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土壤强还原处理对植烟土壤真菌群落结构及烤烟产质量的影响

花匠小妙招
2024-11-29 11:37

魏光钰，胡勇，吴永琴，张清壮，李鑫

（1. 贵阳市烟草公司清镇市分公司，贵州清镇 551400；2. 湖南省农业科学院，湖南长沙 410125）

烤烟产业健康可持续发展与植烟土壤质量以及土壤微生态环境息息相关。土壤微生物主要参与植物养分的循环利用、土壤结构的维持以及农用化学品的降解等过程[1]。有研究表明，土壤中微生物的组成与功能决定了植物的生存状况[2]以及发病率[3]。健康的微生态系统对作物生长至关重要。土壤微生物组成单一以及病原菌富集是土壤连作障碍的主要成因[4-5]。烤烟连续种植以及化肥的大量施用，往往导致植烟土壤质量劣变[6]、有害微生物数量增加[7]、烤烟产量下降[8]等问题。因此，研究安全有效的土壤消毒技术是保障烤烟产业健康可持续发展的有利举措。

土壤强还原处理（RSD）是通过向土壤中添加易降解的有机物，灌水、覆膜，在短时间内形成厌氧、强还原以及高温的环境，产生挥发性气体、有机酸等各类物质，有效杀灭病原菌，重新组建微生物群落的方法[9]。王宝英等[10]通过向土壤中添加有机物料，淹水覆膜处理后能明显着增加芥蓝产量，降低根肿病的发病率。伍朝荣等[11]发现通过土壤强还原处理可显着改变番茄连作土壤中细菌群落的结构组成及多样性，有效降低土壤中青枯菌数量。Strauss等[12]将当地农作物秸秆作为有机物料添加到土壤中，当添加量达到20.2 t/hm2即可形成病原菌致死致命环境。而Wen等[13]研究发现，当秸秆添加量为3、1.5 t/hm2时均能有效抑制尖刀镰刀菌生长。由此可见，在RSD处理过程中，有机物料的添加量以及处理后微生物群落的变化与处理效果息息相关。已有RSD法用于芥蓝[10]、三七[14]等不宜连作作物的研究报道，然而大部分研究聚焦在有机物料种类选择和用量确定2个方面，并且试验往往以大棚或盆栽的形式开展，而关于RSD处理在实际种植生产中应用的研究报道较少。

笔者聚焦引起烟草土传病害相关的的真菌群落结构，利用RSD技术，探索有机物料不同添加量对菌群多样性、结构及烤烟产量的影响，以期为RSD技术的推广利用、健康烟田土壤微环境的重组以及烟叶优质生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验田位于贵州省清镇市红枫湖镇骆家桥村烤烟种植基地，该地区属于北亚热带季风湿润气候，年平均气温14.1℃，年降雨量1 180.9 mm，无霜期283 d。该试验田已连续5 a种植烤烟。试验前0～20 cm土层的基本理化性质为：有机质36.23 g/kg，全氮2.00 g/kg，碱解氮135.31 mg/kg，有效磷32.50 mg/kg，速效钾428.74 mg/kg，pH值6.62。供试有机物料为甘蔗渣，总有机碳（TOC）含量为45.6%，全氮（TN）含量为1.12%，C/N=40.7。

1.2 试验设计

田间试验共设置3个处理，分别为：CK，不做任何土壤处理的对照；T1，甘蔗渣添加量为9 t/hm2的RSD处理；T2，甘蔗渣添加量为13.5 t/hm2的RSD处理。每个处理设置3个重复，共9个小区，每小区面积为36 m2。各小区之间以40 cm深、30 cm宽的沟渠隔开。RSD处理的具体步骤如下：烟田平整后，将甘蔗渣均匀撒在土壤表面，通过旋耕机将其与耕作层土壤混合均匀并充分灌溉，用塑料膜覆盖处理30 d，处理期间土壤温度为20～30℃。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 土壤样品采集待RSD处理结束后，揭开塑料薄膜，采集土壤样品。各小区按“S”型五点取样法，每个小区取≥1.5 kg的土样，过2 mm筛。过筛后的土壤样品分成2份：一份自然风干后用于土壤主要理化性质测定，另一份保存在-80℃，用于土壤真菌多样性测定。

1.3.2 土壤理化性质测定测定指标包括pH值、有机质（SOM）、全氮（TN）、碱解氮（AN）、有效磷（AP）、速效钾（AK），具体方法参见鲍士旦[15]编着的《土壤农化分析》。

1.3.3 群落结构检测采用高通量测序法检测土壤真菌多样性和群落结构：用DNA试剂盒（FastDNA®Spin Kit）提取土壤样本中的DNA，用琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行浓度和纯度检测；经PCR扩增纯化后，将纯化后的扩增子根据97%的相似度对序列进行OTU（Operational taxonomic unit）聚类，生成OTU表格[16]。具体试验过程由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 烤烟产量统计烟叶烘烤后，分别统计各处理的上等烟比例、均价、产量、产值，并折算成单位面积烟叶产量、产值。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件进行数据分析，用R语言计算相关性，采用Origin 9.1及TBtools[17]作图，并采用SPSS 25软件中单因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan新复极差法进行多重比较（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 RSD处理对土壤理化性质的影响

由表1可知，与CK处理相比，施用甘蔗渣的RSD处理可明显提高土壤pH值，但是不同施用量对土壤pH值的提升效果不一致，其中T2处理土壤pH提升最大，由6.617提升至7.128，较CK处理增加了7.72%。与对照相比，RSD处理后的土壤有机质（SOM）、全氮（TN）、碱解氮（AN）的含量显着增加，并且土壤中有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾的含量随甘蔗渣施用量的增加而增加，其中T1处理土壤中有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾的含量较CK处理分别增加了24.48%、11.96%、7.66%、32.01%、24.14%；T2处理土壤中有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾的含量较CK处理分别增加了36.18%、19.77%、21.93%、80.28%、58.63%。

表1 各处理的土壤理化性质

2.2 RSD处理对土壤真菌多样性的影响

3个处理共9个土壤样品经高通量测序后得到508 476个序列，在相似度97%的水平下聚类后共得到1 053个OTU。所有处理的真菌稀疏曲线都趋向于接近饱和平滑（图1B），说明测序reads的数据量是足够的。各处理间OTU的重叠情况用Venn图显示，由图1A可知，3个处理间共有的OTU数量为110个，而特有的OTU数目以T2处理最多。

图1 RSD处理对土壤真菌多样性的影响

经过30 d的RSD处理后，土壤中真菌群落的丰富度指数（Chao1、ACE）和多样性指数（Simpson、Shannon）如表2所示。与CK处理相比，T1、T2处理的Simpson指数有所降低，而Chao1、ACE丰富度指数明显升高，且各处理间差异显着。这表明RSD处理可改变土壤真菌群落的丰富度和多样性，且随着甘蔗渣施用量的增加，土壤真菌群落丰富度和多样性随之提高。当甘蔗渣施用量为13.5 t/hm2时，土壤中真菌群落多样性变化最大。

表2 RSD处理对土壤真菌多样性指数的影响

2.3 RSD处理对土壤真菌群落组成的影响

采用Principal coordinate analysis（PCA）从物种分类中门的角度分析了不同处理土壤中的真菌群落结构，结果如图2所示。PCA分析第一轴解释度为45.61%，第二轴解释度为32%；在门水平上，3组处理土壤样品中真菌群落具有显着差异；其中，CK处理与T1、T2处理间的距离较远，表明CK处理与RSD处理之间的微生物群落结构相似度很低；而T1和T2之间距离也较远，表明RSD处理时甘蔗渣施用量对土壤真菌群落结构也有明显的影响。

图2 不同处理间土壤真菌群落在门水平的主坐标分析

由图3A可知，各处理土壤中真菌主要由子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）等17个真菌门组成。其中，子囊菌门、担子菌门、油壶菌门和壶菌门是对照土壤中的优势菌门；经RSD处理后，土壤中子囊菌门的丰度显着增加，担子菌门、油壶菌门和罗兹菌门的相对丰度则明显降低。由图3B可知，土壤中真菌属主要由木霉属（Trichoderma）、毁丝霉属（Myceliophthora）、拟青霉属（Simplicillium）、黑孢壳属（Melanospora）、帚霉属（Scopulariopsis）等19个真菌属组成，其中优势菌属是木霉属、毁丝霉属、拟青霉属、黑孢壳属。与CK处理相比，油壶菌属（Olpidium）的相对丰度在T1、T2处理中显着降低，而木霉属的相对丰度在T1、T2处理中显着增加，毁丝霉属的相对丰度则在T2处理中显着增加。

2.4 RSD处理后土壤中变化显着的真菌属

由图4可知，经RSD处理后，土壤中炭黑粉菌（Anthracoidea）的相对丰度显着减少，由CK处理的2.21%减少到T2处理的0.17%；油壶菌属（Olpidium）、镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）的相对丰度经过土壤强还原处理后显着降低，其中油壶菌属从对照处理的10.97%下降到T2处理的0.48%，减少了95.62%；镰刀菌属和链格孢属则未在T2处理中发现。与CK相比，RSD处理能显着增加土壤中端梗孢属（Acrophialophora）和毁丝霉属（Myceliophthora）的相对丰度，并且随着甘蔗渣施用量的增加，土壤中这2种真菌属的相对丰度增加。与CK相比，木霉属的相对丰度显着增加，由CK的0.16%增加到T1的20.13%、T2的18.63%，分别增加了124.8、115.4倍。这说明RSD处理能显着改变土壤中部分真菌属的相对丰度。

图3 RSD处理土壤真菌门（A）、属（B）水平的相对丰度

图4 RSD处理后土壤中变化显着真菌属的相对丰度

2.5 土壤理化性质与真菌群落的关联分析

对土壤理化性质指标和真菌属相对丰度利用R计算进行spearman相关性分析，结果通过FDR（false discovery rate）校正，采用TBtools软件获得相关性热图。由图5可知，土壤中炭黑粉菌属（Anthracoidea）、镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）、油壶菌属（Olpidium）与部分土壤理化性质指标呈显着或极显着负相关性，其中炭黑粉菌属与土壤有机质、有效磷极显着负相关，与速效钾显着负相关；镰孢属与土壤有效磷、速效钾显着负相关；链格孢属则与土壤速效钾极显着负相关，与全氮、碱解氮、有效磷显着负相关；油壶菌属仅与土壤有机质显着负相关。此外，毁丝霉属（Myceliophthora）与土壤有效磷、速效钾极显着正相关，与全氮显着正相关；柄孢壳属（Zopfiella）与土壤pH值、有效磷显着正相关。

2.6 RSD处理对烤烟经济性状的影响

经RSD处理后，烟叶的经济性状如表3所示，与CK相比，RSD处理能显着增加烤烟的产量和产值，提升上等烟比例；上等烟比例表现为T2＞T1＞CK。对比T1、T2处理可知，甘蔗渣的添加量会影响烤烟的经济性状，随着甘蔗渣施用量的增加，烤烟产值和上等烟比例增加。T2处理的产量较CK提高了8.18%，较T1提高了2.97%；T2处理的烤烟产值较CK提高了13.90%，较T1提高了5.42%。由此可知，RSD处理可提高烤烟的产量和产值，且效果随着甘蔗渣施用量的增加而增强。

表3 不同处理烤烟的经济性状

图5 土壤真菌属与理化性质的相关性热图

3 结论与讨论

通过将甘蔗渣与土壤混合，灌水、覆膜处理30 d后，土壤pH值由CK处理的6.617提升至T2处理的7.128，且对pH值的提升效果随着甘蔗渣的添加量增加而增强，这一现象与Zhao等[18]的研究结果基本一致。土壤有机质含量与甘蔗渣的施用量直接相关，这可能是由于甘蔗渣未完全分解，产生的小分子有机物成为土壤有机质的一部分，从而提高了土壤有机质含量[19]。RSD处理还可以显着提高土壤中全氮、碱解氮、有效磷、速效钾的含量。这些养分含量的升高对于改善土壤理化性质、提高烟草产量以及改善烟叶品质有一定促进作用[20]。

添加有机质对土壤进行厌氧处理可明显改变土壤微生物群落结构[21-22]。试验结果显示，RSD处理后，土壤中真菌Simpson多样性指数减小，Chao1、ACE丰富度指数显着增加，表明经过RSD处理，土壤真菌群落的丰富度以及多样性增加，Huang等[16]的也发现了这一现象。经RSD处理后，土壤中子囊菌门的相对丰度显着增加，担子菌门、油壶菌门和罗兹菌门的相对丰度显着降低。这可能是因为在厌氧、强还原性、高温环境中，甘蔗渣分解产生的挥发性气体、有机酸、低价重金属等各类有毒物质，在杀灭病原微生物的同时改变了土壤微生物群落结构[23]。T2处理土壤中毁丝霉属相对丰度显着增加，这是因为RSD处理使土壤环境温度升高，而毁丝霉属在高温环境中表现出独特的生存适应能力，能够通过分泌多种酶（纤维素酶、漆酶、木聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、植酸酶和其他杂酶）降解有机物中几乎所有种类多糖而大量繁殖[24]。作为一种从土壤分离的最常见有益真菌，木霉属真菌能产生许多具有生物活性的物质（包括细胞壁降解酶和次生代谢产物），用以抑制多种植物病原菌的生长[25]。试验结果显示，RSD处理可以显着增加木霉属真菌的相对丰度，这对于维护健康微生态环境具有重要意义。此外，土壤中引起烟草赤霉病的镰刀菌属、引起赤星病的链格孢属以及作为病毒介体的油壶菌属的相对丰度均显着降低，表明RSD技术能有效杀灭土壤中病原菌。这是由于在RSD处理过程中，有机物厌氧分解产生对病原菌有毒有害的物质，如乙酸、丙酸、氨、硫化氢、低价金属离子等。以上结果表明，有益微生物增加和RSD处理造成的环境因素改变均能降低病原菌的丰度[26]。

此外，Liu[27]的研究表明，环境因素是重组细菌群落的决定因素。土壤中添加甘蔗渣后，理化性质以及真菌群落结构显着异于对照处理，并且油壶菌属、镰刀菌属、链格孢属与部分理化性质指标显着负相关，毁丝霉属与部分理化性质指标显着正相关。这说明在连作植烟土壤中添加甘蔗渣，能够重新组建真菌群落，降低病原菌丰度，增加拮抗菌丰度，保证烟草健康生产[28-29]。此外，对各处理烤烟的产量、产值和上等烟比例进行分析发现，RSD处理能提升烤烟的产量、产值及上等烟比例，并且T2处理烤烟的产量、产值及上等烟比例均高于其他2个处理。这说明RSD处理后有助于改善烟叶质量，同时提升烤烟的经济效益，且效果随着甘蔗渣施用量的增加而增强。

综上所述，对连作植烟土壤进行RSD处理，不同的有机物施用量对植烟土壤理化性质以及真菌群落结构的影响随着有机物施用量的增加而增强，高有机物施用量对土壤中病原菌的灭菌效果更好。这主要是因为施用量越多对环境因素的影响越大，导致土壤真菌群落改变，促进烤烟产质量的提升。但是，有机物料施用量对微生物群落以及烤烟生长是否存在阈值，还有待进一步验证。