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一种用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法与流程

花匠小妙招
2024-12-02 08:46

本发明属于竹类植物显微结构观察技术领域，具体涉及一种通过控制氢氟酸浓度和浸泡时间进行竹类植物叶片石蜡切片前预处理，以获得竹叶片完整内部解剖结构的方法。

背景技术

竹林是我国重要的植被生态类群，它不仅具有很高的生态效益，而且有很高的经济效益和社会效益。竹林在世界范围内分布广泛，被称为“世界第二大森林”。中国是世界竹类资源最丰富的国家，有竹子40多属500多种，竹种资源、竹林面积和蓄积量均居世界前列。竹类植物是能够影响居民日常生活的、具有多目标功能的植物，在改善小气候环境[郑钧，吴仁武，史琰，等.竹类植物的主要环境效应研究进展[j].浙江农林大学学报.2017，34(2)：374-380]、水土保持、环境保护、旅游发展方面具有重要意义。此外，竹子形态多姿优美，四季常绿，观赏价值高，被广泛用于美化环境和风景园林业，为人们提供良好的旅游和休闲场所[李岚，朱霖，朱平.中国竹资源及竹产业发展现状分析[j].南方农业.2017，11(1)：6-9]。竹叶是进行光合作用[杨丽，娄永峰，彭镇华，等.毛竹、麻竹光合途径类型分析[j].南京林业大学学报(自然科学版).2015，39(5)：169-173]、蒸腾作用和合成有机物质的主要器官，其结构特点对于功能具有重要的影响。竹叶内部解剖结构的观察对竹子的分类[丁雨龙，赵奇僧，陈志银，等.竹叶结构的比较解剖及其对系统分类意义的评价[j].南京林业大学学报.1994，18(3)：1-6]和系统发育具有一定重要的意义[钱领元，方伟.国产16种竹叶的比较解剖研究[j].竹子研究汇刊.1986，5(2)：78-86]。

竹叶内部解剖结构一直被许多学者所研究[朱振贤，张芬耀，宋盛，等.竹亚科植物分类研究进展[j].世界林业研究.2017，30(3)：35-40]，陈晓亚[陈晓亚，胡成华.方竹属(竹亚科)叶片表皮微形态特征[j].植物分类学报.1993，31(3)：227-235]等利用扫描电镜和光镜研究了方竹属叶表皮微形态，发现下表皮特征尤其是乳突对竹类植物分类研究具有重要意义，由此得出的分类结果与广义的方竹属分类基本吻合；丁雨龙[丁雨龙.刚竹属(phyllostachys)系统分类的研究[d].南京林业大学，1998]发现乳突、毛被多态性及粗毛的存在与否有利于部分刚竹属竹种的鉴别；杨赵平[杨赵平，杜凡，彭芸，等.镰序竹属与悬竹属叶的比较解剖[j].广西植物.2009，29(3)：304-308]等通过观察不同竹种间竹叶内部解剖结构，对不同竹种进行分类。

然而竹叶中含有硅细胞[zhangc，wangl，zhangw，etal.dolignificationandsilicificationofthecellwallprecedesilicondepositioninthesilicacelloftherice(oryzasatival.)leafepidermis？[j].plantandsoil.2013，372(1-2)：137-149]使得竹叶坚硬粗糙，导致制片过程中切片易破碎，不能获得清晰完整的竹叶切片。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种观察叶片完整显微结构的方法，克服竹叶切片过程中易切碎，结构不完整等问题。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，在竹叶采集后，先立即用70％faa液中固定，再进行复水，然后采用氢氟酸进行去硅预处理，再进行脱水和常规石蜡制片法制片。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，随机采集竹叶，并用锋利刀片迅速切下竹叶中部，宽度为0.2-0.5cm。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，将采集的竹叶立即放入固定液70％faa中固定至少48h，取出固定后的竹叶进行梯度复水处理。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，复水处理：分别将叶片取出放置50％酒精-30％酒精-15％酒精-纯水各1h。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，去硅预处理为将竹叶置于25％氢氟酸中处理2d。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，去硅处理结束后，将竹叶取出，用纯水清洗后，进行梯度酒精脱水，依次将竹叶置于15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精各1h。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，常规石蜡制片法为：将固定好的竹叶经70％、80％、90％乙醇逐级脱水，每级停留1h，后再用无水乙醇脱水2次，每次停留45min；脱水处理后的竹叶从无水乙醇中分别转入1∶1、1∶3二甲苯-无水乙醇混合液中，各级停留1.5h，后转入纯二甲苯中2次，每次停留1h，进行透明处理；将石蜡与二甲苯按1∶2比例配成混合液，将透明好的材料放入上述混合液中于38℃烘箱过夜，后更换1∶1石蜡-二甲苯混合液于58℃烘箱2h再转入纯蜡中2次，每次停留1h；最后进行包埋；然后切片；番红-固绿染色后用中性树胶封片。

所述的用于竹叶石蜡切片前的去硅预处理方法，切片做好后，leicadm2500光学显微镜下观察。

有益效果：与现有技术相比，本发明在竹叶石蜡制片前利用氢氟酸进行去硅预处理，操作简便，能够获得完整的竹叶显微结构。试验证实，在石蜡制片前，将竹叶置于25％氢氟酸中处理2d。可以获得高质量的竹叶内部结构图片。因此本发明是一种有效观察竹叶内部显微结构的技术，有效解决了竹类植物竹叶切片过程中易破碎的问题，为建立和丰富完善竹类植物竹叶石蜡制片方法奠定基础。

附图说明

图1是未经氢氟酸去硅处理的淡竹叶石蜡切片图；图中，箭头处为取样部位；

图2是其他氢氟酸浓度和浸泡时间预处理下的淡竹叶石蜡切片图；图中，a：常规石蜡制片淡竹新叶横切面；b：常规石蜡制片淡竹功能叶横切面；

图3是淡竹竹叶经25％氢氟酸中处理2d后再进行常规石蜡制片的图；图中，a：淡竹新叶横切片(25％hf2d)；b：淡竹成熟功能叶横切片(25％hf2d)；

图4是淡竹其他浓度的氢氟酸去硅效果图，均显示效果较差。

图5是取10个竹种叶片经25％氢氟酸中处理2d后再进行常规石蜡制片的验证图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种用于竹叶中脉石蜡切片前的去硅预处理方法，包括以下步骤：

1)试验材料为淡竹竹叶(成熟功能叶和当年生新叶)，于4月下旬在南京林业大学竹种园采集，切片材料取自竹叶片中部中脉部分(图1)，采后立即用70％faa液中固定。

2)选取一部分固定后的竹叶材料不进行去硅预处理，固定后直接用于石蜡切片，即为常规石蜡制片法。另一部分淡竹叶片首先进行去硅处理，将淡竹叶叶片复水后分别用10％、15％、20％、25％、30％氢氟酸分别处理1d、2d、3d、4d，然后对竹叶进行梯度酒精脱水再按照常规石蜡制片法制片，即采用去硅预处理，然后进行常规石蜡制片法，为改良后的石蜡制片法。

梯度酒精脱水：将竹叶取出，用纯水清洗后，进行梯度酒精脱水，依次将竹叶置于15％酒精-30％酒精-50％酒精-70％酒精各1h。

常规石蜡制片法为：将固定好的竹叶经70％、80％、90％乙醇逐级脱水，每级停留1h，后再用无水乙醇脱水2次，每次停留45min；脱水处理后的竹叶从无水乙醇中分别转入1∶1、1∶3二甲苯-无水乙醇混合液中，各级停留1.5h，后转入纯二甲苯中2次，每次停留1h，进行透明处理；将石蜡与二甲苯按1∶2比例配成混合液，将透明好的材料放入上述混合液中于38℃烘箱过夜，后更换1∶1石蜡-二甲苯混合液于58℃烘箱2h再转入纯蜡中2次，每次停留1h；最后进行包埋；然后切片；番红-固绿染色后用中性树胶封片。

3)切片做好后，leicadm2500光学显微镜下观察拍照。

淡竹竹叶(嫩叶)和功能叶使用常规石蜡制片法制出的切片均破裂(图2)，新叶的横切面大部分下表皮破裂，中脉部位下表皮附近的机械组织缺失，叶肉细胞结构破裂不清晰，梭形细胞无法辨识，但上表皮和泡状细胞能较好保存。功能叶的横切面大部分上表皮破裂，尤其是中脉部位上表皮容易缺失，中脉部位下表皮附近的机械组织也极易缺失，泡状细胞容易破裂，但叶肉细胞和梭形细胞能较好保存。

使用本申请改良后的石蜡制片法，发现不论是新生叶还是成熟功能叶，用25％浓度的氢氟酸去硅处理2d效果最佳，竹叶结构保存良好，上表皮与下表皮均保存完好，泡状细胞、叶肉细胞和梭形细胞结构清晰，主脉附近机械组织和维管束鞘均完好(图3)。

其他浓度的氢氟酸去硅效果较差，切片容易破裂，尤其是下表皮破裂比较严重(图4，图中，a-t：淡竹新叶横切片；a-t：淡竹功能叶横切片；a：10％hf1d；b：10％hf2d；c：10％hf3d；d：10％hf4d；e：15％hf1d；f：15％hf2d；g：15％hf3d；h：15％hf4d；i：20％hf1d；j：20％hf2d；k：20％hf3d；1：20％hf4d；m：25％hf1d；n：25％hf2d；o：25％hf3d；p：25％hf4d；q：30％hf1d；r：30％hf2d；s：30％hf3d；t：30％hf4d；a：10％hf1d；b：10％hf2d；c：10％hf3d；d：10％hf4d；e：15％hf1d；f：15％hf2d；g：15％hf3d；h：15％hf4d；i：20％hf1d；j：20％hf2d；k：20％hf3d；l：20％hf4d；m：25％hf1d；n：25％hf2d；o：25％hf3d；p：25％hf4d；q：30％hf1d；r：30％hf2d；s：30％hf3d；t：30％hf4d)。采用10％、20％、30％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、2d、3d、4d，用15％浓度的氢氟酸分别去硅处理2d、3d、4d和用25％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、3d、4d后，发现新叶的横切片大部分下表皮破裂，中脉部位下表皮附近的机械组织缺失，叶肉细胞结构破裂不清晰，但上表皮和泡状细胞能较好保存；而用15％浓度的氢氟酸去硅处理1d，发现新叶的横切片大部分上表皮破裂，尤其是中脉部位上表皮容易缺失，但下表皮、泡状细胞和叶肉细胞能较好保存。采用10％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、2d、3d，用15％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、3d、4d，用20％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、2d、4d，用25％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、2d、3d，用30％浓度的氢氟酸分别去硅处理1d、2d，发现功能叶的横切面大部分上表皮破裂，尤其是中脉部位上表皮容易缺失，泡状细胞容易破裂，但叶肉细胞和梭形细胞能较好保存；而用10％浓度的氢氟酸去硅处理4d，用15％浓度的氢氟酸去硅处理2d，用20％浓度的氢氟酸去硅处理3d，用25％浓度的氢氟酸去硅处理4d，用30％浓度的氢氟酸分别去硅处理3d、4d，发现功能叶的横切片大部分下表皮破裂，中脉部位下表皮附近的机械组织缺失，但上表皮、泡状细胞和叶肉细胞能较好保存。

实施例2

一种用于竹叶石蜡切片前去硅预处理的方法，同实施例1，具体包括以下步骤：

1)试验材料为另外10个竹种(包括3种散生竹，4种混生竹以及3种丛生竹)(表1)的成熟功能叶和当年生新叶，于4月下旬在南京林业大学竹种园采集，切片材料取自竹叶片中部中脉部分。采后立即用70％faa液中固定。

表111个竹种采集信息表

2)复水后对10个竹种叶片首先进行去硅处理，将各竹种叶片用25％氢氟酸分别处理2d；脱水后然后再按照常规石蜡制片法制片。

复水处理：分别将叶片取出放置50％酒精-30％酒精-15％酒精-纯水各1h。

3)切片做好后，leicadm2500光学显微镜下观察拍照，验证制片效果。

采集另10种竹叶(散生竹、丛生竹和混生竹)的新生叶和成熟功能叶，用25％氢氟酸去硅处理2d后再进行石蜡制片，试验发现竹叶结构保存良好，上表皮与下表皮均保存完好，泡状细胞和叶肉细胞结构清晰，主脉附近机械组织和维管束鞘均完好(图5，图中，a：翠竹新叶横切面；b：翠竹功能叶横切面；c：乌哺鸡竹新叶横切面；d：乌哺鸡竹功能叶横切面；e：菲黄竹新叶横切面；f：菲黄竹功能叶横切面；g：凤尾竹新叶横切面；h：凤尾竹功能叶横切面；i：孝顺竹新叶横切面；j：孝顺竹功能叶横切面；k：月月竹新叶横切面；1：月月竹功能叶横切面；m：毛竹新叶横切面；n：毛竹功能叶横切面；o：菲白竹新叶横切面；p：菲白竹功能叶横切面；q：红壳竹新叶横切面；r：红壳竹功能叶横切面；s：金丝慈竹新叶横切面；t：金丝慈竹功能叶横切面)。在10种竹种的内部解剖结构中，从主脉的机械组织来看，翠竹和凤尾竹的新叶与功能叶之间存在差异。翠竹和凤尾竹的新叶主脉的机械组织木质化程度低，而功能叶主脉的机械组织木质化程度高；其余竹种的新叶与功能叶主脉的机械组织木质化程度水平相当。从梭形细胞来看，乌哺鸡竹和毛竹的新叶与功能叶之间存在差异。乌哺鸡竹和毛竹的新叶的梭形细胞比较明显，而功能叶的梭形细胞不明显甚至无；其余竹种的新叶与功能叶的梭形细胞差异相对较小。不同竹种的新叶之间，乌哺鸡竹、菲黄竹、菲白竹和金丝慈竹的梭形细胞比较大；不同竹种的功能叶之间，菲黄竹、菲白竹和金丝慈竹的梭形细胞比较大。由于采集的10种竹叶结构均保存良好，由此可以得出结论，本方法适合大部分竹种的竹叶。