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基因工程原理

花匠小妙招
2024-12-03 20:56

1 第二章基因工程的工具酶基因工程的工具酶( instrumental enzyme of gene engineering ): 是应用于基因工程各种酶的总称, 包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体 DNA 制备等所需要的酶类。基因工程工具酶: 1 、限制性内切酶 2 、甲基化酶 3、 DNA 连接酶 4、 DNA 聚合酶 5、 RNA 聚合酶 6、磷酸激酶和磷酸酶 7、核酸酶 8、核酶一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 1、限制性核酸内切酶的发现噬菌体侵染细菌 B含有 EcoB 核酸酶和 EcoB 甲基化酶当λ(k) 噬菌体侵染 B 时,由于其 DNA 中有 EcoB 核酸酶特异识别的碱基序列,被降解掉。而 B的 DNA 中虽然也存在这种特异序列,但可在 EcoB 甲基化酶的作用下,催化 S- 腺苷甲硫氨酸( SAM )将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基,使之甲基化。 Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。仍有少量 phage λ(K) 可在 E. coli B 中生存, 是因为 B phage 对λ(K) 进行了修饰。大肠杆菌 B大肠杆菌 K修饰的 phage λ(B) 修饰的 phage λ(K) 10-4 (限制作用) 10-4 (限制作用) 1(修饰作用) R-M 系统细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶, 构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system) 。 R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA , 为避免自身 DNA 的降解, 细菌可以修饰(甲基化酶)自身 DNA , 未被修饰的外来 DNA 则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰,则可免予被降解。 1968 Linn 和 Arber 从 B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith (美)在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber , H. , Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金限制性核酸内切酶(限制酶):在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列,并对 DNA 分子进行切割的一种酶。功能:降解不同源 DNA ,而不降解同源 DNA 。 I型 II型 III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子 ATP Mg 2+ SAM Mg 2+ ATP Mg 2+ SAM 识别序列 TGAN 8 TGCT 6 GTGC 旋转对称序列 CAGCAG 切割位点距识别序列 1kb 处随机性切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游 24-26bp 处在基因工程中意义无用非常有用意义不大 50μL反应体系中,含1μg底物 DNA , 于最适反应条件和温度下,保温 1 小时,能使 1μ g DNA 完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位,用 U 表示。 buffer ( pH= ): 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT 或巯基乙醇 100 μ g BSA/ml ( DDT :二硫苏糖醇 BSA :牛血清蛋白) DNA 分子双链的特异性识别序列部位,切割 DNA 分子,产生链的断裂。 2个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布,通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段,具有互补的单链延伸末端。识别序列绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由 4-8 个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割 DNA 分子的,因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。识别序列有连续的(如 GATC )和间断的(如 GANTC) 两种, 它们都呈回文结构。核酸内切酶 Hind Ⅲ对双链 DNA 分子的切割作用,下图三种酶切末端同裂酶和同尾酶 2 同裂酶:来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割,形成同样的末端。如: Hpa Ⅱ和 Msp Ⅰ均可切割 C CGG 。当胞嘧啶甲基化后, Msp Ⅰ不能再切割。同尾酶:来源不同,识别的核苷酸靶序列也不相同,但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Bgl Ⅱ三种酶可产生相同的 5’ GATC 粘性末端,由这种同尾酶产生的 DNA 片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。(图略) D

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