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灯盏乙素通过调控Pdk-Pdc轴调节线粒体有氧糖代谢来发挥神经保护作用
线粒体生物能量缺陷及其导致的葡萄糖代谢减退是神经病变的关键病理生理因素。然而，目前还没有发现特定的潜在分子可以通过调节线粒体代谢和修复线粒体损伤来治疗神经系统疾病。灯盏乙素（4',5,6-羟基异黄酮-7-葡萄糖醛酸）是源于灯盏花（Erigeron breviscapus）的一种黄酮类化合物，是灯盏花素片、灯盏细辛注射液、灯盏生脉胶囊等多种中药及复方的主要药效成分，已被证明在治疗脑血管和心血管疾病方面具有广泛的药理活性和临床效果。探究灯盏乙素发挥神经保护作用的机制和关键靶点能够更好的指导临床合理用药，对于中药的进一步开发具有重要价值。
2023年9月26日，中国医学科学院药物研究所张金兰研究员和蒋建东院士团队在Advanced Science（IF=15.1）发表题为“Scutellarin Rescued Mitochondrial Damage through Ameliorating Mitochondrial Glucose Oxidation via the Pdk-Pdc Axis”的文章。科学家们基于建立的靶向线粒体代谢及功能的药物药效评价方法，发现灯盏乙素可特异性靶向脑组织线粒体PDK2-PDC轴调控线粒体有氧代谢，提升线粒体膜电位水平并降低线粒体损伤，对脑缺血大鼠的神经损伤具有保护作用。该研究成果为灯盏花类中药的脑神经保护作用的物质基础和机制提供了科学依据，为灯盏乙素的进一步开发应用奠定基础，也为基于线粒体靶标的神经保护作用药物开发提供了创新评价方法。
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研究背景
研究表明线粒体在神经退行性疾病中起着核心作用[1-3]。线粒体功能障碍已被认为是衰老、阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VaD）的共同致病机制[4-7]。众所周知，大脑需要ATP形式的持续能量供应，其中大部分能量来源于葡萄糖代谢，而在神经退行性疾病中，大脑糖代谢会发生进展性的、疾病特异性的恶化，导致能量供应产生问题[8]。因此从代谢变化角度来解释神经元损伤，并寻找可以补救线粒体能量供应的疗法具有重要研究价值[9]。丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）催化丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶Ａ和二氧化碳，连接糖酵解和三羧酸循环，是线粒体葡萄糖氧化过程中的关键代谢酶。其活性由丙酮酸脱氢酶激酶 1-4（PDK1-4）作用下的可逆磷酸化调节，PDK2-PDC 轴在线粒体有氧代谢中发挥着重要的调控作用。
慢性脑缺血（CCH）属于神经系统疾病一种常见病理状态，是由于慢性脑灌注下降导致的脑功能障碍临床综合征，灌注不足剥夺了大脑的两种重要营养物质，即氧气和养分，因此大脑遭受功能失调的能量代谢、线粒体功能受损、突触功能障碍和神经元变性/丧失，导致认知障碍和AD[10]。在这些病理生理过程中，线粒体功能障碍与CCH的发生和发展相关，并导致随后的神经病理变化[11]。
灯盏乙素（4',5,6-羟基异黄酮-7-葡萄糖醛酸）是源于灯盏花（Erigeron breviscapus）的一种黄酮类化合物，已被证明具有广泛的药理活性和治疗心脑血管疾病的临床应用[12]。前期团队研究发现SG可以调节γ－氨基丁酸（GABA）和谷氨酸能神经元中的神经递质代谢[13]。神经递质代谢与神经细胞的能量代谢密切相关，并且神经细胞和脑组织的功能极其依赖于线粒体功能，因此需要深入研究SG在机体能量不足时对细胞能量代谢的作用。
研究内容
Result 1 灯盏乙素改善CCH引起的脑病理生理改变及认知功能障碍
慢性脑缺血2VO模型是使用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，造成慢性前脑的低灌注状态，从而制备慢性脑缺血的动物模型。2VO模型已经成为目前研究慢性脑缺血最常用的模型，它在研究慢性脑缺血后的白质损伤、海马区神经元变性以及学习和记忆功能障碍、神经信号传递障碍等方面都起了重要的作用。本实验通过建立2VO大鼠模型，尼莫地平作为阳性对照研究SG对CCH的影响。本实验应用水迷宫实验、氧化应激测试和组织病理学分析来评估2VO模型的稳定性和SG的治疗潜力（图1A），水迷宫实验采用改良的Garcia JH法进行神经行为评分，评价指标包括逃避潜伏期、有效停留时间和目标穿越时间。神经行为评分显示假手术组和SG组均显著高于模型组，表明SG可减轻缺血脑组织的认知障碍（图1B-E）。HE染色显示模型组海马CA1区和纹状体区出现典型的神经病理改变，出现明显的细胞固缩、皱缩和染色消失（图1-I中箭头标记）。相比之下，这些特征在SG组中得到了显著改善。与假手术组比较，模型组SOD、GSH-Px明显降低，SG治疗后SOD、GSH-Px明显升高，MDA则相反（图1F-H）。上述生化指标的检测结果表明，SG对2VO模型大鼠的氧化应激损伤具有一定的调节作用。这些结果基本表明了SG对CCH的药效作用。
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图1. SG能减轻慢性脑缺血引起的病理改变，改善认知功能障碍，降低氧化应激。A）评估2VO模型的稳定性和SG的治疗潜力的过程。B）水迷宫实验的逃避潜伏期。C）神经行为评估结果。D）水迷宫实验的有效停留时间。E）水迷宫实验的目标穿越时间。F-H）各组的氧化应激相关参数的评价。I）各组间脑组织的组织病理学（黑色箭头代表炎性小胶质细胞；白色箭头代表神经元萎缩；蓝色箭头代表细胞固缩）。通过配对双尾Student’s t检验，数据表示为mean ± SEM，*p <0.05，**p < 0.01，*p < 0.001，*p < 0.0001，模型相对于对照组，#p < 0.05，##p < 0.01，#p < 0.001，#p < 0.0001，SG或尼莫地平相对于模型组。
Result 2 灯盏乙素缓解CCH诱导的线粒体功能障碍
线粒体在调节生物能量、生物合成和信号传导中具有细胞内稳态的独特功能。ATP产生的减少导致ATP依赖性离子通道如Na+/K+和Ca2+泵的功能受损。由于离子通道不能维持离子平衡，导致Na+和Ca2+净内流，K+跨质膜外流，从而增加了静息膜电位到阈值，导致神经元中不受调控的去极化，称为缺氧去极化。线粒体ROS水平检测结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠的线粒体ROS水平显著增加，而SG治疗组相对于模型组ROS水平显著降低（图2A）。值得注意的是，SG和假手术组之间的线粒体ROS水平没有显著差异，表明SG可以有效地减轻CCH状态下的氧化应激。同时研究表明Na+-K+ ATP酶和Ca2+-Mg2+ ATP酶对ROS最敏感，从而改变ATP的产生，调节神经元内的离子浓度梯度，刺激动作电位的产生。与2VO模型组相比，SG治疗组和假手术组大鼠脑线粒体Na+-K+ ATP酶和Ca2+-Mg2+ ATP酶活性均显著升高。考虑到过量的ROS和氧化应激可能对线粒体造成损伤，我们通过荧光分光光度法检测线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放的情况，发现模型组mPTP开放明显，线粒体Ca2+几乎同时释放（Rhod-2比率信号增加），线粒体膜电位的崩溃（JC-1比率信号降低）和线粒体体积增加（肿胀信号减少），并且用SG处理能够显著恢复这些变化（图2A）。
ATP的合成是通过线粒体电子传递链（ETC）和ATP合酶氧化磷酸化（OXPHOS）。通过分光光度法进行评估线粒体呼吸链复合体活性（图2A）。与假手术组相比，CCH模型组复合物活性明显降低，而SG治疗组复合物I、III、IV、V活性明显升高。结果表明，CCH可损伤线粒体复合体，SG可增强线粒体呼吸链复合体的活性。此外，线粒体呼吸链是ROS产生的主要场所之一，即使在生理环境下，复合物I和III也是自由基和ROS的主要贡献者，这与脑线粒体中ROS的测定一致，即SG可以减少ROS的大量产生，恢复线粒体呼吸功能和ETC复合物的活性。通过透射电子显微镜（TEM）观察海马CA1区、皮层、纹状体线粒体超微结构的变化，如图2B所示，在假手术组中，所有样品中的线粒体具有突出的嵴和完整的膜，而在CCH组中，线粒体肿胀，嵴断裂并向周围移动，SG组改善了线粒体损伤。这些结果表明，SG显着减少CCH诱导的线粒体损伤，通过调节线粒体的稳态和ATP的生产。
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图2. 灯盏乙素缓解CCH诱导的线粒体功能障碍。A)SG调节线粒体的动态平衡和ATP的产生。2)透射电子显微镜观察海马CA1区、皮质和纹状体线粒体的超微结构变化。通过配对双尾Student’s t检验，*p < 0.05，**p < 0.01，*p < 0.001，*p < 0.0001，模型与对照组，#p < 0.05，##p < 0.01，##p < 0.001，#p < 0.0001，SG与模型组。
Result 3 CCH线粒体功能障碍的蛋白质组学研究及灯盏乙素对线粒体有氧呼吸的影响
线粒体是细胞能量生产的主要场所，主要功能是产生能量和代谢产物，线粒体功能障碍是脑血管和心血管疾病的关键特征。为了揭示线粒体功能障碍和SG的调节作用，我们采用了无标记定量蛋白质组学和线粒体蛋白质组的方法对2VO模型大鼠脑组织进行了分析（图3A）。使用PotterElvehjem型玻璃Teflon匀浆器和紧密配合的Teflon研杵制备脑匀浆（10%，w/v），分离线粒体组分并通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化。同时，通过蛋白质印迹法（WB）来评估线粒体纯度，WB实验表明，分离的线粒体纯度高，胞质干扰小，适合线粒体蛋白质组表征（图3C）。此外，作者使用高分辨率质谱（MS）进行蛋白质组学数据采集和PEAKS软件中的自动计算分析，并在假手术、2VO模型和SG治疗组中总共检测到5449个蛋白质，其中在肽和蛋白质水平上FDR<1%。然后，作者将定量的脑蛋白质组数据应用于MitoMiner 4.0，使用MitoCarta 2.0数据库和IMPI（版本Q2 2018）数据库搜索线粒体蛋白质，并将脑蛋白质组的大部分（1113种蛋白质）识别为属于线粒体来源。Venn图（图3B）说明了这些数据库的线粒体蛋白质鉴定标准。为了确定上调或下调，测量每组中五个独立样品之间的脑线粒体蛋白的平均峰强度，然后将它们的倍数变化（FC>1.3）相对于-log p值（p < 0.05）绘制在火山图中。在模型与假手术组之间以及SG与模型组之间鉴定了583和136个差异表达的线粒体蛋白（DEMP，p值<0.05），其中分别有525和79个FC>1.3的DEMP（图3D，E）。我们随后调查了这些DEMP如何影响CCH病理和SG效果在一个公正的方式。使用STRING、BioGrid、OmniPath、InWeb IM数据库富集分析所有DEMP的蛋白质相互作用（PPI），应用MCODE算法来识别密集连接的网络组件，并保留通过p值获得的三个最佳评分项作为相应组件的功能描述（图3F）。其中，MCODE_1和MCODE_2含有大多数DEMP（55和21种蛋白），均与OXPHOS及其上游TCA循环相关，分别占总数的34.2%和14.0%（图3G，H），证明CCH模型和SG对线粒体的影响主要与线粒体有氧能量代谢有关。此外，通过DAVID聚类分析的功能注释表明，模型与假手术组和SG与模型组的DEMP在电子传递、呼吸链、TCA循环、转运、糖酵解等生物过程中是一致的（图3I，J）。与对照组相比，模型组中脂质相关代谢途径的变化更丰富，而SG被发现主要富集在线粒体葡萄糖有氧代谢途径中，而不是脂质代谢途径。PPI富集分析显示，这些DEMP与线粒体有氧呼吸密切相关，其中丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物（PDC）组分E2（Dlat）为核心（图3K）。这些参与线粒体有氧呼吸相关代谢途径的DEMP包括线粒体呼吸链复合物I/IV组装、电子/氢离子转运、TCA循环、糖酵解过程等（图3L），提示SG可能通过增强以PDH为核心的有氧呼吸、TCA循环和糖酵解等上游途径，增强CCH脑组织的氢离子和电子供应，减轻线粒体损伤。
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图3. 线粒体蛋白质组学研究揭示了SG对氧化磷酸化和能量代谢途径的调节作用。A）线粒体蛋白质组学实验过程。B）通过MitoMiner 4.0鉴定线粒体蛋白的标准。C）WB实验验证提取的线粒体的纯度。D）模型与假手术组之间差异表达的线粒体蛋白。E）SG与模型组之间差异表达的线粒体蛋白。F）DEMP的总相互作用关系。G）分子复合物检测（MCODE）的描述。H）每个MCODE中的DEMP，其中，MCODE_1和MCODE_2含有大部分DEMP，均与OXPHOS及其上游TCA循环有关。I）模型组与假手术组之间差异表达的线粒体蛋白质的功能注释。J）模型组和SG组之间差异表达的线粒体蛋白质的功能注释。K）模型组与假手术组、SG组与模型组的DEMPs的PPI富集分析。L）SG对OXPHOS及其上游通路的蛋白质起反向调节作用。数据通过配对双尾学生t检验表示为平均值±SEM，*p < 0.05，** p <0.01，* p < 0.001，* p < 0.0001，模型相对于对照组，#p < 0.05，##p < 0.01，#p < 0.001，#p < 0.0001，SG相对于模型组。
Result 4 灯盏乙素调节线粒体有氧代谢和线粒体OXPHOS损伤过程中的线粒体形态学
为了验证蛋白质组学分析的结果，作者使用人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系建立NaN3诱导的线粒体损伤模型，并进行了代谢组学研究，NaN3抑制SK-N-SH细胞活力呈剂量依赖性作用（图4A）。0.5-80 mmol L−1的NaN3处理显著抑制SKN-SH细胞的细胞活力，最佳浓度为1 mmol L−1的NaN3用于建立NaN3诱导的线粒体损伤细胞模型，暴露于1 mmol L−1的NaN3 24 h后细胞活力下降40%。作者研究了SG对NaN3诱导的线粒体损伤细胞中细胞活力的影响，结果表明，用0.01、0.1、1和10 μmol L−1 SG预孵育4 h可显著增强模型细胞的细胞活力，表明对NaN3诱导的线粒体损伤具有显著的保护作用（图4B）。
基于此，作者首先开展了代谢组学研究，对参与细胞能量代谢及相关代谢途径的糖酵解、TCA循环、氨基酸、核酸、脂肪酸代谢等共27种主要代谢物进行了定量分析。主成分分析（PCA）显示，对照组、模型组和SG组区分良好（图4C）。作者用正交偏最小二乘方判别分析对代谢产物的定量分析结果进行拟合，筛选VIP值大于1的潜在的生物标志物，发现与模型组相比，对照组和SG组有4种代谢产物同时满足上述条件，包括TCA循环中的富马酸、苹果酸和草酰乙酸（OAA），以及糖酵解和TCA循环中的关键环节代谢产物丙酮酸（图4D、E、F）。此外，作者使用共聚焦显微镜通过用DAPI染色细胞核和用MitoTracker Deep Red（终浓度为0.5 μmol L−1）染色线粒体来观察NaN3诱导的线粒体损伤后的线粒体形态。作者观察到，与未处理的对照细胞相比，NaN3暴露24 h的细胞表现出MitoTracker Deep Red染色面积的减少，表明线粒体膜电位的损失，这与先前的动物实验一致。如图4G所示，与模型组相比SG组的MitoTracker Deep Red强度的增加，表明SG显著抑制NaN3诱导的去极化，这些结果表明SG可能对NaN3引起的线粒体损伤具有保护作用。值得注意的是，SG组和对照组之间的MitoTracker Deep Red强度没有显著差异。综上所述，代谢组学和形态学研究表明，SG调节线粒体OXPHOS损伤过程中与糖酵解和TCA循环相关的代谢产物，减轻线粒体损伤，提高细胞存活率。
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图4. NaN3诱导的细胞损伤后线粒体的代谢组学和形态学研究表明，SG在线粒体OXPHOS损伤过程中调节丙酮酸代谢相关的糖酵解和TCA循环。A）NaN3诱导的线粒体损伤模型的剂量依赖性效应。B）SG对NaN3诱导的线粒体损伤的保护作用。C）主成分分析（PCA）结果显示，正常组、模型组和SG组之间有较好的区分。D）将SG与模型组进行比较的潜在生物标志物。E）应用OPLS-DA模型筛选VIP值大于1的潜在生物标志物，Student’s t检验值< 0.05。F）代谢组学分析，包括参与细胞能量代谢和相关代谢途径的27种主要代谢物。G）NaN3诱导的线粒体损伤和SG处理后的线粒体形态学。数据通过配对双尾Student’s t检验表示为平均值±SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，*p < 0.001，*p < 0.0001，模型相对于对照组，#p < 0.05，##p < 0.01，#p < 0.001，#p < 0.0001，SG相对于模型组。
Result 5 实时细胞生物能量学分验证灯盏乙素对线粒体有氧呼吸的影响
为了验证SG调节丙酮酸代谢相关的糖酵解和TCA循环，从而在线粒体OXPHOS损伤期间增强线粒体葡萄糖氧化，作者在NaN3诱导的线粒体OXPHOS损伤和SG处理后对完整细胞中的实时细胞外酸化速率（ECAR）和耗氧速率（OCR）进行了评价。作者首先检测了以葡萄糖为碳源的对照组、模型组和SG组中ECAR的变化（图5A）。通过饥饿（不含葡萄糖和丙酮酸钠）预处理的SK-N-SH细胞被给予饱和葡萄糖，然后利用所添加的葡萄糖并通过糖酵解途径将其分解为丙酮酸和乳酸，从而产生ATP、NADH、H2O和质子，导致周围溶液中的ECAR迅速增加。在此过程中ECAR的变化可用于测量基础糖酵解速率。作者进一步加入了寡霉素（ATP合成酶抑制剂）来抑制线粒体ATP的产生，通过增加ECAR来计算细胞的最大糖酵解能力。ECAR结果显示，与对照组相比，模型组的基础糖酵解和糖酵解能力均显著降低，并被一系列浓度（0.01、0.1、1和10 μmol L−1）的SG处理后显著增强（图5B）。在此条件下，SG治疗促进的ECAR的差异可能与丙酮酸和乳酸的产生、TCA循环通量的变化、ATP周转或其他产酸分解代谢过程。为了在此条件下评估酸化源，作者通过监测各组之间的OCR变化来测量TCA循环通量（图5C）。细胞线粒体应激试验的结果表明，NaN3处理的SK-N-SH细胞维持降低的基础OCR，并且分别对寡霉素、FCCP以及鱼藤酮和抗霉素A的混合物的引入反应最小，这表明线粒体生物能量缺陷。根据定量评估，SG（1 μmol L−1）预处理分别显著上调基础呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸的OCR（图5D）。此外，实时ATP速率测试（可同时测量OCRs和ECARs）的结果显示，NaN3处理的SK-N-SH细胞的总ATP产生速率低于对照组，NaN3显著降低线粒体ATP产生速率和糖酵解ATP产生速率。相反，SG（1 μmol L−1）能够显著上调线粒体和糖酵解ATP的产生（图5E）。此外，与模型组相比，SG可以显著逆转mitoATP/glycoATP比率（0.58至1.01），表明SG主要通过调节线粒体有氧代谢来增强细胞能量供应（图5F）。长链脂肪酸（LCFA）可通过代谢为乙酰辅酶A进入线粒体TCA循环，作者猜测长链脂肪酸是否参与SG处理增强的有氧代谢？依托莫西（Eto）通过抑制肉毒碱棕榈酰转移酶1A（CPT 1a）抑制LCFA的氧化。因此作者测量了添加Eto后组间OCR的变化，以评估LCFA氧化对线粒体有氧呼吸的影响（图5G）。结果表明，培养组和抑制剂组之间的OCR没有显著变化，这表明SG（1 μmol L−1）对线粒体有氧呼吸的改善并不归因于LCFA氧化（图5H）。这些结果证实了SG通过调节糖酵解和与丙酮酸代谢相关的TCA循环来增强线粒体有氧呼吸，并最终改善NaN3诱导的线粒体呼吸功能障碍的结果。
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图5. NaN3诱导的线粒体OXPHOS损伤和SG处理后完整细胞中实时ECAR和OCR的评价。A）糖酵解应激试验图。B）对照组、模型组和SG治疗组糖酵解和糖酵解能力的ECAR。C）线粒体压力测试。图D）对照组、模型组和SG治疗组的基础呼吸、ATP相关呼吸、最大呼吸和备用呼吸量的OCR。E）实时ATP速率测试图。（F）与模型组相比，SG能显著逆转线粒体ATP/糖基ATP比值。G）基底氧化应力测试图。H）培养组和LCFA氧化抑制剂组之间的OCR。数据通过配对双尾Student’s t检验表示为平均值±SEM，*p < 0.05，** p <0.01，* p <0.001，* p <0.0001，模型相对于对照组，#p < 0.05，##p <0.01，#p <0.001，#p <0.0001，SG相对于模型组。
Result 6 探索[13C6]-葡萄糖标记SK-N-SH细胞能量代谢途径的稳态条件
基于实时细胞生物能量学分析的结果，作者进行了[13C6]-葡萄糖代谢通量分析（13C-MFA）以探讨SG的分子调控机制。为了监测OXPHOS损伤和SG处理背景下的糖酵解和TCA循环，作者用均匀标记的[13C6]-葡萄糖孵育指数生长的SK-N-SH细胞，随时间（0，0.25，0.5，1，2，4，6和8 h）收获代谢产物，通过液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）分析提取物的代谢产物。通过同位素物的鉴定和定量分别测定在糖酵解中的[13C6]-G6P、[13C3]-甘油醛-3P、[13C3]-甘油酸-3P、[13 C3]磷酸烯醇丙酮酸、[13C3]-丙酮酸、[13C3]-乳酸动力学以及[13C2]-Cit/[13C6]-Cit、[13C2]-Suc/[13C4]-Suc、[13C2]-Fum/[13 C4]Fum、[13C2]-MA/[13C4]-MA、TCA循环中[13C2]-OAA/[13C4]-OAA的比值。代谢物在不同时间点的同位素体分布如图6C所示，结果表明，糖酵解代谢产物在0.5 h时达到标记稳态，而连接糖酵解和TCA循环的丙酮酸和与氨基酸代谢和脂质代谢相关的氨基酸在6 h达到标记稳态（图6A）。在TCA循环中，作者研究了单循环（[13C2]标记）和多循环（[13C4]标记或[13C6]标记）标记代谢物的稳态时间，结果显示，单循环和多循环均可在6 h达到标记稳态（图6B）。最后，选取0.5和6 h两个观察时间点，分别评价NaN3诱导的线粒体损伤模型组和SG治疗组OXPHOS上游代谢通量的变化。
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图6. [13C6]-葡萄糖标记能量代谢途径稳态条件的探索A）糖酵解中13C标记的关键代谢物的动力学。B）TCA循环中13C标记的关键代谢物的动力学。C）在不同时间点代谢物的同位素体分布。m，单一同位素代谢物; m+n，代谢物的同位素体分布。
Result 7 13C-MFA揭示SG增强线粒体OXPHOS损伤过程中丙酮酸-乙酰辅酶A连结的线粒体葡萄糖氧化
代谢组学研究表明SG可以调节线粒体OXPHOS和电子传递链（ETC）的上游代谢途径。由于ETC活性与碳底物的供应有关，为了进一步证明SG的代谢调节机制，作者使用LC-HRMS技术进行13C-MFA，以研究氨基酸、糖酵解、TCA循环等代谢的改变。13C-MFA实验过程如图7A所示，普遍标记的[13C6]葡萄糖被用作示踪剂来跟踪这些途径中的代谢物。连续培养12 h后，将NaN3诱导的线粒体损伤模型组和SG处理组（1 μmol L−1）的培养基更换为[13C6]-葡萄糖培养基，分别于0.5和6 h采集样品进行预处理和进一步LC-HRMS分析。结果表明，与对照组相比，模型组大鼠糖酵解途径中[13C6]-G6P（0.5 h）、[13C3]-甘油酸-3P（0.5 h）、[13C3]-乳酸（0.5 h）和[13C3]-丙酮酸（6 h）的丰度比明显降低。然而，在SG组中，[13C6]-G6P（0.5 h）、[13C3]-甘油酸-3P（0.5 h）、[13C3]-乳酸（0.5 h）和[13C3]-丙酮酸（6 h）的丰度比可显著逆转。在模型和SG组之间[13C3]-乳酸（0.5 h）的丰度比没有显著差异，表明增强的糖酵解没有通过乳酸代谢增加能量供应。在丙酮酸代谢途径中，丙酮酸主要通过丙酮酸途径代谢（图7 D）。进一步检测TCA循环中关键代谢物的通量，发现模型组[13C4]-Suc、[13C4]-Fum、[13C4]-MA和[13C2]-Glu的丰度比较对照组显著降低，而SG组[13C4]-Suc、[13C4]-Fum和[13C4]-MA的丰度比较对照组显著逆转，但模型组与SG组[13C2]Glu丰度比值一致，提示SG不能通过调节谷氨酰胺-谷氨酸-2-KG代谢途径来增强TCA循环途径。同时监测丙氨酸代谢途径，发现在各组之间未观察到[13C3]-丙氨酸丰度比的显著差异（图7 C）。与模型组相比，SG显著增强了[13C3]-丙酮酸代谢为[13C2]-乙酰辅酶A的通量，从而增强了线粒体葡萄糖源有氧呼吸（图7 E）。此外，作者还通过蛋白质印迹法研究了丙酮酸脱氢酶E2（Dlat）和ATP合成酶O亚基（ATP5o）的关键蛋白表达，这两个酶分别催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，然后进入TCA循环和由呼吸链ETC产生的ADP产生ATP。与对照组相比，这些蛋白质在模型组中均下调，并且在SG治疗组中可以显著逆转（图7 F）。综上所述，作者认为SG可以在OXPHOS受损的情况下调节PDK-PDC轴连接的葡萄糖-丙酮酸-TCA循环轴，并增加氧化磷酸化过程中电子呼吸链的有氧代谢（图7 B）。
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图7. 13C MFA和western blotting结果表明，SG对葡萄糖-丙酮酸-TCA循环轴上的丙酮酸代谢具有调节作用。A）13C-MFA实验的孵育过程。B）在OXPHOS受损的情况下，SG可调节PDK-PDC轴连接的葡萄糖-丙酮酸-TCA循环轴。C）TCA循环（6 h）中13C代谢物的丰度比。D）糖酵解（0.5 h和6 h）中13C代谢物的丰度比。E）与模型组相比，SG显著增强[13C3]-丙酮酸代谢为[13C2]-乙酰-CoA的通量。F）正常对照组、模型组、SG治疗组Dlat、ATP5o的表达。数据通过配对双尾Student’s t检验表示为平均值±SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，*p 0.001，*p <0.0001，模型相对于对照组，#p < 0.05，##p < 0.01，#p < 0.001，#p < 0.0001，SG相对于模型组。
Result 8 SG选择性抑制PDK2靶点促进线粒体有氧呼吸和线粒体膜电位
为了验证SG对由PDK-PDC轴调节的丙酮酸代谢以增强线粒体有氧代谢的影响，作者通过测量激酶反应中的非磷酸化和磷酸化底物来进行激酶活性评估。以二氯乙酸（DCA）为阳性对照，检测SG对PDK2和PDK4的抑制率，结果显示，在多个浓度下，SG对PDK2的抑制活性显著高于DCA（图8D）。然后，对接分析显示SG可以在空间上结合PDK2的ATP结合结构域、脂酰胺结合结构域和CoA结合结构域周围（图8A-C）。如图8 G所示，通过药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验评价SG和PDK2之间的相互作用，当蛋白酶：蛋白质的比例为1：3000时，仍有一定量的蛋白质剩余，并且与对照组显著不同，因此选择该比例用于后续实验。不同浓度的SG（0.05-5 μmol L−1）在室温下孵育2 h后，与对照组的DMSO相比，PDK2蛋白表达增加呈浓度依赖性，这表明由于SG的结合，PDK2蛋白的稳定性增加，进一步证明了SG与PDK2蛋白之间的相互作用。CETSA实验证实了SG与PDK2蛋白在分子水平上的相互作用，SK-N-SH细胞中的PDK2蛋白随着温度的升高而降解，但SG的加入降低了PDK2蛋白的降解（图8H）。SG孵育组在50 ~ 80 °C范围内PDK2蛋白的稳定性显著高于对照组。对于功能验证，作者建立具有PDK2稳定敲减的SK-N-SH细胞系（shPDK2）（图8 E）。基于此，作者发现SG可以对NaN3诱导的以PDK2为靶点的线粒体膜电位损伤发挥保护作用（图8 F）。在此基础上，作者进行了免疫共沉淀（IP）实验来研究小分子与蛋白质的相互作用。如图8I所示，输入组的蛋白条带表明细胞裂解液中含有PDK2蛋白，阴性对照IgG组无靶条带，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能。与SG共孵育的实验组有PDK2的条带，表明PDK2抗体免疫沉淀实验成功地沉淀了PDK2蛋白。接下来，通过PBS溶液重复洗涤免疫沉淀的珠粒四次以去除附着于珠粒表面的非特异性残基。最后，作者进行LC-MS/MS以分析SG与PDK2的结合。结果清楚地表明，SG和PDK之间的相互作用可以通过免疫共沉淀-MS检测。小分子-蛋白质相互作用通常导致蛋白质结构的局部或整体改变。在天然裂解条件下提取的免疫沉淀珠用1 mmol L−1下SG预孵育处理1 h或不处理，在天然条件下用蛋白酶K（PK）进行有限的蛋白水解步骤，然后在变性条件下用胰蛋白酶完全消化，生成MS可测量的肽。基于Lip-MS，总共鉴定了371个PDK2肽，通过统计分析筛选出对照组和SG处理组之间差异表达的肽，在硫辛酰胺结合结构域、CoA结合结构域和ATP结合结构域中分别鉴定出11、0和6个差异肽。这些实验结果进一步证明了SG和PDK2的结合作用。此外，硫辛酰胺结合结构域可能是SG与PDK2结合的主要结合区域（图8 J）。此外，细胞线粒体应激试验表明，shPDK2 SK-N-SH细胞比溶媒SK-N-SH细胞保持更高的线粒体有氧呼吸指数，SG仅在高浓度（10 μmol L−1）下可上调ATP相关呼吸和最大呼吸的OCR（图8 K-M）。与图5C、D中所示的对照组相比，作者得出结论，SG通过抑制作为靶标的PDK2来促进线粒体有氧呼吸。
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图8. SG以抑制PDK2为靶点，促进线粒体有氧呼吸，调节线粒体依赖性凋亡。A）围绕PDK2的ATP结合结构域的SG空间键的对接分析。B）围绕PDK2的脂酰胺结合结构域的SG空间键的对接分析。C）围绕PDK2的CoA结合结构域的SG空间键的对接分析。D）与DCA相比，SG对PDK2的抑制百分比。E）具有稳定敲低的PDK2（shPDK2）的SK-N-SH细胞系的蛋白质印迹。F）在线粒体OXPHOS损伤期间媒介物SK-N-SH细胞和shPDK2 SK-N-SH细胞的线粒体膜电位评估。G）DARTS实验的蛋白质印迹。H）CETSA实验的蛋白质印迹。I）co-IP-MS实验的结果。J）Lip-MS实验的结果。K）媒介物SK-N-SH细胞和shPDK2 SK-N-SH细胞的细胞线粒体应激测试。L）在线粒体OXPHOS阻断期间shPDK2 SK-N-SH细胞的细胞线粒体应激测试。
Result 9 SG通过靶向PDK2调节线粒体依赖性凋亡
为了研究线粒体损伤导致细胞死亡的过程，作者采用蛋白质组学方法探讨SG对线粒体损伤细胞的影响。MitoMiner 4.0数据库共鉴定出4052个蛋白质，其中线粒体蛋白质509个，蛋白PPI富集分析主要集中在OXPHOS和TCA循环，包括丙酮酸激酶（PKM）和丙酮酸脱氢酶激酶2（PDK2），同时在生物过程分析中发现这些蛋白与多种凋亡过程相关。神经元凋亡在缺血性脑损伤中的重要作用已在人类和动物研究中得到证实。本研究采用流式细胞术比较了NaN3诱导的SK-N-SH细胞线粒体损伤和SG诱导的SK-N-SH细胞凋亡率。定量分析结果如图8 P所示，SG在不同浓度下显著降低由线粒体损伤引起的媒介物SK-N-SH细胞凋亡，但在shPDK2 SK-N-SH细胞中未观察到这种现象。细胞色素c在线粒体中的功能是ATP合成的生命支持功能的关键参与者。然而，当细胞接受凋亡刺激时，细胞色素c被释放到胞质溶胶中并通过凋亡触发程序性细胞死亡。细胞色素c向细胞质的释放和细胞色素介导的细胞凋亡受多层次的调节控制，最突出的参与者是B细胞淋巴瘤蛋白2（Bcl-2）家族。Western blot结果显示，细胞色素c表达显著增加，Bcl-2蛋白表达显著降低。而SG处理组在线粒体损伤过程中Bcl-2蛋白的表达明显增加。相应地，SG在shPDK2 SK-N-SH细胞中未显示此类作用（图8 N）。由于线粒体功能障碍会产生过量的ROS并诱导细胞凋亡，作者研究了SG对细胞凋亡的调节。经典的细胞凋亡途径主要由caspase-1介导。研究表明，活化的半胱天冬酶-1在GSDMD蛋白的中间接头处裂解，释放31 kDa的GSDMD N-末端片段（GSDMD-N），其引发焦亡。因此，作者研究了SG对经典pyrodeath途径中的关键蛋白caspase-1和GSDMD的影响。蛋白质印迹结果表明，在溶剂处理的SK-N-SH细胞和shPDK2 SK-N-SH细胞中，胱天蛋白酶1和GSDMD组之间无显著差异（图8 O）。这表明SG主要通过调节线粒体依赖的凋亡途径对线粒体损伤诱导的细胞死亡发挥神经保护作用。总之，这些结果表明，SG通过靶向PDK2来调节细胞凋亡。
总结与讨论
很多天然产物已经被报道多种多样的作用，但其发挥疗效的靶点和机制尚不清楚，影响其进一步合理的研发及临床应用。药物靶标的确定对于药理作用机制的研究，以及开发具有更高疗效和更少毒副作用的新一代药物至关重要。
中国医学科学院药物研究所张金兰研究员和蒋建东院士团队建立了靶向线粒体代谢及功能的活性成分发现和药效评价方法：首先基于活细胞能量代谢分析发现对线粒体有氧糖代谢有调控作用的活性物质，同时开展亚细胞水平线粒体蛋白组学和13C同位素标记代谢流示踪研究，明确活性物质调控的代谢物流向和通量，以及调控的代谢酶。然后基于激酶活性分析、质谱分析和分子生物学实验确证蛋白-活性成分的结合作用及结合口袋，最终发现灯盏乙素靶向脑组织线粒体PDK2-PDC调控线粒体有氧代谢，提升线粒体膜电位水平并降低线粒体损伤，对脑缺血大鼠的神经损伤具有保护作用。
本研究探索了通过调控PDK2-PDC轴治疗神经损伤和认知障碍的新潜在治疗方法，研究结果表明改善线粒体能量代谢缺陷的活性成分对神经系统疾病的治疗具有重要价值，该研究通过靶向代谢途径的活性小分子治疗疾病提供了一个模板，为其他中药小分子化合物蛋白靶点及其分子机制研究提供一定的借鉴意义。
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https://doi.org/10.1002/advs.202303584 IF: 15.1 Q1 B1
DOI: 10.1002/advs.202303584 IF: 15.1 Q1 B1
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