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第28讲基因工程

花匠小妙招
2024-11-30 17:44

资源简介

(共68张PPT)
10.67基因工程
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。又叫重组DNA技术
一、基因工程的概念
生物
类型
生物
产品
人们的愿望
转基因
遗传
性状
二、基因工程的理论基础
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
基因工程的实现需要解决哪些问题？
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
如何筛选和获取？
为何要拼接？如何拼接？
需要什么工具？
将目的基因导入不同生物细胞的方法
重组DNA分子需具备哪些条件？
目的基因一定能进入受体细胞吗？进入后一定能表达吗？
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制酶
DNA连接酶
载体
三、重组DNA技术的基本工具
质粒
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
1
限制酶
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
三、重组DNA技术的基本工具
Q1:限制酶存在于原核生物中的作用是什么
原核生物容易受到外源DNA的入侵;限制酶可切割外源DNA,使之失效,保证自身的安全
Q2:为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
Q3：获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是。但是使用该法缺点是容易发生，为了避免上述情况发生，可采取的措施是。
②获取一个目的基因需限制酶切割次,共产生个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
(1)不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
如图乙中不选择SmaⅠ。
图解限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同限制酶切割，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
【典例1】在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是（多选）( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解
C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同
D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞
E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
DE
【典例2】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的正向连接
【典例3】如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是　不能选择其他限制酶的理由分别是：。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；
若选SmaⅠ/MspⅠ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
2
DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
分子缝合针
三、重组DNA技术的基本工具
与DNA有关的几种酶的比较
酶种类作用底物作用部位作用结果
限制酶 DNA分子磷酸二酯键将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶 DNA分子片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端
解旋酶 DNA分子碱基对中的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA酶 DNA分子磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
3
基因进入受体细胞的载体
环状双链DNA分子
噬菌体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
三、重组DNA技术的基本工具
Q1：载体的作用: ①　　　　　　　　　　　　　　　　．
②　　　　　　　　　　　　　　　　．
Q2：作为载体需具备的条件:
①　　　　　　　　　　　　　　　　　　．
②　　　　　　　　　　　　　　　　　　．
③　　　　　　　　　　　　　　　　．
④　　　　　　　　等．
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
具有标记基因，便于进行筛选
对受体细胞无害
质粒
①来源：来源于许多等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的
（化学本质），故质粒有个游离的磷酸基团
②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为，还有如：
等；其作用是。
③复制原点：。
细菌和酵母菌
双链环状DNA分子
0
*在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
标记基因
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
DNA分子复制的起点
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
④细菌质粒是独立于细菌拟核之外的细胞质DNA分子，侵入宿主细胞后
A.有的可以独立地进行自我复制，
B.有的则整合到宿主细胞染色体DNA上，随着宿主细胞染色体DNA的复制而同步复制。
⑤若质粒DNA分子的切割末端为，则与之连接的目的基因切割末端应为；可使用把质粒和目的基因连接起来。
—A
—TGCGC
CGCGT—
A—
DNA连接酶
质粒
【典例4】图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ 三种限制酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以
与上述表达载体被________酶切后的产物连
接，理由是______________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了
甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如
图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细
胞中表达目的基因产物的有________，不能
表达的原因是____________________________
______________。
Sau3AⅠ
两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录　
甲、丙
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
四、基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变_______________或获得_______________等的基因。主要是指_____________的基因。
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
四、基因工程的基本操作程序
与生物抗逆性相关的基因
（Bt抗虫基因）
与生物药物相关的基因
（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
筛选合适的目的基因
②较为有效的方法：从相关的__________和____________的基因中进行筛选。
已知结构
功能清晰
苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物的了解：在某类昆虫肠道的碱性环境中表现毒性，对人畜无影响
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
人工合成目的基因
通过构建基因文库来获取目的基因
四、基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
目的基因的获取
利用PCR获取和扩增目的基因
①逆转录法：
②化学合成法：
生物材料
DNA
RNA
一定大小的DNA片段
cDNA
逆转录
基因组文库 cDNA文库
获取目的基因
导入受体菌中保存
限制酶切
基因文库
四、基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
目的基因的获取
通过构建基因文库来获取目的基因
DNA片段
原核基因
真核基因
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不编码蛋白质，调控基因表达
①全称：
②原理：
③操作环境：
④目的：
⑤优点：
⑥过程：
⑦条件：
⑧结果：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
四、基因工程的基本操作程序
1
目的基因的筛选与获取
目的基因的获取
利用PCR获取和扩增目的基因
模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、缓冲溶液
变性、复性、延伸
特异性扩增两种引物之间所对应的特定DNA片段。
PCR仪利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
Q1：(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
Q2：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出__个DNA片段，共需要引物数量为个。　　　　
指数
2n
2n＋1－2
Q3：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
Q4：下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(1)第几轮扩增后才能扩增出两条链等长的目的基因片段？比例是多少？
(2) 利用PCR筛选和扩增目的基因的前提是？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
(3)引物设计原则：
①长度适当（20-30bp）；
②引物内部、引物之间不发生碱基互补配对；
(4)需要引物的原因？
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
第3轮；1/4
比较项目生物体内DNA复制 PCR技术
区别解旋方式
场所
酶
温度
合成对象
联系解旋酶催化
细胞内(主要在细胞核内)
DNA解旋酶、普通DNA聚合酶等
细胞内温和条件
DNA分子
DNA在高温作用下变性解旋
细胞外(在PCR扩增仪内)
耐高温的的DNA聚合酶(Taq聚合酶)
需控制温度，在较高温度下进行
DNA片段或基因
①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成
②原料：均为四种脱氧核苷酸
③酶：均需要DNA聚合酶进行催化
④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意事项：
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理：
提取DNA的原理
鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精。
在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
注意：
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，
因为它没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
选材：
试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
—析出DNA
—溶解DNA
—鉴定DNA，现配现用
DNA的粗提取与鉴定
研磨液成分作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶活性
Tris-HCl缓冲液稳定DNA
NaCl 溶解DNA
DNA的粗提取与鉴定
步骤：
研磨
过滤或离心
纱布过滤。
Q1：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
Q2：过滤后，在4℃冰箱放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
Q3：可以用滤纸替代纱布吗？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
取上清
DNA的粗提取与鉴定
步骤：
研磨
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
过滤或离心
纱布过滤。
析出
Q1：搅拌时应轻缓、并沿一个方向的目的是？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
Q2：酒精预冷的作用:
同“低温放置的作用”
加预冷的酒精→用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
→或离心取沉淀物
DNA的粗提取与鉴定
步骤：
研磨
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
过滤或离心
纱布过滤。
析出
加预冷的酒精→用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
→或离心取沉淀物
鉴定
→2 mol/L NaCl溶解丝状物或沉淀物
→加二苯胺试剂，
→沸水浴加热5min，
→冷却后观察到蓝色。
DNA 对照
【典例5】(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3 基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是
A.①＋③ 　B.①＋②
C.③＋② 　D.③＋④
B
【典例6】利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是
A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引
　物b扩增的结果
B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互
　补的碱基
C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却
　至50 ℃左右
D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
D
【典例7】设计引物是PCR技术中至关重要的一环。设计的引物能与模板链目的位点互补结合，但不能在非目的位点与DNA结合，要防止引物之间或自身互补配对形成二聚体或折叠后互补配对形成发夹结构。回答下列有关引物及引物设计的问题：
(1)PCR中，引物的作用是________。
(2)下图1所示的引物中，其中一种设计不合理，原因是______。
使DNA聚合酶能从引物3'端开始连接脱氧核苷酸
引物Ⅰ折叠后会发生碱基互补配对形成发夹结构
【典例7】 (3)DNA分子杂交时需要单链DNA探针，常用不对称PCR来制备。不对称PCR中使用的一对引物的量不相等，其中少的称为限制性引物，多的称为非限制性引物，开始扩增出的是双链DNA，后来扩增出的是单链DNA．下图2中，α链为所需的DNA分子探针，应选用引物____作非限制性引物；已知图示DNA有n个，前10次循环的产物为双链DNA，后10次循环的产物是单链DNA，则最终可获得______个所需的单链探针；常用________法来鉴定PCR的产物。
Ⅳ
10n×210
琼脂糖凝胶电泳
要获得α单链
→引物Ⅰ少
前10轮共获得双链DNA：n×210
后10轮只有β链可复制为双链，
→每轮有单链n×210
【典例7】 (4)下图表示利用基因工程生产某药用蛋白过程中使用的质粒及目的基因的部分结构，β-半乳糖苷酶能分解无色的X-gal产生蓝色物质。图中显示，氨苄青霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、目的基因的序列中分别含有1种、5种、2种限制酶的识别序列及切割位点。在设计PCR引物时添加限制酶________________的识别序列，使扩增得到的目的基因首端、末端能分别被这两种酶识别并剪切，得到与质粒相同的黏性末端，以确保目的基因与质粒载体正确连接。写出筛选出成功导入目的基因的工程菌的思路：_______。
大肠杆菌与重组质粒混合培养，一段时间后，将其接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基。筛选出白色的菌落即工程菌
XhoⅠ和MunⅠ
(1)基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
终止转录
用来鉴别或筛选含有目的基因的受体细胞
2
基因表达载体的构建
---基因工程的核心
四、基因工程的基本操作程序
诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
(3)基因表达载体的构建过程
Q1：单酶切缺点
A.目的基因自身环化
B.质粒重新环化
C.质粒与目的基因反向连接
2
基因表达载体的构建
---基因工程的核心
四、基因工程的基本操作程序
Q2：如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
-G
-CTTAA
Q3：要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
项目启动子终止子起始密码子终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置目的基因上游目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ __________________________ _____________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
3
将目的基因导入受体细胞
生物种类植物动物微生物
常用方法农杆菌转化法、_____ _________ 显微注射法　　　处理法
受体细胞 ________________ _______ _______
转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
花粉
受精卵
Ca2＋
管通道法
体细胞或受精卵
四、基因工程的基本操作程序
原核细胞（大肠杆菌）
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
①导入植物细胞-花粉管通道法
3
将目的基因导入受体细胞
四、基因工程的基本操作程序
①导入植物细胞-农杆菌转化法
3
将目的基因导入受体细胞
四、基因工程的基本操作程序
b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；
目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是　　　　。
Q1:什么是转化？
Q2:农杆菌用于转化，有何特点？
a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数
___________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
基因重组
a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_______________，然后__________，并__________；受体细胞为_______
与农杆菌共培养
筛选转化细胞
再生成植株
体细胞
b.可以将____ 直接浸没在__________________中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行_____、_____等；受体细胞为_______
花序
含有农杆菌的溶液
种子
筛选
鉴定
受精卵
Q3：农杆菌转化法的具体转化方法：
Q4：农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的　　　　上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的　　　　　　上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入　　　，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入　　　　。
T－DNA
染色体DNA
农杆菌
受体细胞
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
②导入动物细胞-显微注射法
3
将目的基因导入受体细胞
四、基因工程的基本操作程序
Q：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
其他方法：
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如腺病毒载体等。
【典例8】逆转录病毒载体是目前应用较多的动物基因工程载体之一。运用逆转录病毒载体可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA一起复制和表达。研究发现逆转录病毒基因组（DNA）的核心部分包括三个基因：gag基因（编码病毒的核心蛋白）、pol基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。位于这些基因的两端有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。下图是构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的过程。请据图回答：
（1）过程①需要的工具酶有________。
（2）过程②之前需要通过PCR技术从基因组DNA中大量扩增外源基因，设计引物时，若引物长度过短，则引物与模板链结合的________，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，Tap酶就能从引物的___端延伸子链；引物中设计两种限制酶识别位点有利于________。
（3）过程②的工具酶有________、________。过程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的启动子后，其主要目的是________。
逆转录酶
特异性差
3'
目的基因的定向插入
限制酶
DNA连接酶
控制外源基因的表达与转移
（4）过程③中，导入病毒蛋白编码基因（gag、pol和env）的方法一般是___________，目的是________。
（5）据图分析，经过过程④病毒载体感染早期胚胎细胞后________（“有”、“没有”）有产生逆转录病毒的风险。
（6）有细胞导入了外源基因的胚胎发育成的小鼠被称为“嵌合小鼠”，嵌合小鼠杂交不一定能获得纯合转基因小鼠，原因是________。
亲子代之间遗传的桥梁是配子，只有含有外源基因配子的小鼠才能将新性状遗传给子代，且只有雌雄配子均含有外源基因受精后才能发育为纯合转基因小鼠
显微注射法
合成组成病毒的蛋白质
没有
受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。原核生物的优点:繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）③导入原核细胞3将目的基因导入受体细胞四、基因工程的基本操作程序注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。类型步骤检测内容方法
分子检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR等技术
第二步目的基因是否转录出mRNA PCR等技术
第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术
个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度→抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较→功能活性。 4
目的基因的检测与鉴定
四、基因工程的基本操作程序
转基因生物鉴定方法成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平鉴定
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
【典例9】甜菜是我国重要的糖料作物之一，为提高甜菜的光合效率和产量，科研工作者构建携带SBPase基因（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，如图为重组质粒示意图。回答下列问题：
(1)构建基因表达载体并导入农杆菌：获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经_____鉴定后，切割凝胶并溶解，回收含目的基因的DNA片段。然后使用限制性内切核酸酶切割____________________，将带有黏性末端的酶切产物纯化回收后，用DNA连接酶连接。经过一系列步骤后，
再将测序正确的重组质粒导入农杆菌。
(2)获取植株：将含有重组质粒的农杆菌侵染甜菜叶
柄并共培养一段时间后，先将外植体放在含有羧苄青霉
素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是____________。
电泳
质粒和SBPase基因
抑制农杆菌生长
【典例9】甜菜是我国重要的糖料作物之一，为提高甜菜的光合效率和产量，科研工作者构建携带SBPase基因（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体，通过基因工程对甜菜进行遗传改造，如图为重组质粒示意图。回答下列问题：
(3)为从分子水平上检测抗性植株是否含有目的基因，对抗性植株进行PCR后检测，检测结果如图4所示。CK+组是选用含____________的质粒作为阳性对照。
(4)取阳性无菌苗叶片提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，利用目的基因引物进行PCR以检测____________
目的基因
SBPase（目的）基因的表达情况
【拓展】核酸分子杂交技术
（P210T3）科研人员提取转基因抗虫棉甲、乙以及非转基因棉花丙的基因组DNA,分别用限制酶EcoRⅠ完全酶切,得到的产物和抗虫基因一起进行电泳,并将电泳结果转印到尼龙膜上,再利用带放射性标记的DNA探针与尼龙膜上变性的DNA分子进行杂交,洗去未结合的探针后,进行放射性自显影,结果如图所示。下列说法错误的是 (　)
A.DNA探针应为带放射性标记的抗虫基因
B.甲、乙植株的基因组中均插入了抗虫基因
C.乙植株的细胞内有可能插入了两个抗虫基因
D.相同位置上的杂交带对应的DNA片段的核苷酸序列相同
D
乳腺（房）生物反应器
器官移植
生长
五、基因工程的应用
必需氨基酸含量多的蛋白质
花青素代谢基因
生长激素基因→受精卵
肠乳糖酶基因→受精卵
重组人干扰素
药用蛋白基因
乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件
基因表达载体
显微注射
受精卵
泌乳期分泌乳汁
转基因动物
药物
发育
乳腺（房）生物反应器
【Q1】该转基因动物，药用蛋白基因在哪里表达？
乳腺细胞
几乎所有细胞
【Q2】药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？
【Q3】如何实现让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达？
将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起
【Q4】研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因使其在膀胱中特异性表达？
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组
【Q5】膀胱生物反应器的优点？
A.可以从动物一出生就收集产物，不受性别和生殖期限制。
B.从尿液中提取蛋白质比从乳汁中提取更简便、高效。
培育无免疫排斥的转基因克隆猪器官
抑制抗原决定基因表达
或除去抗原决定基因
在器官供体基因组中导入某种体调节因子
用转基因动物作为器官移植的供体
a.猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似
b.猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物
猪的优点：
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容乳腺生物反应器工程菌
含义指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞动物受精卵微生物细胞
导入方式显微注射法感受态细胞法
生产条件不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞或其培养液中提取
下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：
(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是__________。(填写数字)
(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容： ①______；
②______；③______；④______；⑤__________。
(3)蛋白质工程的目的是_______________________________ ___________________________，通过____________________实现。
(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是______的。
④⑤
①②③
转录
翻译
折叠
推测
改造合成
根据人们对蛋白质功能的特定需求，
基因改造或基因合成
相反
对蛋白质的结构进行分子设计
六、蛋白质工程的原理和应用
改造或合成目的基因
定点突变
基因融合
优点缺点
①解决粮食短缺问题 ②减少农药使用，减少环境污染 ③增加食物营养，提高附加值 ④增加食物种类，提升食物品质 ⑤提高生产效率，带动相关产业发展 ①可能产生新病毒或新过敏原
②可能产生抗除草剂的杂草
③可能使疾病的传播跨越物种障碍
④可能会损害生物多样性
⑤可能干扰生态系统的多样性
七、转基因产品的安全性
基因污染：指人工重组的基因通过转基因作物或家养动物扩散到其他栽培作物或自然野生物种并成为后者基因的一部分。
②途径
a.转基因植物的相关基因通过花粉传播而进入附近的野生植物或邻近的非转基因农作物。
b.转基因作物在自然条件下存活并发育成为野生的、杂草化的转基因植物。
c.土壤微生物或动物肠道微生物吸收转基因作物后获得外源基因。
防止基因污染：
将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，
原因：α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏，使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播（P102）