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基因工程菌苗研究的现状与发展

花匠小妙招
2024-11-29 14:31

1、第六章基因工程菌苗研究的现状与发展（Status and development of gene engineering bacteria vaccine）第一节概述（Section I outline） 1883年-1885年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。 19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。,细菌一旦获得耐药性，存在与细菌染色体、质粒和转座子中的耐药基因就可通过转化、转导、接合和转座等方式，将抗性基因传播到其他敏感菌，使之成为抗药菌株，给临床传染病的治疗带来困难。据WHO1996年报告，全球每年死亡约5190万人，其中1/3约1730万死于传染病。,在过去20年中，有29种新传染病出现。美国Satcher博士在Emerging Infectious Diseases杂志创刊刊号列出自1973年以来鉴定的主要传染病或病原体22种

2、。近年鉴定的新病原体和疾病鉴定年份依次列于表6-1。,表6-1 新鉴定的病原体,新病原体不断出现与鉴定，新的疫苗研制也相继开始。重要病原体全基因测序的开展和完成，及类似生物表型的不同菌属间的同源序列和异源序列的发现，对抗感染研究来说，像进行了一场革命，不仅会促进病原体致病和发病机制的研究，也会开阔和调整菌苗研究的策略和思路。目前已完成500余种病毒的全基因测序，关于重要病原菌全基因测序进展情况列于表6-2。,表6-2 人类重要病原菌全基因测序现状,总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。,第二节目前应用的菌苗及其存在问题 Present bacteria vaccine and the question 一、目前应用菌苗的类别The type of bacteria vaccine 按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗。,1、减毒的活菌苗（At

3、tenuated bacteria vaccine）如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院Calmette和Guerin等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油-胆汁-马铃薯培养基上传230代后（13年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行比较，方知BCG缺失了毒力相关基因。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。,2、灭活菌苗（Dead bacteria vaccine）通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、戊二醛（glutaraldehyde）、-内酯（-propiolactone）等化学处理得到。如霍乱死菌苗、百日咳（Bordetella pertussis）死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次免疫才能得到好的保护效果。,3、亚单位或成分苗（Subunit bacteria vaccine）从细菌培养液中提取、用化学方法脱毒的类毒素苗，如破伤风类毒素（TT）、白喉类

4、毒素（DT），免疫后诱导机体产生的抗血清能特异中和TT破伤风类毒素或DT白喉类毒素，其保护效果可达95%以上。由于毒素纯化方法的改进，产品的副作用很小。,荚膜细菌纯化的多糖菌苗，可诱导产生的抗体能保护机体抵抗入侵荚膜菌的感染。如嗜血性流感杆菌b（Hib）、伤寒杆菌Vi多糖等多糖苗，能诱导机体产生T细胞非依赖的抗体反应，其特点是诱导产生短期的IgM抗体，缺乏免疫记忆，对不到18个月幼儿的多糖苗免疫原性差，而没有保护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。,目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋白提供适当的T细胞表位，由T细胞协助B细胞产生多糖特异性抗体，使T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖抗原，这类菌苗称为多糖-蛋白结合苗。如嗜血流感杆菌Hib的结合苗已在几个国家获得证书，证明对不到18个月的儿童有很高的免疫原性，能诱导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少Hib菌的入侵感染与发病。,表6-3 目前可用于人群的菌苗,注：i.d皮内，s.c皮下，d.s划痕，i.m肌注，p.o口服,（二）研制菌苗的新方法（New method of produce bacteria vacci

5、ne） 1、研制菌苗的新方法（new methods）对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不断设计和研制新型疫苗的重要基础。针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表6-4 。,表6-4 目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗,2、目前菌苗存在的问题（questions）（1）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。如疟疾几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十年了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其效果波动很大0%80%，因此急需安全有效的结核菌苗问世。,（2）与病毒相比：基因工程细菌及细菌核酸苗报导明显少。至今国际上还没有成功满意的重组细菌苗提供人群使用。关于细菌毒素的分子及其编码基因与调控机制都比较清楚，因此，有关毒素的基因工程菌苗的构建或载体构建等均无问题。但菌外膜上的其它结构如粘附分子，侵袭蛋白，鞭毛及脂多糖等分子结构十分复杂

6、，编码基因多呈丛分布，如LPS的表达涉及近30个基因的级联反应，操作起来尚有困难。因此还有毒力相关或保护相关基因的分离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做,（三）理想菌苗的条件（Ideal bacteria vaccines condition）理想疫苗应该是：（1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。（2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。,（3）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。（4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。（5）能口服，能有效诱导粘膜免疫。（6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。每一项要求，都需要大量的基础研究，已能提出更为合理的疫苗研究策略，研制出安全高效，使用方便，价格低廉的菌苗,第三节重要细菌基因工程苗的研究进展（Development of important gene engineering bacteria vaccine),当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：现有菌苗保护效果不好；副反应大；难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症

7、；新出现的病原体或新变异病原菌。,一、霍乱菌苗 (Cholera vaccine) 霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CT）引起腹泻及其他症状。已知有O抗原，毒素共调节菌毛（TCP），血凝素（HA），外膜蛋白（OMPs）等，及引起水样腹泻的霍乱毒素（CT）由AB5的六聚体构成。霍乱产毒株ctxAB的5端有一6kb的DNA，依次有20t,ace,orfu,cep和RS序列与ctxAB一起称为霍乱毒素元件（CTX）元件，可进行转移，与一种丝状噬菌体（CTX）有关，而非产毒株没有这段DNA 。,据菌体抗原霍乱弧菌可分为200个以上的血清型 1881-1896年间的5次及1899-1923年的第6次大流行均由O1群古典型霍乱弧菌引起。第7次大流行自1961年延续至今，波及五大洲 1992年出现了一新的流行株O139血清型霍乱目前流行的霍乱为O1和O139两种血清型。近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：,1.BS/WC灭活菌苗(BS/WC dead bacteria vaccine ）由提取的或重组的霍乱毒素B亚单位（BS）及杀死的全菌细胞（WC

8、）组成。 2.CVD103-HgR减毒活菌苗（Levine 1998）在美国获准，为一次剂量的霍乱活菌苗。它是由霍乱经典型569B菌株构建而成的CVD103减毒株（CTA-B+）。并在其染色体溶血素基因nlyA位点插入汞抗性基因作为筛选标记。 3.以沙门氏菌为载体表达霍乱弧菌O抗原的伤寒/霍乱双价菌苗。 4.O139减毒菌苗候选株CVD112及Bengal-15,表6-5 重组霍乱菌苗的特性,a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热 b服苗者粪便中排菌苗株的百分率 c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率 d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率 e未得到数据 f未做,另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgA及血清IgG反应，及黏膜免疫记忆反应，对CT及CTB的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见表6-6。,表6-6 CT/CT-B佐剂应用的抗原,二、痢疾菌苗（Dysentery vaccine）痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居24种法定传染病的前二位。主要病原体

9、为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆. 临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。,痢疾菌共有4群：A志贺氏痢疾菌（Shigella dysenteriae），B福氏痢疾菌（S.flexneri），C鲍氏痢疾菌（S.bordii）和D宋内氏痢疾菌（S.sonnei）。按其菌膜表面LPS-O抗原分为44个血清型。目前已知至少27个基因和15个蛋白与痢疾菌入侵宿主细胞相关，它们作为III型分泌系统的调节子与效应子，以接触依赖方式被分泌进入宿主细胞。,1.死菌苗（Dead bacteria vaccine）五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，但没有保护效果；用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明LPS-O多糖是保护性抗原； Robbins(1992)将痢疾菌LPS与不同蛋白载体（TT，DT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。宋内氏LPS-O-蛋白（TT，DT）有保护作用，Robbins（1996）将多糖-蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏多糖-蛋白结合苗保护效果达70%。,2.活菌苗（Living bacteria vaccine）采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。 Meitert等（1984）在胆盐平皿连续传代32次获得S.f2a减毒株IstratiT32； 80年代初中国近一万人现场观察，证实T32菌苗安全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。,80年代中国国内以T32为受体株开始致力于构建双价痢疾菌苗株的研究。牟兆钦等，1989年将一编码宋内氏菌LPS-O抗原的大质粒转移至T32菌中获得福氏2a宋内氏双价痢疾菌苗株FS-18，FSM2117；宋树珍等构建了FS痢疾双价菌苗株，其中FSM2117识别福氏2a和识别宋内氏痢疾苗LPS-O抗原；林纪胜(1999)构建了S.flexenri 2a和S.dysenteria I双价痢疾菌株，有双价免疫原性，现FSM2117与FS两株痢疾双价菌苗均已获国家新生物制品证书和试生产文号。,90年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主要针对痢疾菌毒

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