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一株生防内生真菌褐红篮状菌及其应用

花匠小妙招
2024-11-30 19:12

一株生防内生真菌褐红篮状菌及其应用

1.本发明属于微生物和农作物病害技术领域，具体涉及一株生防内生真菌褐红篮状菌及其应用。

背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.烟草是我国重要的叶类经济作物，目前烤烟主要产区分布在云南、广西、福建、贵州、四川、重庆、湖北、湖南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近1000个县市。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到90％以上，是世界上最大的烟草生产国。
4.在烟草生产上土传病害是严重影响产量和质量的重要因素。由卵菌疫霉属(phytophthora spp.)引起的植物疫霉病及丝核菌属(rhizoctonia spp.)引起的立枯病是主要发生的真菌性土传病害重要部分，能侵染小麦、玉米、水稻、棉花、大豆等大宗粮食作物、马铃薯、烟草、番茄等茄科经济蔬菜作物及花卉和果树，引起枯萎、茎基腐及根腐等多种症状，传播、扩散和为害猖獗。由疫霉属真菌(p.nicotianae)引起的烟草黑胫病在我国主栽烟区普遍发生，除了吉林和黑龙江外，由于受气候、种植制度、品种及管理等综合影响，近年来仍然大面积发生。该病害具有发生部位隐蔽，发生时间早，持续时间长，整株侵染受害等特点，难于防治。发生较轻田块发病率为5～10％，严重田块发病率达到30％以上，为烟叶生产带来较严重的经济损失。由丝核菌属的立枯丝核菌(r.solani)引起土传烟草立枯病(无性世代)和叶部的靶斑病(有性世代瓜亡革菌)在苗床和打顶成熟期为害烟草植株根部和叶片造成茎和根部腐烂及叶片坏死斑点和穿孔，为害较重。该真菌属于土壤习居菌且寄主范围广，一旦落脚在某块地里，就会长期住存下来，以菌核的形式在土壤中存活很多年，有时候也可以以菌丝体在土壤中或随着病残体过冬，病原菌还可以分泌分解植物细胞壁的酶，继续在寄主的死亡组织内生存，并随之又产生新的菌核。所以近年来从北到南烟草上的靶斑病发生一年比一年重，苗床上的立枯病局部年份为害严重。
5.采用化学药剂防治是减轻土传病害发生程度、作物获得高产量的一种高效的应急措施，主要包括土壤熏蒸和施用化学杀菌剂，但存在着杀灭土壤有益微生物、破坏土壤微生态平衡和防控不可持续的问题，其致畸、土壤残留严重威胁人类赖以生存的生态环境和人类健康。
6.因此，基于“以菌治菌”的生物防治方法来绿色防控根腐类土传真菌病害和叶部病害越来越引起人们的重视并广泛研究和应用，是化学防治的一种有效而有可持续前景的补充。目前，在用于植物病害生物防治的有益微生物细菌和真菌种类中，植物内生真菌(endophytic fungi)是生长在植物内部的生物体，即在其生活史中全部阶段或一个阶段均生活在健康植物的组织和器官内，但不会对植物造成不良影响的真菌，是一类具有重要价
值微生物资源。近年来，内生真菌在促进寄主生长发育，帮助寄主抵抗病虫害和逆境胁迫及生物降解方面表现出了很大的应用潜力，已成为农业生态系统中微生物肥料、生防抗菌剂和抗虫剂的重要微生物资源(mao b,huang c,yang g,chen y,chen s.2010separation and determination of the bioactivityof oosporein from chaetomium cupreum.african journal of biotechnology,9(36):5955
–
5961；noireung p et al.2020efficany of arcopilus cupreusas biological agent to control phytophthora spp.causing root rot of mandarin citrus)。

技术实现要素：

7.针对烟草土传病害严重威胁着烟草农业可持续发展且难于防治的问题，本发明提供一株褐红篮状菌(talaromyces pinophilus)xbtp4及其在烟草生物防治中的应用。该真菌分离自烟草根部，对多种植物病原菌以及植物病原菌引发的烟草病害具有良好的拮抗抑制作用，同时还对烟草具有良好促生效果。基于上述研究成果，从而完成本发明。
8.具体地，本发明的技术方案如下所述：
9.本发明的第一个方面，提供一株褐红篮状菌(talaromyces pinophilus)xbtp4，该菌株已于2021年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为cgmcc no.23832。
10.本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述褐红篮状菌或其发酵物或其代谢产物。
11.本发明的第三个方面，提供上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂的应用，所述应用选自下述1)-3)中的至少一项：
12.1)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备抑制病原菌的产品中的应用；
13.2)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备抑制病害的产品中的应用；
14.3)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备促进植物生长的产品中的应用。
15.其中，所述病原菌具体为植物病原菌，包括但不限于烟草疫霉菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌。
16.所述病害为植物病害，具体可以为上述植物病原菌引起的植物病害，如由烟草疫霉菌引起的烟草黑胫病，茄病镰刀菌引起的烟草镰刀菌根腐病以及立枯丝核菌无性世代引起的烟草立枯病与其有性世代引起的烟草靶斑病。
17.所述植物，在本发明中优选为烟草。
18.其中，所述促进植物(烟草)生长至少表现为：
19.3-1)促进植物的株高、整株鲜重以及鲜根重；
20.3-2)促进植物叶绿色和丙二醛含量的积累；
21.3-3)提高植物防御酶活性；
22.3-4)提高土壤酶活性；
23.3-5)提高植株营养元素吸收和含量。
24.所述3-3)中，植物防御酶包括sod酶和pod酶；
25.所述3-4)中，所述土壤酶包括脲酶和酸性磷酸酶；
26.所述3-5)中，所述营养元素包括钾、钙及镁。
27.本发明的第四个方面，提供一种防治烟草病害的方法，所述方法包括向烟草生境中施加上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂。
28.本发明的第五个方面，提供一种促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草生境中施加上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂。
29.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
30.上述技术方案通过室内平板培养和活体温室防效筛选出一株生防内生真菌褐红篮状菌(talaromyces pinophilus)xbtp4，该菌株对烟草疫霉菌、茄病镰刀菌、立枯丝核菌等均有很好的拮抗活性，且试验证明其对烟草植株安全有效，并具有良好的促生效果，因此可用于连作土壤条件下烟草土传真菌性病害，是一种新型优质的微生物农药资源，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
31.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1为本发明实施例1中xbtp4菌株对p.nicotianae的拮抗活性(接种后16天)。
33.图2为本发明实施例1中xbtp4菌株对f.solani的拮抗活性(接种后8天)。
34.图3为本发明实施例1中xbtp4菌株对r.solani的拮抗活性(接种后5天)。
35.图4为本发明实施例1中xbtp4菌丝对r.solani的抑制活性显微观察图。
36.图5为本发明实施例1中xbtp4菌丝对疫霉菌的抑制活性显微观察图。
37.图6为本发明实施例2中内生真菌xbtp4菌株对烟草黑胫病的盆栽防效。
38.图7为本发明实施例2中内生真菌xbtp4显著提高叶片的叶绿素含量。
39.图8为本发明实施例2中xbtp4菌株对叶片丙二醛含量影响。
40.图9为本发明实施例2中xbtp4菌株对叶片sod和pod酶活性影响。
41.图10为本发明实施例2中内生真菌xbtp4菌株对土壤脲酶活性影响。
42.图11为本发明实施例2中xbtp4菌株对土壤蔗糖酶活性影响。
43.图12为本发明实施例2中xbtp4菌株对土壤pod酶活性影响。
44.图13为本发明实施例2中xbtp4菌株对土壤cat酶活性影响。
45.图14为本发明实施例2中xbtp4菌株对k326烟苗地上部(左)和根系(右)的促生效果。
46.图15为本发明实施例3中xbtp4菌株粗提代谢物对疫霉菌菌丝生长的抑制效果a:200μg/ml，b:400μg/ml，c:800μg/ml，d:ck。
具体实施方式
47.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
48.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数
形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
49.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株褐红篮状菌(talaromyces pinophilus)xbtp4，该菌株已于2021年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为cgmcc no.23832。本发明的褐红篮状菌xbtp4是从一株烟草的根内部分组织离获得，是一株烟草内生菌。
50.本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述褐红篮状菌或其发酵物或其代谢产物。
51.本发明所述发酵物用于指代发酵产品。相应的发酵物可以从发酵培养褐红篮状菌xbtp4的过程中获得，基于培养形式的差异，可以为固体发酵物或液体发酵物，液体发酵物也可称为发酵液或培养液；本发明所述的发酵物中包含菌体及其代谢产物。在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为上清液，并且在本发明中，上清液内含有褐红篮状菌xbtp4的代谢产物。
52.本发明的又一具体实施方式中，提供上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂的应用，所述应用选自下述1)-3)中的至少一项：
53.1)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备抑制病原菌的产品中的应用；
54.2)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备抑制病害的产品中的应用；
55.3)上述褐红篮状菌xbtp4或上述微生物菌剂在制备促进植物生长的产品中的应用。
56.上述产品可以为农药。
57.在本发明的又一具体实施方式中，所述病原菌具体为植物病原菌，包括但不限于烟草疫霉菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌。
58.所述病害为植物病害，具体可以为上述植物病原菌引起的植物病害，如由烟草疫霉菌引起的烟草黑胫病，茄病镰刀菌引起的烟草镰刀菌根腐病以及立枯丝核菌无性世代引起的烟草立枯病与其有性世代引起的烟草靶斑病。
59.所述植物，在本发明中优选为烟草。
60.在本发明的又一具体实施方式中，所述促进植物(烟草)生长至少表现为：
61.3-1)促进植物的株高、整株鲜重以及鲜根重；
62.3-2)促进植物叶绿色和丙二醛含量的积累；
63.3-3)提高植物防御酶活性；
64.3-4)提高土壤酶活性；
65.3-5)增加植株中营养元素吸收和含量。
66.所述3-3)中，植物防御酶包括sod酶和pod酶；
67.所述3-4)中，所述土壤酶包括脲酶和酸性磷酸酶；
68.所述3-5)中，所述营养元素包括钾、钙及镁。
69.本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物农药，所述微生物农药其活性成分包含上述褐红篮状菌和/或微生物菌剂。
70.需要说明的是，上述农药在本发明中应做广义理解。本发明中，所述农药是指农业上用于防治病害及调节植物生长的药剂。按照原料来源其可归属于微生物农药。其可以是任意已知的适于微生物农药的剂型，包括但不限于粉剂、乳剂、乳油、乳膏、糊剂、胶体剂、熏蒸剂、熏烟剂、烟雾剂、颗粒剂、微粒剂及油剂等。
71.在本发明的又一具体实施方式中，所述农药还可以包含任意符合农药领域使用的辅料成分，在此不做具体限定。
72.本发明的又一具体实施方式中，提供一种防治烟草病害和/或促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草生境中施加上述褐红篮状菌xbtp4、上述微生物菌剂或上述微生物农药。
73.所述病害为植物病害，具体可以为上述植物病原菌引起的植物病害，如由烟草疫霉菌引起的烟草黑胫病，茄病镰刀菌引起的烟草镰刀菌根腐病以及立枯丝核菌引起的烟草立枯病与烟草靶斑病。
74.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中供试病原菌均由中国农业科学院烟草研究所分离保存所有。
75.实施例1
76.t.pinophilus xbtp4菌株对寄生疫霉菌、茄病镰刀菌及立枯丝核菌的拮抗活性
77.以疫霉菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌为靶标菌，采用对峙法在室内平板条件下测定拮抗活性。具体方法如下：用外径为6mm的打孔器在预先活化的疫霉菌、镰刀菌和立枯丝核菌培养平板分别打孔，取出菌块，接种至平板中央，同样将至距离靶标菌菌饼1.5cm处各接种1个xbtp4菌株的菌饼，28℃恒温黑暗条件对峙培养，每处理3次重复。培养10天后观察菌株间对峙的拮抗作用。
78.xbtp4菌株对烟草疫霉菌、茄病镰刀菌、立枯丝核菌均有很好的拮抗活性，主要表现为：xbtp4菌丝可以阻止上述3种病原真菌的菌丝上生长，并与其竞争营养和空间从而在病原菌菌丝上扩展繁殖，导致病原真菌菌丝死亡(图1，2，3)，且xbtp4菌最终扩展至长满平板，稳定的发挥其抑菌作用。
79.光学显微观察结果(图4)显示：正常立枯丝核菌菌丝外形规则，内含物在菌丝细胞壁内分布均一、较透明(右图)。对峙后7天，立枯丝核菌菌菌丝内部物质集结成团呈囊泡状且较混乱分布，菌丝粗细不均变畸形或破损(左图)，从而不能正常生长。
80.光学显微观察结果(图5)显示：正常疫霉菌菌丝外形规则，生长顺直均匀，(图右)。xbtp4菌株处理对峙7天后，被xbtp4菌丝缠绕的疫霉菌丝受压迫后内容物凝聚变混乱，菌丝扭曲、折断或粗细不均呈畸形(图左)，从而导致疫霉菌菌丝不能正常生长。
81.内生真菌xbtp4菌株对烟草黑胫病的防治效果
82.xbtp4菌孢子粉剂制备：将xbtp4菌株在燕麦固体培养基平板活化培养5d后，用无菌打孔器在菌落边缘打取5个直径为6mm菌块，接种于燕麦液体培养基中，26℃、120ppm转速振荡黑暗培养21d后，低温4℃、8000rpm离心8分钟后，取菌丝球与孢子混合液与适量硅藻土混合均匀，至浓度为5x108个孢子/克，阴凉处晾干后碾碎即获得孢子粉，备用。
83.按照1：9比例将孢子粉与灭菌基质混合后，基质含孢子浓度5x107个孢子/克。供试烟苗为品种为k326、移栽生育期为30d，空白对照为未处理的灭菌基质；每处理7盆，各三次
重复。移栽后的烟苗钵内土壤浸透水分后置于30℃、相对湿度80％的温室内培养，接种后7d，在每钵烟苗茎基部挖穴并置入1克菌谷(菌谷制作方法：将谷子煮至约一半谷粒开花捞出，装入三角瓶高压灭菌1h。将已培养好的黑胫病菌种，接种到灭菌后冷却的谷子上，然后置于28℃～30℃下培养15d～20d即成。《烟草品种抗病性鉴定》，2009)，封穴后浇水使花盆土壤湿润，继续培养至7天后观察烟苗发病情况，14d时(空白对照烟苗发病率超过50％后)开始调查各处理烟苗发病严重度、计算病情指数和防治效果。严重度分级应符合gb/t23222的规定。
84.附：烟草青枯病和黑胫病病害严重度分级调查标准
85.黑胫病(以株为单位)：
86.0级：全株无病；
87.1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎；
88.3级：茎部病斑环绕茎围1/3-1/2，或1/3-1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；
89.5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2-2/3叶片凋萎；
90.7级：茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎；
91.9级：病株基本枯死。
92.病情统计方法如下：
93.a)发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)
×
100
94.b)病情指数＝[∑(各级病株数
×
各级病级值)]/(调查总株数
×
最高级值)
×
100
[0095]
c)防效(％)＝[1-(处理区药后病指
×
对照区药前病指)/(处理区药前病指
×
对照区药后病指)]
×
100
[0096]
菌株xbtp4孢子粉对烟草黑胫病的温室防治效果明显，能推迟黑胫病发生时间和减轻发生程度(图6)。与空白对照相比，经xbaa1孢子粉剂处理的烟苗发病延迟5d；在接种后第14d时，xbaa1处理烟苗发病较轻，发病率为14.28％，病情指数为9.5，防效为78.05％，而对照处理发病程度较重，接种后14d，烟苗发病率为72.68，病情指数为46.07；即菌株xbtp4孢子粉剂对烟草黑胫病具有较好的盆栽防治效果。
[0097]
实施例2内生真菌xbtp4对烟草的促生效应
[0098]
1.盆栽促生效果测定
[0099]
xbtp4菌株孢子悬浮液制备：将xbtp4菌株在燕麦固体培养基平板活化培养5d后，用无菌打孔器在菌落边缘打取5个直径为6mm菌饼，接种于燕麦液体培养基中，26℃、120ppm转速振荡黑暗培养14d后，miracloth膜过滤后采用血球计数板测定孢子数量，经适量无菌水稀释培养液后的分生孢子浓度为1x108个孢子/ml，备用。
[0100]
吸取15ml孢子液灌根方式接种于生育期为35d、品种k326的盆栽烟苗，等量无菌水处理每个处理20盆，3次重复。接种后的供试烟苗置于22-28℃、相对湿度为60-80％人工气候室内培养，常规温室管理。接种后3周，选取每处理(10盆)调查烟苗株高、整株鲜重、鲜根重，然后180℃烘干至恒重，测整株干重及根干重及叶片的叶绿素和丙二醛含量等生物量积累的相关指标，收集各处理剩余盆栽烟苗的根际土壤、根系及地上部烟苗植物组织测定烟株防御酶活性(sod酶、pod酶)、土壤酶活性(脲酶和酸性磷酸酶)和植物体内中微量营养元素钾、钙、镁变化。具体指标测定方法如下：
[0101]
2.1叶片叶绿素含量测定
[0102]
1)取新鲜烟草叶片，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。
[0103]
2)将取好的样品放入25ml容量瓶中，加浸提液20ml，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml，摇匀备用。
[0104]
3)把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。选择波长od
663
、od
646
。
[0105]
4)计算方法：
[0106]
叶绿素a的浓度＝12.21xod
663
–
2.81xod
646
[0107]
叶绿素b的浓度＝20.13xod
646
–
5.03xod
663
[0108]
色素含量(mg/g)＝cxv(提取液体积，ml)/m/1000
[0109]
5)注意事项：操作需避光。
[0110]
试验结果表明：内生真菌xbtp4菌株处理后的烟草叶片叶绿素含量明显增高，结果如图7所示，经xbtp4菌株处理后叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b含量分别为0.98mg/g、0.47mg/g和1.45mg/g；与清水对照比较，叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b含量的增长率分别为75.00％、74.02％及76.83％。上述结果说明内生真菌菌株xbtp4能显著增强烟草叶片光合作用强度，叶片以合成更多的碳水化合物为烟草生长发育提供能量，促长效果明显。
[0111]
2.2丙二醛(mda)含量测定
[0112]
采用硫代巴比妥酸(tba)法测定。试验试剂：10％三氯乙酸(tca)；0.6％硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠(1mol/l)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。试验材料：收集xbaa1和空白对照处理的烟苗叶片。操作方法如下：
[0113]
mda的提取:称取剪碎的叶片1.0g，加入2ml 10％tca和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml tca进一步研磨，匀浆离心(4000
×
g)10min，上清液为样品提取液。显色反应测定：吸取离心后上清液2ml(对照处理为加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6％tba溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。
[0114]cmda
＝6.45(a
532-a
600
)-0.56a
450
(μmol
·
l-1
)
[0115]
提取液中mda浓度(μmol
·
ml-1
)＝c
mda
×
(反应液体积(ml)/1000)
[0116]
mda含量(μmol
·
g-1
fw)＝(提取液中mda浓度(μmol
·
ml-1
)
×
提取液总量)/植物组织鲜重(g)
[0117]
上述试验结果表明：丙二醛(mda)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量反映植物遭受逆境伤害的程度。mda的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。在本实例中，内生真菌xbtp4菌株处理后的烟草叶片丙二醛含量明显降低，三个重复的平均值为0.40μmol
·
g-1
，而清水对照mda平均含量为0.87μmol
·
g-1
，较对照降低了54.55％(图8)。上述结果说明，内生真菌xbtp4菌株可以较强的抑制叶片内丙二醛的生成，明显提高烟苗的抗逆性，从而减轻烟苗受伤害的程度。
[0118]
2.3烟草防御酶-超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)活性
[0119]
1)sod酶
[0120]
酶液的提取：各称取0.5g的烟草组织，各加入2ml预冷的提取介质，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内各研磨成匀浆，用提取缓冲液冲洗研钵2～3次，在试管中定容到10ml，取5ml于刻度离心管中，于4℃，10000r/min，离心10min，上清液即为sod酶粗提液。
[0121]
酶活性测定：根据样品数量取若干洗净玻璃试管，分别加入1.5ml磷酸缓冲液，0.3ml蛋氨酸，0.3mlnbt，0.3mledta，0.3ml核黄素溶液，0.1ml粗酶液，0.2ml ddh2o补齐至3.0ml。
[0122]
sod活性的计算：
[0123]
sod活性(u/gfw.h)＝[(ack-as)
×v×
60](ack
×
fw
×a×
t
×
0.5)
[0124]
ack为对照管溶液在560nm处的吸光度值；
[0125]
as为样品测定管溶液在波长560nm处的吸光值；
[0126]
v为酶液总体积(ml)；
[0127]
fw为提取酶液的植物材料的鲜重(g)；
[0128]
a为显色反应时酶液用量(ml)；
[0129]
t为显色反应所用时间(min)
[0130]
2)pod酶
[0131]
pod的提取：分别称取茎和叶片共2g，分别加入预冷的10ml 20mmol/l kh2po4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml kh2po4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处od值，每隔30s读数一次。pod活性的计算如下：
[0132]
以每分钟光密度变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即
[0133]
pod活性＝[δod470/(0.01
×w×
t)]
×d[0134]
其中，w为样品鲜重(g)，t为反应时间(min)，d为稀释倍数(本实验为10倍)
[0135]
上述试验结果显示：内生真菌xbtp4菌株处理后的叶片超氧化物歧化酶活性发生了变化，结果如图9所示，与ck处理相比，经xbtp4菌株处理后叶片sod活性变化降低，为73.17u/g fw
·
h与ck处理相比降低了64.48％。sod酶是植物抗氧化酶，经xbtp4菌株处理后的叶片超氧化物歧化酶大幅度降低，说明该菌株通过促进烟苗植株快速生长，植物组织内积累的活性氧较少，因此sod酶活性较低。
[0136]
内生真菌xbtp4菌株处理后的叶片过氧化物酶活性发生了变化，结果如图9所示，与ck组相比，经xbtp4菌株处理后叶片pod活性亦降低，含量为170.28u/g fw
·
h，比ck处理降低了73.09％。叶片pod酶能还原植物组织内的过氧化氢，或氧化氢含量高则导致植物衰老。该酶在植物体内参与两方面活动：一是植物正常生长和形态发生，在植物生长发育中起作用；二是与植物抗逆抗病相关，是植物保护酶系的重要保护酶之一。经xbtp4菌株处理后的叶片过氧化物酶大幅度降低，说明xbaa1菌株可以始终使叶片h2o2保持在一个较低浓度水平下，减少其对植物体的伤害，从而有利于烟苗生长发育。
[0137]
2.4土壤酶活性测定
[0138]
2.4.1脲酶
[0139]
采用靛酚比色法。
[0140]
标准曲线绘制：分别取氮的工作液1、3、5、7、9、11、13ml于50ml比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水加至20ml。再加4.0ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。
[0141]
称5.00g根际土样，置于50ml三角瓶中，加入1.0ml甲苯。15min后加10ml10％尿素
液和20mlph6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取3.0ml上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为2.0ml；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5ml)于50ml刻度试管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
[0142]
结果计算：脲酶活性以24h后1g土壤中nh
3-n的毫克数表示。
[0143]
nh
3-n(mg)＝a
×b[0144]
式中a-从标准曲线查得的nh
3-n浓度，mg/ml；b-换算成1g土的系数。
[0145]
上述试验结果如图10所示：xbtp4菌株可以明显提高土壤脲酶活性。xbtp4菌株处理后的土壤脲酶活性为19.92mg nh
3-n/g/24h，对照处理土壤脲酶活性为14.20mg nh
3-n/g/24h，增长率为40.28％。土壤脲酶是催化尿素水解的唯一酶类，其活性与土壤肥力，即有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。因此，xbaa1菌株提高土壤脲酶活性，进而能够促进土壤中氮素的释放、提高土壤n素含量和肥力。
[0146]
2.3.2蔗糖酶
[0147]
1.以蔗糖为基质，蔗糖液浓度范围为5-20％。在酸性介质中，蔗糖酶活性最大。为保持该酶最适ph，多使用下列缓冲液：醋酸盐缓冲液(ph4.5-5.5)，磷酸盐缓冲液(ph4.9-5.5)，醋酸盐-磷酸盐缓冲液(ph5.5)。
[0148]
2.试剂配制
[0149]
(1)3，5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2n氢氧化钠和50ml水中，再加18.2g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml。
[0150]
(2)ph5.5磷酸缓冲液：1/15m磷酸氢二钠(11.867g na2po4·
2h2o溶于1l蒸馏水中)0.5ml加1/15m磷酸二氢钾(9.078kh2po4溶于1l蒸馏水中)9.5ml即成。
[0151]
(3)8％蔗糖溶液
[0152]
(4)甲苯
[0153]
(5)标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中(5mg还原糖/ml)，即成标准葡萄糖溶液。
[0154]
标准曲线绘制：取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中，与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色。
[0155]
3.试验步骤
[0156]
称取2.0g新鲜根际土样，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8％蔗糖溶液，5ml ph5.5磷酸缓冲液和0.25ml甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水杨酸，并在沸水的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
[0157]
上述试验结果如图11所示：内生真菌菌株xbtp4可以明显提高土壤蔗糖酶活性，如图11所示，xbtp4菌株处理后的酶活性为49.73u/mg，对照处理蔗糖酶活性为43.07u/mg，增长率为15.46％。蔗糖酶又叫转化酶，能分解蔗糖为两个单糖，表征土壤分解利用能量的效率，在增加土壤中易溶营养物质。一般来说，土壤肥力越高，土壤蔗糖酶活性越高。因此，xbtp4菌株能提高土壤营养，促进烟苗健康生长。
[0158]
2.4.3土壤过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)活性
[0159]
2.4.3.1pod酶测定与结果分析
[0160]
1.试剂配制
[0161]
(1)1％邻苯三酚溶液
[0162]
(2)0.5％h2o2溶液
[0163]
(3)乙醚
[0164]
(4)0.5mol/l hcl
[0165]
(5)ph4.5柠檬酸-磷酸缓冲溶液:0.1mol/l柠檬酸溶液：19.2g c6h7o8溶至1l。0.2mol/l磷酸氢二钠溶：53.63g na2hpo4.7h2o或者71.7g na2hpo4.12h2o溶至1l。取10.65ml柠檬酸和9.35mlna2hpo4混匀(用量较多可以乘以倍数配制)，之后再用这两种溶液调节ph即可。
[0166]
(6)重铬酸钾标准溶液以及标准曲线：0.75g重铬酸钾溶于1l0.5molhcl。此时的溶液相当于50ml醚中含有5mg紫色没食子素。
[0167]
(7)标准曲线：取重铬酸钾标准溶液0、1、2、4、6、8ml，用0.5mol的hcl稀释至50ml。定容后，在分光光度计于430nm处比色测定。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0168]
2.具体实验步骤
[0169]
取1.0g土壤置于150ml三角瓶中，然后注入10ml1％邻苯三酚溶液和2ml0.5％h2o2溶液。震荡后放置30℃恒温培养箱中培养2小时。取出后加4ml ph4.5的柠檬酸-磷酸缓冲溶液，再加35ml乙醚，用力震荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相比色。比色波长为430nm。为了防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。实验需设置空白实验作为对照。
[0170]
过氧化氢酶活性，以2h后，1.0g土壤生成的紫色没食子素毫克数表示。
[0171]
过氧化物酶活性＝(a样品-a空白)*v/m
[0172]
a为标曲上相对应的浓度，v为显色体积，即为乙醚的体积35ml。
[0173]
3.结果分析
[0174]
上述试验结果如图12显示：内生真菌菌株xbtp4可以明显提高土壤pod酶活性。xbtp4菌株处理后的酶活性为5.9025u/g，对照处理pod酶活性为4.3808u/g，增长率为34.74％。pod酶属于土壤中的氧化还原酶类，在有机质氧化和腐殖质形成过程中具有重要作用。因此，xbtp4菌株能提高土壤有机质氧化和腐殖质形成，从而促进烟苗健康生长。
[0175]
2.4.3.2cat酶
[0176]
1.试剂配制
[0177]
(1)0.3％过氧化氢溶液100ml：取1ml30％的过氧化氢溶液，在100ml容量瓶中定溶至100ml即可。
[0178]
(2)3n硫酸。
[0179]
(3)0.1n高锰酸钾溶液500ml：取7.9015g高锰酸钾溶于蒸馏水中，稀释至500ml，即得0.1n的高锰酸钾溶液。
[0180]
2.实验步骤
[0181]
取2g土壤样品，置于100ml三角瓶中，并注入40ml蒸馏水和5ml0.3％过氧化氢溶
液。将三角瓶放在摇床上，振荡20min。而后加入5ml 3n硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。然后，吸取25ml滤液，用0.1n高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点，所消耗的高锰酸钾量(ml数)记为b；另取一管不加土样作对照，按上述方法操作，即滴定25ml原始的过氧化氢混合液，所消耗的高锰酸钾量(ml数)记为a。
[0182]
3.计算
[0183]
以20min后1g土壤的0.1n高锰酸钾滴定的毫升数表示过氧化氢酶活性，即a-b为过氧化氢酶活性。单位：mg kmno4/g/min。
[0184]
4结果分析
[0185]
上述试验结果如图13显示：内生真菌菌株xbtp4可以明显提高土壤cat酶活性。xbtp4菌株处理后的cat酶活性为21.5759mg kmno4/g/min，对照处理cat酶活性仅为14.0971mg kmno4/g/min，增长率为53.05％。cat酶属于土壤中的氧化还原酶类，表征土壤腐殖质化强度大小和有机质积累程度。因此，xbtp4菌株有非常明显的增加土壤有机质积累、增加土壤腐殖质的强化程度，从而能很好的促进烟苗生长发育。
[0186]
2.5烟草植株中微量元素钾、钙、镁含量变化
[0187]
2.5.1方法
[0188]
接种xbtp4后20d，取适量烟苗的茎和叶片组织，备用。全钾含量测定采用盐酸小结浸提法。混合植物组织样品在干燥箱内设定75℃条件烘干后粉碎过18目筛(粒径≤1mm),过筛颗粒混合均匀后分成3份，分别测定钾、钙、镁含量，3次重复。分别称取0.250g放入25ml塑料瓶内，加入25ml的1mol/l盐酸,以频率160hz室温振荡1h，过滤吸取2ml滤液，加5％氯化镧0.5ml,蒸馏水稀释定容25ml后摇匀测定钾、钙、镁元素。上述操作内生菌处理和空白重复3次。
[0189]
2.5.2结果与分析
[0190]
2.5.2.1烟草生物量积累
[0191]
经褐红篮状菌xbtp4处理后对供试品种k326具有不同程度的促长效果(图14)，促长效果如表1所示：与清水对照处理对比，xbtp4菌株处能够明显促进烟草生长，整株鲜重和干重增长显著，且叶色浓绿，叶片厚、叶形增大；经xbtp4处理的烟株对株高、整株鲜重和干重、根干重促生效果明显，分别增长42.4％、55.32％、74.59％、84.73％，该菌株的促生效果很强，同时本实验也证明xbtp4菌对烟草是安全的。
[0192]
表1 xbtp4菌株对烟草生物量的积累
[0193][0194]
注：同列数据后字母不同代表差异显著(p≤0.01)。
[0195]
2.5.2.2内生真菌xbtp4促进烟草植株组织钾钙镁含量增加
[0196]
检测试验结果显示：内生真菌xbtp4促进烟株中微量元素钾、钙、镁合成和含量增
加。xbtp4处理镁、钾、钙含量三次重复均值分别为0.63g/kg、3.08g/kg及2.00g/kg；分别较空白对照增加了7.27％、3.52％及4.92％。钾钙镁是植物生长必需的营养元素，参与植物细胞生长代谢生理活动，对植物生长、抗逆和品质改善发挥着重要作用。尤其是针对烟草叶用经济作物，较高的钾钙镁含量对烟叶品质改善有良好的作用，能够满足优质烟的要求。因此，内生真菌t.pinophilus xbtp4菌株有利于烟株营养吸收和烟叶品质改善。
[0197]
实施例3内生真菌t.pinophilium xbtp4菌株次级代谢产物及拮抗活性内生真菌a.aureusxbaa1菌株次级代谢产物及拮抗活性
[0198]
(1)固体发酵培养：培养基配方为：大米80g，玉米浆0.2g，蛋白胨0.5g，蒸馏水100ml。按以上配方配制后平铺于1000ml三角瓶平底，至灭菌锅灭菌；接种菌饼后静止培养35d。发酵培养完成后，每发酵三角瓶加入350ml乙酸乙酯浸泡24h，重复3次浸提；最终取有机相进行旋蒸，甲醇洗脱出萃取物，室温蒸干后获得粗提代谢物，并溶于二甲基亚砜溶剂中，搅拌使其完全溶解，得到粗提液。
[0199]
(2)将适量代谢物粗提液过滤(细菌过滤器)除去细菌后与55℃燕麦培养基混合均匀，获得100，200，400，500，800和1000μg/ml浓度粗提物平板，备用。在预先活化的疫霉菌平板上打取5mm菌饼，并置于上述不同浓度粗提物平板中央，以加2％的吐温的平板处理做空白对照，盖上皿盖，置于28℃恒温培养箱培养，待空白对照的菌落快要长满培养皿时，用十字交叉法测量各处理菌落直径，每处理4次重复。根据菌落扩展直径计算菌丝生长抑制率、粗提代谢物对疫霉菌的毒力回归方程和抑制中浓度ec50值。计算公式如下：
[0200]
菌丝生长抑制率(％)＝[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]x100％
[0201]
如图15所示，随着粗提代谢物浓度增大，疫霉菌生长速度逐渐减弱，表现为菌丝稀疏甚至不生长。粗提代谢物浓度为100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，800μg/ml和1000μg/ml，其抑菌率分别为抑菌率分别为5.06％、17.72％、54.64％、62.03％、79.75％、83.76％，最终计算xbtp4粗提发酵物的ec
50
为490μg/ml。
[0202]
综上，本发明通过室内平板培养和活体温室防效首次筛选出一株褐红篮状菌(talaromyces pinophilus)xbtp4，该菌株分离自烟草根部，对由疫霉菌引起的烟草黑胫病、茄病镰刀菌引起的烟草镰刀菌根腐病及立枯丝核菌引起的烟草立枯病与烟草靶斑病菌均具有很强的拮抗抑制作用，同时对烟草具有促生效应、诱导烟株抗性、改善土壤酶活性及有助于烟株营养吸收和烟叶品质改善的能力。所述xbtp4及其微生物制剂能够有效预防和治疗连作土壤条件下烟草土传真菌性病害，该菌株及其此活性生代谢产物是新型优质的微生物农药来源，具有广阔的应用前景。
[0203]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。