6.97 c 数据表示为平均值±标准差，同行数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
Data are mean±SD; those with different lowercase letters on same row indicate significant difference at 0.05 level. 2.4 花粉贮藏温度与时间

在上述结果中钦蜜9号花粉的活性最高，因此以钦蜜9号花粉为材料探究不同温度贮藏对花粉活力的影响。结果（图3）表明在4种贮藏温度下，在0～24 h内，钦蜜9号花粉萌发率均迅速下降。贮藏24 h时，25 ℃的花粉萌发率最高（30.48 %），与4 ℃萌发率无显著差异（26.69%）；−80 ℃下花粉萌发率在贮藏3 h后下降至2.47%且12 h之后花粉失活；−20 ℃条件下，贮藏6 h后花粉萌发率下降至13.4%，贮藏12～24 h，花粉萌发率极低；在贮藏48 h后，25 ℃、−4 ℃和−80 ℃等贮藏温度下的花粉全部失去萌发力，4 ℃贮藏温度下的花粉仍然有26.76%的萌发率，与其他贮藏温度具有显著性差异，在第7天再次检测4 ℃贮藏温度下的花粉活力，为29.08%，与贮藏在4 ℃温度下48 h的花粉萌发率无显著差异。综上，贮藏时间在24 h以内，25 ℃是钦蜜9号花粉的最适贮藏温度；贮藏时间1～7 d内，4 ℃为钦蜜9号花粉的最适贮藏温度。

图 3 钦蜜9号不同贮藏温度下花粉萌发率的变化

不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

Figure 3. Germination rates of Qinmi 9 pollens stored under different temperatures

Data with different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.

3. 讨论

花粉离体萌发受到培养基组分影响较大，蔗糖是花粉离体萌发提供营养的物质，同时还有调节渗透势的作用[19]，适宜的蔗糖浓度对花粉萌发有一定的促进作用。本试验中适合西番莲花粉萌发的蔗糖含量为10%，当蔗糖含量过高时会导致培养基中的渗透压升高，花粉离体萌发率显著下降，这可能导致花粉失水、细胞质壁分离和花粉管破裂等现象，从而抑制花粉离体萌发。硼酸是花粉萌发和花粉管生长的关键物质，可以促进糖的吸收、转运和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，并参与果胶物质的合成。在对青海云杉花粉研究中发现低硼条件下，花粉萌发率为18%～24%，而标准条件下的花粉萌发率为61%[20]，缺硼条件下会导致培养的花粉管顶端出现大量的愈伤组织积累，导致花粉管不能正常萌发，因此萌发率降低。本试验研究中，在低硼的条件下大部分组合的钦蜜9号花粉萌发率均在10%以下，而硼含量在0.03 g·L−1时，花粉萌发率都在60%以上。Ca2+是调控花粉管极性生长的重要因子，前人研究认为0.05 g·L−1的钙离子对花粉管的萌发具有一定促进作用[21]。PEG-4000是一种非渗透性渗透剂，可以降低培养基水势[22]。不同分子量的聚乙二醇酯也被应用于其他物种的花粉培养中，并且大部分均对花粉管的生长有促进作用[23−25]。在花粉中，PEG-4000具有调节质膜的通透性的功能，能够维持花粉管膜的稳定[25]。在钦蜜9号离体萌发试验中发现PEG-4000可以有效提高花粉萌发率。从极差分析结果表明PEG-4000对试验结果影响因素较大，当PEG-4000浓度为0时，钦蜜9号花粉几乎不萌发，浓度太高时会导致花粉萌发率显著下降，说明PEG-4000是西番莲花粉萌发所需的重要物质。

目前，花粉染色法被广泛应用于不同物种的花粉活力检测中[9,26,27]。花粉活力快速测定与花粉自身特性有关，如花粉壁厚度、酶活性和花粉营养物质等都会影响花粉活力的快速检测结果[28]。在I2-KI染色法试验中发现6个种质西番莲花粉染色均呈褐黑色、黄褐色，可能与染液的颜色加上直链淀粉变蓝及支链淀粉变紫红色叠加呈现的颜色有关，导致无法清晰快速判断花粉是否有活力。亚历山大染色法适用于在野外对卵叶桑树花粉活力进行快速检测[12]，但本试验中发现亚历山大染色法与离体萌发法相比偏高，可能是与西番莲的花粉细胞壁的厚度较薄，染色剂更容易渗透，导致花粉染色率较高，因此不适用于西番莲花粉活力检测。TTC染色法在花粉活力被广泛应用，如钝裂银莲花、毛叶铁线莲花粉活力最适的检测法为TTC染色法[29,30]。本研究中，TTC染色法对6份西番莲种质资源花粉染色效果较好，且与离体萌发法的检测结果较为一致。综上，认为TTC染色法是有效的快速检测西番莲属花粉活力的方法。

探究测定西番莲花粉活力、花粉的最佳储藏条件以及储藏过程中花粉活力变化是为了便于后续的人工授粉及杂交育种。本试验中，钦蜜9号花粉在不同温度贮藏3 h后，其中−20 ℃与−80 ℃温度下花粉活力迅速下降，所以在低温环境下不适合西番莲花粉贮藏，这可能与西番莲花粉内含水量有关，低温容易让细胞内细胞水分凝结，导致花粉失去萌发力。24 h之内25 ℃贮藏温度下花粉活力高于4 ℃温度，48 h后，25 ℃贮藏温度下花粉活力直线下降，而4 ℃条件下，0～24 h的花粉活力无显著差异。有研究发现在常温状态下，西番莲在开花3 h后花粉活力最高，9 h后花粉活力仅为10.63%，20 h后花粉无活力[31]。在本试验中，短时间授粉可将花粉贮藏于25 ℃环境中，但是之后受到温度的影响，花药会褐化、干枯，花粉存在脱水现象，而在4 ℃条件下对钦蜜9号花粉贮藏条件下花粉一周以内不会褐化，且在第7 天仍有29.08%的花粉萌发率。因此长时间下4 ℃温度贮藏条件更优，这与前人研究结果相一致[14]。对于花粉贮藏条件的探究由于样品较少，只探究了温度与贮藏时间的影响，有关对于光照、湿度等环境影响还有待进一步探究。

4. 结论

本研究以6份西番莲种质资源为试验材料，得到了一种通用的西番莲属花粉离体萌发培养基组合，6份西番莲种质资源在此培养基上萌发率均在60%以上，而对离体萌发的最佳观测时间也进行优化，缩短至1 h，利于提升鉴定花粉活力的效率。TTC染色法是最佳检测西番莲花粉活力的方法，适合田间快速检测花粉活力。对花粉贮藏条件的研究，在24 h以内，花粉可以贮藏在25 ℃条件下，用离心管密封，在1 ～7 d的最佳贮藏条件为4 ℃离心管内密封贮藏。目前，国内对西番莲种质资源研究相对匮乏，本研究通过探究西番莲花粉活力快速检测方法以及花粉贮藏条件，为筛选优良的种质资源花粉提供理论依据。在对今后的西番莲种质资源研究中，可围绕西番莲属鸡蛋果种为核心，展开西番莲属植物的种质创新和杂交育种研究。