【Plant Journal】RhMYC2通过调控茉莉酸和细胞分裂素的协同控制玫瑰花瓣大小

• 花匠小妙招
• 2024-11-29 14:51

题目：RhMYC2 controls petal size through synergistic regulation of jasmonic acid and cytokinin signaling in rose

刊名：The Plant Journal

作者：Feifei Gong, Xiaoming Sun et al.

单位：China Agricultural University, Beijing,

日期：20 August 2024

01

摘要

花瓣大小由细胞分裂和细胞扩增决定。茉莉酸（JA）已被报道与花的发育有关，但其影响花瓣大小的调控机制尚不清楚。在这里，我们揭示了JA通过关键的JA信号成分RhMYC2在调节花瓣大小和细胞分裂阶段持续时间方面的重要作用。

我们发现RhMYC2的表达是由茉莉酸甲酯的外源性处理诱导的，并且从花器官发育的第0阶段到第2阶段降低，对应于细胞分裂阶段。此外，沉默RhMYC2缩短了细胞分裂阶段的持续时间，最终加速了开花，导致花瓣变小。

我们确定RhMYC2通过直接激活细胞分裂素生物合成基因LONELY GUY3（RhLOG3）的表达和抑制细胞分裂肽分解代谢基因CYTOKIN氧化酶/脱氢酶6（RhCKX6）的表达来控制玫瑰花瓣中的细胞分裂蛋白稳态。

沉默RhLOG3缩短了细胞分裂期的持续时间，并产生了更小的花瓣，类似于RhMYC2沉默。我们的研究结果强调了茉莉酸和细胞分裂素在调节花发育方面的协同作用，特别是对玫瑰花瓣大小的调节。

02

技术路线

 Rose (R. hybrida “Samantha”) and Nicotiana benthamiana  

 Treatment with sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DIECA)

Microscopy observations and cell counting

 RNA extraction and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR)

RNA-sequencing and differential gene expression analysis

VIGSTransactivation and dual-luciferase reporter assays

Quantification of endogenous GA

03

主要结果

3.1 茉莉酸在玫瑰花瓣生长的早期阶段发挥作用

玫瑰花瓣的生长和发育是由细胞分裂和细胞扩增的协调控制决定的。我们之前的研究表明，在玫瑰早期花瓣生长过程中，0-2阶段是花瓣背面表皮细胞从分裂到膨胀的关键时期。在这些早期发育阶段，花瓣的生长主要依赖于细胞分裂，直到第0阶段（花蕾露出）。然而，从第2阶段（萼片完全展开）开始，花瓣细胞增殖几乎停止，细胞扩增成为生长的主要动力。

为了研究茉莉酸在玫瑰花瓣生长过程中的作用，我们通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量了0-2阶段花瓣中各种茉莉酸的含量。我们观察到从0期到1期，JA含量、其生物合成前体12-氧代植物二烯酸（OPDA）和生物活性物质茉莉酸异亮氨酸（JA-Ile）急剧下降。具体而言，与0期花瓣相比，1期花瓣中的JA、OPDA和JA-Ile水平分别降低了19.2倍、45.3倍和31.4倍（图1A）。

我们还测试了用JA生物合成抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠（DIECA）处理是否会影响花瓣的早期生长期。事实上，DIECA治疗显著缩短了0-2期（DIECA处理的花朵为4.40 0.49天，模拟花朵为6.20 0.75天），并减小了最终的花瓣大小（图1B-D）。此外，在DIECA治疗下，下表皮细胞的数量比模拟治疗少，两种情况下的细胞大小没有显著差异（图1E）。因此，我们假设JA特异性地影响花瓣中的细胞增殖。

3.2 JA信号调节因子RhMYC2延长玫瑰细胞分裂期的持续时间

JA-Ile是一种活性分子形式，在JA代谢中起着激活作用，然后与下游受体COI1结合，激活JA信号通路中的核心转录因子MYC2。

为了探索JA的潜在作用，我们通过HMMSEARCH和BLASTP工具进行生物信息学分析，在玫瑰基因组中鉴定了12个推定的RhMYC基因。我们还对保守结构域进行了搜索，结果表明，12个推定的RhMYC家族基因中的SMART编码的蛋白质都具有bHLH-MYC_N（Pfam结构域PF14215）和bHLH结构域（Pfam功能域PF00010）。

从上述候选RhMYC基因中，我们注意到，根据公开的转录本数据，RchiOBHm_Chr7g0209751转录水平从第0阶段（花蕾显露）到第1阶段（花瓣几乎可见的芽）显著下降（图2A）。

对来自不同植物物种的所有候选RhMYCs和MYC2的系统发育分析表明，RchiOBHm_Chr7g0209751编码的蛋白质是唯一与其他MYC2紧密聚集的RhMYC，因此我们将其命名为RhMYC2。逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析证实了公开的转录组数据，RhMYC2转录水平从第0阶段到第2阶段下降了99%。在花瓣

达到第2阶段后，RhMYC2的表达趋于平稳，并保持在较低水平（图2B）。基于我们之前的工作，我们推测RhMYC2可能在细胞分裂阶段发挥重要作用。我们确定RhMYC2的表达是由外源性应用MeJA诱导的，并受到JA生物合成抑制剂DIECA的抑制（图2C），表明JA信号可能参与玫瑰花瓣细胞的分裂。

为了阐明RhMYC2在花瓣早期生长期的作用，我们用RhMYC2的基因特异性区域进行了病毒诱导的基因沉默（VIGS）测定，以降低RhMYC2转录水平。我们确定RhMYC2沉默植物的花从0期到2期的速度（4.70-0.46天）比pTRV2对照植物（6.40-0.80天）快。这种发育加速是0-2期间隔特有的，因为我们观察到RhMYC2沉默（3.00-0.63天）和pTRV2对照植物（3.40-0.49天）的2-5期间隔长度没有显著差异（图2D-F）。当我们监测花瓣细胞的几个定义特征时，我们观察到，在第5阶段（完全开放的花朵；图2G，H），RhMYC2沉默植物的花瓣最终面积（8.70 0.75 cm2）小于pTRV2对照植物的面积（9.99 0.15 cm2）。

此外，RhMYC2沉默植物的花瓣下表皮细胞明显少于pTRV2对照植物（图2I），表明RhMYC2的沉默导致细胞分裂的早期停止，这与RhCKX6沉默植物的表型相反。与pTRV2对照植物在第5天左右开始细胞伸长相反，根据单个花瓣细胞的面积确定，RhMYC2沉默植物的花瓣细胞在第3天开始显著增加，尽管最终单细胞面积没有显著差异（pTRV2控制的平均值为5.76 0.48 9 102 lm2，RhMYCO2沉默花瓣的平均值是5.50 0.22 9 102 lm 2）（图2J，K）。基于这些结果，我们假设RhMYC2沉默植物的较小花瓣最有可能是由于细胞分裂持续时间较短。此外，RhMYC2沉默植物的下表皮细胞比对照植物更早进入扩增期。

3.3 RhMYC2通过调节RhLOG3和RhCKX6转录影响玫瑰花瓣细胞分裂素水平

我们之前的研究表明，细胞分裂素水平的降低会导致玫瑰花瓣中细胞增殖的停止和细胞扩增的开始。由于RhMYC2沉默导致花瓣细胞减少的表型，我们研究了RhMYC2是否会影响细胞分裂素水平或玫瑰细胞增殖的持续时间。因此，我们测量了pTRV2对照和RhMYC2沉默植物花瓣中的细胞分裂素含量，结果显示RhMYC2静默花瓣中的异戊烯基腺嘌呤（iP）和反式玉米素（tZ）水平明显低于pTRV2花瓣（图3A），因此与RhCKX6沉默植物花瓣的表型相反。

为了更好地了解RhMYC2在调节细胞分裂素水平中的作用，我们分析了细胞分裂和扩增阶段花瓣公开转录组数据中细胞分裂肽合酶IPT和LOG以及代谢酶CKX的基因表达。我们发现RhLOG1、RhLOG3和RhCKX6的表达存在显著差异。随后，我们采用RT-qPCR来确认pTRV2对照和RhMYC2沉默花瓣中的这些表达水平（图3B）。

我们检测了pTRV2对照品系和TRV-RhMYC2品系在整个发育时间过程中花瓣中RhLOG3和RhCKX6的表达水平。结果表明，在整个发育过程中，TRV-RhMYC2系中RhCKX6的表达明显高于pTRV2对照系，RhLOG3的表达明显降低。同时，在花瓣生长过程中，TRV-RhMYC2中RhCKX6表达增加，RhLOG3表达减少。

酵母单杂交（Y1H）试验表明，RhMYC2与酵母细胞中的RhLOG3和RhCKX6启动子结合（图3C）。使用报告构建体RhLOG3pro:LUC和RhCKX6pro:LUC以及效应构建体35S:RhMYC2进行的双荧光素酶（LUC）检测表明，RhMYC2激活RhLOG3转录，这可以从与35S:RhMYC2和RhLOG3pro：LUC共渗透的烟草植株叶片中检测到的相对LUC活性较高看出。相比之下，与空效应器对照载体相比，35S:RhMYC2和RhCKX6pro:LUC在底栖猪笼草叶片中的共渗透导致相对LUC活性降低，表明RhMYC2抑制RhCKX6转录（图3D）。

我们使用JASPAR在RhLOG3和RhCKX6启动子中寻找推定的RhMYC2 DNA结合位点(https://jaspar./)（图3E、F）。Y1H测定和染色质免疫沉淀，然后使用pSuper:RhMYC2-GFP玫瑰植物进行定量PCR（ChIP-qPCR）分析，表明RhMYC2直接结合RhLOG3启动子的P5区和RhCKX6启动子的P1区（图3C、E、F）。这些结果表明，RhMYC2最有可能通过影响花瓣早期生长过程中细胞分裂素的生物合成和分解代谢来影响细胞增殖的进程。

3.4 RhLOG3促进生物活性细胞分裂素的生物合成，延长玫瑰花瓣生长和细胞分裂阶段的跨度

为了探索RhLOG3如何促进生物活性细胞分裂素的生物合成，我们检测了发育中花瓣中RhLOG3的表达水平。RhLOG3表达从0期到1期显著降低，与RhMYC2的模式相同（图4A）。

我们还通过VIGS专门降低了RhLOG3转录水平；RhLOG3did的沉默不影响pTRV2和RhLOG3沉默植物之间其他LOG成员的表达水平。我们确定，在0和2期之间，RhLOG3沉默植物的f低开放进程（4.40 0.49天）明显短于pTRV2对照植物（6.30 0.90天），与RhMYC2沉默植物相似，与RhCKX6沉默植物相反（图4B-D）。RhLOG3沉默花瓣的最终尺寸（7.46 0.17 cm2）比pTRV2对照花瓣（9.02 0.56 cm2）小20.0%（图4E，G）。

我们发现RhLOG3沉默花瓣中的下表皮毛细胞比pTRV2对照花瓣中的少（图4H）。沉默RhLOG3也导致下表皮细胞面积显著增加，从第3天pTRV2对照花瓣的0.85 0.09 102 lm2增加到RhLOG3沉默花瓣的1.10 0.17 102 lm2。然而，pTRV2对照组（平均6.22 0.58 9 102 lm2）和RhLOG3沉默花瓣（平均5.88 0.42 9 102 1m2）的最终细胞大小没有显著差异（图4F，I）。

此外，我们还监测了pTRV2和TRV-RhLOG3花瓣中的细胞分裂素水平。值得注意的是，RhLOG3沉默花瓣的iP含量明显低于pTRV2对照花瓣，而tZ含量在两种材料中相当（图4J）。

总之，我们发现RhMYC2是JA信号传导的关键调节因子，通过影响花瓣早期生长过程中花瓣中生物活性细胞分裂素的生物合成和分解代谢，控制玫瑰细胞分裂阶段的持续时间和最终花瓣大小（图5）。

04

结论

我们之前对玫瑰花瓣进行了代谢组学分析，结果表明，在从细胞分裂到扩增的过渡过程中，茉莉酸含量迅速下降。然而，目前尚不清楚与JA信号传导相关的MYC2型转录因子是否在玫瑰花瓣生长过程中整合了JA和细胞分裂素途径。

在这项研究中，我们鉴定并表征了RhMYC基因家族的成员在JA信号传导和玫瑰花瓣生长中的作用。在12个RhMYC基因中，有一个在玫瑰花瓣中从0期到2期的表达急剧下降。

RhMYC2的沉默缩短了细胞分裂阶段的持续时间，导致花瓣生长加速和花瓣变小。此外，RhMYC2的沉默通过诱导RhLOG3表达和抑制RhCKX6表达，导致花瓣中异戊烯腺嘌呤（iP）和反式玉米素（tZ）含量降低。

我们的研究结果共同丰富了多种植物激素的花发育网络，并为设计玫瑰花开放和质量提供了新的资源。

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