首页 > 分享 > 基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用.pdf

基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用.pdf

花匠小妙招
2024-11-30 21:12

《基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用.pdf（15页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010295546.X (22)申请日 2020.04.15 (71)申请人南京农业大学地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人郭旺珍王海棠 (74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司 32218 代理人徐冬涛李晓峰 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/60(2018.01) (54)发明。

2、名称一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用 (57)摘要本发明公开一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明方法通过下胚轴茎段培养获得胚性愈伤组织，利用基因枪将包埋好的基因编辑质粒DNA转化棉花胚性愈伤细胞，经过恢复培养、筛选培养和体细胞胚分化获得基因编辑幼苗。本发明所提供的基因枪转化胚性愈伤再生的方法可以缩短棉花遗传转化周期，提高转化体效率，节约时间和工作量，在棉花基因功能研究和育种实践中具有重要的应用前景。权利要求书2页说明书8页附图4页 CN 111575311 A 2020.08.25 CN 111575。

3、311 A 1.一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1)棉花胚性愈伤的获得：将在苗培养基上培养的无菌苗下胚轴茎段置于胚性愈伤诱导培养基上进行胚性愈伤诱导培养，每2235天继代一次，更换新的培养基，直至胚性愈伤出现；挑取新诱导的胚性愈伤放在新的培养基中继代培养，待胚性愈伤转至米黄色的米粒状愈伤，选取愈伤状态一致的胚性愈伤作为基因枪轰击外植体； 2)基因枪轰击：将胚性愈伤继代在高渗培养基上培养后进行基因枪转化；所述的基因枪转化的过程为：吸取25 L彻底涡旋好的浓度为60mg/mL的金粉悬浮液，吸取10 L无菌超纯水，加入6 。

4、l浓度为500ng/uL的基因编辑质粒DNA，吸打混匀；加入50 L 2.5M的二水氯化钙，再加入20 L 3mg/mL的鱼精蛋白，快速混合涡旋后离心去除上清；加入200 L无水乙醇，涡旋以悬浮金粉颗粒，离心，再去除上清；重复该步骤一次；加入40 L无水乙醇，使金粉颗粒充分悬浮得到包埋好的金粉悬浮液；每枪用10 L包埋好的金粉悬浮液进行基因枪轰击； 3)恢复培养：基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养； 4)筛选培养：将恢复培养后的愈伤分为多个细胞群，小心继代在筛选培养基上，培养至可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代培养； 5)诱导体细胞胚分化。

5、培养：在筛选培养基上培养后，将长势良好的愈伤挑选至诱导体细胞分化的分化培养基上进行分化培养，每一个细胞群继代在一个培养瓶； 6)幼苗培育、炼苗及移栽：将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上培养后用清水洗净根部培养基，水培至有新的根长出来，将幼苗移栽培养完成整个生育期； 7)分子检测及基因编辑效率检测：待移栽植株长出新叶，取叶片提取总DNA，用于PCR检测，利用U6启动子和U6终止子设计引物，验证sgRNA是否成功转化；利用Cas9特异引物，验证 Cas9蛋白的转化结果；又分别在编辑位点的5 端和3 端，设计上游引物和下游引物，以叶片总DNA为模板，。

6、进行PCR扩增，将PCR产物纯化连接T载体，转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌液进行基因编辑的测序验证。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基本培养基：大量元素母液(50mLL-1)+铁盐母液(5mLL-1)+微量元素母液 (5mLL-1)+有机物母液(5mLL-1)+葡萄糖(30gL-1)+植物凝胶(3.0gL-1)+MgCl2 (1.0gL-1)；所述的苗培养基：大量元素母液(25mLL-1)+植物凝胶(7gL-1)， pH值调整为5.8；所述的愈伤诱导培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾， pH值调整为5.8；所述的高渗培养基：基本培养基+山梨。

7、醇(72.88gL-1)， pH值调整为5.8；所述的筛选培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾+50mgL-1卡那霉素， pH值调整为 5.8；所述的分化培养基：基本培养基-NH4NO3+0.5gL-1天冬酰铵+1.0gL-1谷氨酰铵， pH值为6.0。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中无菌苗和胚性愈伤组织培养、步骤(5)中体细胞胚分化培养和步骤(6)中再生苗培育的组培条件为：温度为282、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40-60、光照强度为1200015000Lx。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所。

8、述基因枪轰击的轰击条件：氦气压力为1150psi，靶距为6cm的轰击位置。权利要求书 1/2 页 2 CN 111575311 A 2 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的无菌苗为苗龄7d的无菌苗；所述茎段的长度为1.0-1.5cm；每2530天继代一次。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将胚性愈伤放在高渗培养基上培养4h用于基因枪转化，一次轰击0.2g胚性愈伤。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养16h，培养温度28。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征。

9、在于，步骤(4)中将恢复培养后的愈伤分为10-15 个直径不大于3mm的细胞群，小心继代在筛选培养基上， 4周后可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代再培养4周。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上，培养至4-5片真叶，用清水洗净根部培养基，水培2-3周直至有新的根长出来，将幼苗移栽在含有蛭石和基质的纸杯中， 1020天移栽到大盆，室外生长完成整个生育期。 10.权利要求19中任一所述的方法在棉花基因编辑中的应用。权利要求书 2/2 页 3 CN 111575311 A 3 一种基于基因枪介导的棉花基因编辑。

10、方法及应用技术领域 0001 本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及一种基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用。本发明利用植物组织培养技术，从棉花下胚轴茎段获得棉花胚性愈伤组织。通过基因枪转化胚性愈伤，经过筛选和体细胞再生培育， 3-4个月可获得基因编辑后代。背景技术 0002 棉花是天然纤维的来源，是我国重要的经济作物。自上世纪八十年代基因工程技术问世以来，经过三十余年的机理和技术研究的发展，基因工程在棉花育种中起到显著作用。上世纪九十年代后期，棉铃虫虫害大面积暴发，导致全球棉花产量和种植面积大量减少，甚至一度威胁棉花产业的生存。转基因Bt抗虫棉的。

11、培育和商业化应用，在棉花生产中发挥了重要作用。 Bt棉是指将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫基因导入棉花获得抗棉铃虫的转基因棉花，帮助棉农战胜棉铃虫灾害。尽管转基因棉花品种的商业化种植已经开放了近30年。然而成功地运用到生产上的还是仅限于Cry1A， Cry1c和EPSPS等几个基因。棉花的产量、纤维品质、抗病、抗逆等一直都是新品种选育的育种目标，相关的机理和机制解析也有很好的研究基础。孟超敏等综述了棉花抗逆境相关基因的研究进展，提出利用基因工程技术可成功地将棉花内源或外源的抗性相关基因转到棉花中，并获得相应表型显著提高的转。

12、基因材料，但是这些工作目前还限于实验室研究，未真正应用于育种实践(孟超敏等， 2012)。最近几年，棉花不同参考基因组的测序完成释放出大量的基因信息，为深入机理研究和深度挖掘基因组信息奠定了很好的基础和信息平台(Zhang et al.,2015； Hu et al.,2019)。 0003 CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，是一种当病毒和质粒侵入时自适应的免疫反应体系，利用向导RNA和靶DNA之间的碱基互补配对来实现识别功能，依赖多功能的Cas蛋白介导切割作用(Carroll,2012)。基因编辑技术在植物研究中应用广泛，不仅可以用来敲除基因，。

13、还可以用来定点插入、替换、染色体重组及多基因敲除(Dang et al., 2015)。相比传统的转基因方法，基因组编辑技术的主要优势是通过对DNA结合蛋白或者向导RNA的改造，实现对基因组上的位点进行靶向操作，能够更准确的实现目标基因整合或删除，已经成功的运用在模式植物和多种作物中(Kim et al.,2016； Chen et al.,2019)。 0004 棉花遗传转化方法主要有花粉管通道法、农杆菌介导的遗传转化和基因枪轰击转化，这三种方法各有其优缺点。花粉管通道法是由我国分子植物育种学家周光宇先生提出，优点是不受基因型限制，无需建立体外再生体系，可以在。

14、大田直接进行，操作简便、缩短育种时间。该方法为我国棉花转基因育种做出了重要的贡献，利用该方法育出了转Bt基因抗虫棉、抗病虫、抗除草剂和增产、优质的转基因棉花材料(周光宇等， 1988；谢道昕等， 1991；李忠旺等， 2012)。该方法的限制因素有： 1)DNA整合机理不明确； 2)只适用于拥有显著表型，易于区分的亲本与 “供体DNA” 之间的整合； 3)受外部环境影响较大，只能在开花时期进行，注射部位定位模糊； 4)转化成功率低(周光宇等， 1988；段春燕等， 2006)。农杆菌介导法是棉花遗传转化最常用的方法。 Umbeck等(1987)第一次报道了农。

15、杆菌介导的棉花下胚轴遗传转说明书 1/8 页 4 CN 111575311 A 4 化及再生的技术体系。 Firoozabady等报道了农杆菌转化棉花子叶的再生体系。 Subramaniam等(2001)对农杆菌菌株株系、受体基因型、乙酰丁香酮、共培养的温度、筛选阶段起始时愈伤组织的大小和胚性愈伤组织的培养方式等棉花转化和再生过程的影响因子进行了研究，并形成了一套较完整的体系。金双侠等(2017)通过筛选驯化受体Jin668，提高了棉花转化效率和再生频率。棉花基因枪转化体系最早报道于1988年。 McCabe等(1988)以无菌的棉花种胚的胚轴切段为外植体，通过基因。

16、枪轰击后再继续培养为植株。 Finer等 (1990)报道了基因枪轰击棉花悬浮的胚性细胞的转化及再生方法。 Chlan等(1995)发表了以50mg/L卡那霉素的剂量筛选获得阳性转化细胞的Coker312品系的基因枪转化体系。在35 个检测植株中31个NPT基因阳性植株，同时指出之前的农杆菌转化体系需要10-12个月才能获得再生植株，而该方法可在轰击后三个月可得到移栽土里的再生植株(Chlan et al., 1995)。 0005 棉花基因枪体系的优化主要在于合适的转化外植体的选择，提高转化效率，缩短转化周期，并能够保证遗传稳定性。 Rech等(2008)以棉花种胚的胚轴作。

17、为轰击外植体，获得了转基因棉花。首先将无菌种子浸泡在无菌水中，促进胚轴的伸长。等胚轴露出后，再进行分离并以此作为基因枪轰击外植体。轰击后进行筛选培养，约2个月可获得转接到土壤的幼苗(Rech et al.,2008)。 Kanniah分别将分生组织作为外植体和悬浮胚性细胞系作为外植体的基因枪轰击转化及再生体系进行了系统总结和优化。分生组织作为外植体转化和再生体系最大的优点是大大缩短了转化再生周期，最快可以在轰击后一周内，将转化幼苗移栽到土里。缺点是： 1)分离合适的分生组织需要耗费人力和时间； 2)嵌合体现象严重； 3)分子检测需要等到下一代进行(Rajas。

18、ekaran,2013a)。悬浮胚性细胞系作为基因枪轰击外植体的优点是： 1)诱导出胚性细胞系可以长期保存，随时可以启动转化。 2)转化率可达4。其缺点是： 1)悬浮培养对细胞造成潜在生殖和发育的危害，畸形苗及不育现象时有发生； 2)悬浮培养的操作麻烦(Rajasekaran,2013b)。 0006 本发明涉及的一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法，该方法是基于无激素诱导的胚性愈伤组织分化技术，利用基因枪轰击，经过恢复培养、筛选培养和再生培养获得再生苗。通过不同载体的转化证明，该方法具有转化效率高、再生周期短、转基因植株正常生长发育等优势，对棉花基因功能。

19、研究和育种实践具有重要的作用。发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及其应用。本发明方法通过植物组织培养，获得棉花下胚轴茎段的胚性愈伤组织，利用基因枪轰击将包埋好的基因编辑质粒DNA转化棉花胚性愈伤细胞，经过恢复培养、筛选培养和体细胞胚分化获得基因编辑幼苗。 0008 本发明的目的通过以下技术方案实现： 0009 一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法，该方法包括以下步骤： 0010 1)棉花胚性愈伤的获得：将在苗培养基上培养的无菌苗下胚轴茎段置于胚性愈伤诱导培养基上进行胚性愈伤诱导培养，每2235天继代一次，更换新的培养基，直。

20、至胚性愈伤出现；挑取新诱导的胚性愈伤放在新的培养基中继代培养，待胚性愈伤转至米黄色的米粒状愈伤，选取愈伤状态一致的胚性愈伤作为基因枪轰击外植体；说明书 2/8 页 5 CN 111575311 A 5 0011 2)基因枪轰击：将胚性愈伤继代在高渗培养基上培养后进行基因枪转化；所述的基因枪转化的过程为：吸取25 L彻底涡旋好的浓度为60mg/mL的金粉悬浮液，吸取10 L无菌超纯水，加入6 l浓度为500ng/uL的基因编辑质粒DNA，吸打混匀；加入50 L 2.5M的二水氯化钙，再加入20 L 3mg/mL的鱼精蛋白(protamine)，快速混合涡旋后离。

21、心(优选为快速混合涡旋3min，离心30s)去除上清；加入200 L无水乙醇，涡旋以悬浮金粉颗粒，离心，再去除上清；重复该步骤一次；加入40 L无水乙醇，使金粉颗粒充分悬浮得到包埋好的金粉悬浮液；每枪用10 L包埋好的金粉悬浮液进行基因枪轰击，一次轰击0.2g胚性愈伤； 0012 3)恢复培养：基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养； 0013 4)筛选培养：将恢复培养后的愈伤分为多个细胞群，小心继代在筛选培养基上，培养至可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代培养； 0014 5)诱导体细胞胚分化培养：在筛选培养基上培养后，将长势良好的愈伤挑选至。

22、诱导体细胞分化的分化培养基上进行分化培养，每一个细胞群继代在一个培养瓶； 0015 6)幼苗培育、炼苗及移栽：将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上培养后用清水洗净根部培养基，水培至有新的根长出来，将幼苗移栽培养完成整个生育期； 0016 7)分子检测及基因编辑效率检测：待移栽植株长出新叶，取叶片提取总DNA，用于 PCR检测，利用U6启动子和U6终止子设计引物，验证sgRNA是否成功转化；利用Cas9特异引物，验证Cas9蛋白的转化结果；又分别在编辑位点的5 端和3 端，设计上游引物和下游引物，以叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR产物纯。

23、化连接T载体，转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌液进行基因编辑的测序验证。 0017 作为一种优选技术方案： 0018 所述的基本培养基：大量元素母液(50mLL-1)+铁盐母液(5mLL-1)+微量元素母液(5mLL-1)+有机物母液(5mLL-1)+葡萄糖(30gL-1)+植物凝胶(3.0gL-1)+MgCl2 (1.0gL-1)。 0019 所述的苗培养基：大量元素母液(25mLL-1)+植物凝胶(7gL-1)， pH值调整为 5.8； 0020 所述的愈伤诱导培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾， pH值调整为5.8； 0021 所述的高渗培养基：基本培养基+山梨醇(。

24、72.88gL-1)， pH值调整为5.8； 0022 所述的筛选培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾+50mgL-1卡那霉素， pH值调整为5.8； 0023 所述的分化培养基：基本培养基-NH4NO3(不包含NH4NO3的基本培养基)+0.5gL-1 天冬酰铵+1.0gL-1谷氨酰铵， pH值为6.0。 0024 进一步优选的，步骤(1)中无菌苗和胚性愈伤组织培养、步骤(5)中体细胞胚分化培养和步骤(6)中再生苗培育的组培条件为：温度为282、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40-60、光照强度为1200015000Lx。 0025 进一步优选的，步骤(。

25、2)中打开真空泵和基因枪电源开关，基因枪的转化可采用 Bio-Rad公司的PDS 1000/He基因枪或其他公司类似设备，所述基因枪轰击的轰击条件：氦气压力为1150psi，靶距为6cm的轰击位置。 0026 进一步优选的，步骤(1)中所述的无菌苗为苗龄7d的无菌苗；所述茎段的长度为 1.0-1.5cm；每2530天继代一次。说明书 3/8 页 6 CN 111575311 A 6 0027 进一步优选的，步骤(2)中将胚性愈伤放在高渗培养基上培养4h用于基因枪转化，一次轰击0.2g胚性愈伤。 0028 进一步优选的，步骤(3)中基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养16。

26、h，培养温度28。 0029 进一步优选的，步骤(4)中将恢复培养后的愈伤分为10-15个直径不大于3mm的细胞群，小心继代在筛选培养基上， 4周后可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代再培养4周。 0030 进一步优选的，将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上，培养至4-5片真叶，用清水洗净根部培养基，水培2-3周直至有新的根长出来，将幼苗移栽在含有蛭石和基质的纸杯中， 1020天移栽到大盆，室外生长完成整个生育期。 0031 上述的方法在棉花基因编辑中的应用。 0032 本发明的优点表现在： 0033 (1)无需激素诱导即可获得胚性愈伤细胞。传。

27、统的棉花胚性愈伤诱导体系依赖2, 4-D和KT的作用，而2,4-D对植物细胞有一定的毒性，本发明中使用不含激素的培养条件培养下胚轴茎段， 2-3个月可出现胚性愈伤组织，体细胞胚明显大于激素诱导的体细胞胚，畸形苗率低，幼苗更健壮，易成活， T0代结实率高。 0034 (2)高效的转化方式可帮助提高基因编辑效率。本发明中提供的基因枪转化方法会产生大量的瞬时转化产物，这些瞬时转化产物不会整合在植物基因组上，但仍可以起到编辑作用，相比较少量的稳定转化体系提供了更高的编辑效率。另外，本发明中的愈伤细胞的高渗培养技术，可以提高基因枪转化效率。 0035 (3)缩短棉花遗。

28、传转化周期，节约时间和工作量。本发明所提供的基因枪轰击胚性愈伤细胞经培养获得再生苗的方法，较以茎段为外植体的方法，省去了前期的胚性愈伤诱导工作。茎段为外植体的方法中，每个茎段所诱导的愈伤组织被认定为一个独立转化事件，因此，需要培养大量的茎段，才可获得研究所需的独立转化事件数。棉花属于难分化的植物，诱导胚性愈伤组织的时间较长，再加上茎段为外植体的转化方式需筛选和愈伤诱导步骤，获得胚性愈伤所需时间会更长，工作量很大。本发明中所提供的方法是前期在无需激素诱导的条件下快速获得大量的胚性愈伤，以0.2g的胚性愈伤为一次轰击对象，获得10-15个独立转化事件，。

29、大大节约了愈伤组织培养的工作量和时间成本。附图说明 0036 图1棉花基因枪遗传转化及再生流程。 0037 图2pKSE401载体图。 0038 图3sgRNAs在GhGL2和GhGL3基因上的位置。 0039 图4基因编辑后代中sgRNA片段和Cas9基因的PCR检测结果。 A图表示后代中 sgRNA1、 sgRNA2、 sgRNA3片段的PCR检测结果， M表示5K的DNA Marker， P表示sgRNA-pKSE401 质粒， WT为受体对照， 3-11等分别为不同的sgRNA-pKSE401转基因T0代单株。 0040 图5基因编辑T0代植株测序结果。 GhGl2和GhGl3基因。

30、在棉花T0代植株的编辑情况。黑色背景白色字体标注的是PAM位点，灰色背景白色字体标注是靶点序列，灰色背景黑色字体标注是基因编辑结果， -2代表2个碱基的缺失。说明书 4/8 页 7 CN 111575311 A 7 0041 图6野生型和基因编辑T0代的表型。 A为WT受体对照， B-H分别为sgRNA-pKSE401转基因T0代不同单株的叶片表型。 0042 图7T0代基因编辑植株中基因表达量和棉酚含量检测结果。 A图为在基因编辑后代中目的基因表达量检测结果。 B图为在基因编辑后代中棉酚含量检测结果。具体实施方式 0043 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方。

31、法。 0044 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。 0045 组织培养过程中所涉及的培养基成分如下： 0046 基本培养基：大量元素母液(50mLL-1)+铁盐母液(5mLL-1)+微量元素母液 (5mLL-1)+有机物母液(5mLL-1)+葡萄糖(30gL-1)+植物凝胶(3.0gL-1)+MgCl2 (1.0gL-1)； 0047 苗培养基：大量元素母液(25mLL-1)+植物凝胶(7gL-1)， pH值调整为5.8； 0048 愈伤诱导培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾， pH值调整为5.8； 0049 高渗培养基：基本培养基+山梨醇(72。

32、.88gL-1)， pH值调整为5.8； 0050 筛选培养基：基本培养基+1.9gL-1硝酸钾+50mgL-1卡那霉素， pH值调整为5.8； 0051 分化培养基：基本培养基-NH4NO3+天冬酰胺(0.5gL-1)+谷氨酰胺(1.0gL-1)， pH 为6.0。 0052 表1基本培养基(MSB)母液配方表 0053 0054 说明书 5/8 页 8 CN 111575311 A 8 0055 实施例1：优化胚性愈伤组织的诱导体系； 0056 将在苗培养基培养7d苗龄的无菌苗下胚轴切成1.0-1.5cm长度的茎段，将茎段置于胚性愈伤诱导培养基进行胚性愈伤诱导培养，期间4周继代。

33、一次，更换新的培养基，直至胚性愈伤出现。挑取新诱导的胚性愈伤继代在新培养基培养，约2周后待胚性愈伤转至米黄色的米粒状愈伤，选取愈伤状态一致的胚性愈伤作为基因枪轰击的外植体，一次轰击0.2g 胚性愈伤； 0057 无菌苗和胚性愈伤组织培养的组培条件为：温度为282、光周期为白天/晚上 16h/8h、空气湿度为40-60、光照强度为1200015000Lx。 0058 实施例2： sgRNA-pKSE401载体的构建； 0059 登录http： / 将目标基因序列输入相应序列框，搜索高分靶点并评估脱靶情况；选定靶点序列后，按照以下规则设计引物： 0060 oligo。

34、-F： 5 -ATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 ； (N为PAM序列前19nt序列) 0061 oligo-R： 5 -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 ； (N为PAM序列前19nt序列的反向互补序列) 0062 将以上两个寡核苷酸链(每个100 mol/L)混合，在95加热5min，然后冷却至室温形成双链的插入片段，并且按照以下体系构建载体(见表2)；反应条件为： 375h， 50 5min， 8010min；将上述5 L混合液转化大肠杆菌感受态，并在含有50mg/L卡纳霉素的LB平板上选择阳性克隆，通过菌落PCR鉴定及测序，验证载。

35、体。 0063 表2sgRNA-pKSE401载体的构建体系 0064 0065 本研究以编辑棉花腺体形成相关基因GhGL2和GhGL3同源基因为例，其sgRNA序列为： 0066 sgRNA1-F：： 5 ATTgGTGGGTATACTCCATTTTC 3 0067 sgRNA1-R：： 5 AAACGAAAATGGAGTATACCCAC 3 0068 sgRNA2-F：： 5 ATTgATATCATCATGGAAGACTG 3 0069 sgRNA2-R：： 5 AAACCAGTCTTCCATGATGATAT 3 0070 sgRNA3-F：： 5 ATTgCGATGTGAC。

36、TGATTATGAG 3 0071 sgRNA3-R：： 5 AAACCTCATAATCAGTCACATCG 3 0072 实施例3：建立基因枪转化方法体系； 0073 1)质粒DNA的制备：将保存的sgRNA-pKSE401阳性大肠杆菌菌液划线活化，挑取单克隆小摇，然后吸取少量菌液扩大培养，运用质粒小提试剂盒(Magen,广州)提取质粒。 0074 2)基因枪轰击条件：将胚性愈伤继代在高渗培养基上培养4h，用于基因枪转化。基因编辑质粒DNA的包埋步骤：配置好60mg/mL的金粉；吸取25 L彻底涡旋好的金粉悬浮液，吸取10 L无菌的超纯水，加入6 l(3 g)。

37、基因编辑质粒DNA(500ng/uL)，吸打混匀。加入50 L 说明书 6/8 页 9 CN 111575311 A 9 2.5M的二水氯化钙，再加入20 L 3mg/mL的鱼精蛋白，快速混合涡旋3min，离心30s，去除上清，加入200 L无水乙醇，涡旋以悬浮金粉颗粒，离心，再去除上清。重复该步骤一次。加入40 L无水乙醇，使金粉颗粒充分悬浮。每枪用10ul包埋好的金粉悬浮液。打开真空泵和基因枪电源开关，基因枪的转化采用Bio-Rad公司的PDS 1000/He基因枪，轰击条件为：氦气压力为 1150psi，靶距为6cm的轰击位置； 0075 3)恢。

38、复培养：基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养16h，培养温度28； 0076 4)筛选培养：将恢复培养后的愈伤分为10-15个直径不大于3mm的细胞群，小心继代在筛选培养基上， 4周后可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代，再培养4 周。 0077 5)诱导体细胞胚分化培养：在筛选培养基上培养2个周期(8周)后，将长势好的愈伤挑选至分化培养基上进行体细胞诱导分化培养。每一个细胞群继代在一个培养瓶。 0078 6)幼苗培育、炼苗及移栽：将第5)步所获得的小苗，插在基本培养基，培养至4-5片真叶，用清水洗净根部培养基，水培2-3周直至有新的根长出来，。

39、将幼苗移栽在含有蛭石和基质的纸杯中， 2周左右可以移栽到大盆，室外生长完成整个生育期。 0079 筛选培养、体细胞胚分化培养和再生苗培育的组培条件为：温度为282、光周期为白天/晚上16h/8h、空气湿度为40-60、光照强度为1200015000Lx。 0080 实施例4：转化效率检测及基因编辑效率检测 0081 待移栽植株长出2-3个新叶，取叶片提取总DNA，用于PCR检测。利用U6启动子和U6 终止子设计引物，验证sgRNA是否成功转化，同时利用Cas9特异引物，验证Cas9蛋白的转化结果。 PCR检测体系采用2Rapid Taq Master Mix(V。

40、azyme公司)，如下表3；扩增程序为95 3min， 9515s， 6015s， 7215s(Cas9片段扩增的延伸时间为30s)， 30cycles， 72 7min， 45min。 0082 在编辑位点的5 端和3 端分别设计上游引物和下游引物以叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR产物纯化连接T载体，转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆菌液进行测序。 0083 转化效率检测表明：三个sgRNA载体的转化率均达到90以上(图4)。编辑效率检测表明，以sgRNA2的T0植株2-9-5为例， GhGL2和GhGL3基因同时被编辑(图5)。 0084 表3sgRNA靶点序。

41、列及Cas9的PCR检测体系 0085 0086 所述引物序列如下： 0087 U6-F： 5 TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC 3 0088 U6-R： 5 CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC 3 0089 Cas9-F： 5 GATTAAGTTCAGGGGCCATTTC 3 0090 Cas9-R： 5 CCTCATTCTCCTCGTTGTCCAG 3 0091 PCR-sgRNA1-F： 5 GTCGGTAATCTTCTTCGTCTTCTCTT 3 0092 PCR-sgRNA1-R： 5 TCAGCCTATTGATGGATT 3 说明书 7/8 页 1。

42、0 CN 111575311 A 10 0093 PCR-sgRNA2-F： 5 GTCGGTAATGTGAGCGTGTTAGAGAA3 0094 PCR-sgRNA2-R： 5 ATGGGCAGGTTGATTTGA3 0095 PCR-sgRNA3-F： 5 GTCGGTAAAGGAAAAGGTCGGGAAAA3 0096 PCR-sgRNA3-R： 5 TCTAACACGCTCACACTG 3 0097 实施例5：目的基因表达量和棉酚含量检测 0098 1)目的基因表达量的检测：取2-3片较嫩的叶片提取RNA， RNA提取选用RNA提取试剂盒(BioFlux公司提供)，然后通过反转。

43、录(HiScript Q-RT SuperMix for qPCR酶购于 Vazyme公司)获得cDNA，采用Bio-Rad公司的荧光定量PCR仪进行qPCR，计算并分析结果。结果说明，在基因编辑后代中，目的基因的表达量平均值均有显著下降，下降幅度最大可达到对照表达量的10以下(图7中A)。 0099 2)棉酚含量的测定：准确称取待测样品1.00g，液氮研磨后，加入丙酮10mL，室温提取60min， 253000r/min离心10min，重复提取2次，合并上清液。冻干后，用3mL乙腈-0.2 磷酸(v/v85 15)溶液溶解， 0.45 m的有机滤膜过滤后供超。

44、高效液相色谱(UPLC)测定。超高效液相色谱仪，型号： UltiMate 3000，厂家：美国Thermo公司；色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm100mm1.8 m)；流速： 0.2ml/min；时间： 10min； A(0.2磷酸)： B(乙腈)15： 85；柱温： 30，波长： 235nm，进样量2 L。棉酚含量测定结果表明，在基因编辑后代中棉酚含量显著降低，有些单株中含量则低到未能达到检测水平(图7中B)。说明书 8/8 页 11 CN 111575311 A 11 图1 说明书附图 1/4 页 12 CN 111575311 A 12 图2 图3 说明书附图 2/4 页 13 CN 111575311 A 13 图4 图5 图6 说明书附图 3/4 页 14 CN 111575311 A 14 图7 说明书附图 4/4 页 15 CN 111575311 A 15 。