《广东农业科学》2022 年第 11 期电子书
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编辑部
主 编：陆华忠
副 主 编：张振飞 谢青梅
常务副主编：周灿芳
主 任：陆华忠
副 主 任：仇荣亮 易干军
编 委：（按姓氏笔画排序）
出 版 总 监：杨贤智
编辑部主任：张辉玲
责 任 编 辑：张辉玲 杨贤智 邹移光 崔建勋 白雪娜 丁伊璇（数字） 苏柱华
英 文 审 校：Ch’en Jui-fen
广东农业 科 学
广东农业 科 学
月刊 1965 年创刊
2022 年 11 月 第 49 卷 第 11 期
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Guangdong Academy of Agricultural Sciences
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主 编 陆华忠 Chief Editor LU Huazhong
th China Agricultural University
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GUANGDONG AGRICULTURAL SCIENCES
Monthly, Started in 1965
Vol. 49 No. 11 Oct. 2022
ISSN 1004-874X
CN 44-1267/S
邮发代号：46-43
定 价：30.00 元
国内外公开发行
第49卷 第11期
Vol.49 No.11
广东农业科学二〇二二年第四十九卷第十一期
2022
广东省农业科学院
华 南 农 业 大 学
主办 11
中 国 科 技 核 心 期 刊
RCCSE中国核心学术期刊（A-）
中国农林核心期刊（A）
ISSN 1004-874X
C N 44- 1 2 6 7 / S
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100280 0 20 T 211. ni b 0
200100281 T 11. ni b 0 9
T 4082001002 32. ni b
200100281 T . ni b 0 66
001 2T 00280 ni b 5 98.
200100280 T ni b 6 48.
200100280 T ni b 0 21.
200100280 T i b 0 05. n
00100280 2T b 6 ni 5.
T 0182001002 ni b 11. 1
T 0082001002 ni b 31.
200100281 T b 0 ni 03.
GNC CCB 91 522 76
T 0182001002 ni b 79.
2T 0100 0 79 2 b 7 ni 01. 7
T 6082001002 ni b 36.
200 T 10028 30 ni b 23.
T 7972001002 ni b 1. 8
T 0082001002 i b . n 56
20010028 T 00 i b . n 11 8
200100279 T 7 i b . n 03
2T 001002803 i b . n 6
200100280 T 3 i b . n 09
200100280 T 4 i b . n 63
2001002 T 801 i b . n 76
T 0082001002 i b . n 38
T 1082001002 i b . n 37
20 T 01002804 i b . n 17
T 6082001002 b ni 1. 1
20 T 01002805 b ni 2. 2
T 0182001002 b ni 7. 5
T 0082001002 b ni 6. 2
Isolated genome
MAG
Bacteroidota
Proteobacteria
Spirochaetota
Firmicutes
第2页
粮安天下，种铸基石。种质资源是农业的“芯片”，是保障国家粮食安全和重要农产品有效供
给的战略性资源。广东省农业科学院农业生物基因研究中心（简称“基因中心”）一直致力于开展
农作物种质资源（种子）安全保存机理及关键技术、作物品质形成机理与调控、多组学与基因编辑
技术、微生物资源挖掘与创新利用、病害防控技术基础等方面研究，并对外提供仪器共享使用、多
组学与细胞生物学技术服务；提供系统的动植物、农作物种质种子和微生物的鉴评与基因检测分析
等服务。
2022年适逢基因中心成立10周年。10年来，牢记初心、践行使命，先后建设6个学科研究方向
（植物种质资源研究、种子生物学研究、分子育种技术研究、微生物资源研究、作物品质控制与多组
学技术创新研究），开展农业生物资源保存利用、优异基因的挖掘，攻关多组学技术、转基因、基因
编辑技术创新、分子表型及其机制研究，推动农业基础与应用研究工作处于并跑和前列水平。构筑了
广东省农作物种质资源（库）的“诺亚方舟”，收集保存超万份种质资源；建设广东省农作物种质资
源保存与利用重点实验室、广东省农作物种子质量检验机构、广东省农作物种质资源库精准鉴评公共
平台；参与承担国家、农业农村部重点实验室高效精准基因编辑技术研究平台建设。
为庆祝成立10周年，基因中心精心组织18篇学术论文在《广东农业科学》刊发。重点报道基
因中心在农作物与农业微生物（基因）的资源发掘及其功能研究、多组学与基因编辑等共性关键技
术创新、应用等方面的研究进展，以期为广东种业振兴发展和农业现代化、助力乡村振兴工作提供
参考。“资源（基因）是人类赖以生存、从事生产的物质基础”“一粒种子，可以改变一个世
界”。在全面推进乡村振兴战略、深入实施种业振兴行动的新征程中，基因中心将继往开来、砥砺
奋进、再创佳绩，力争“走在全国前列”，为广东打造种业创新强省、促进现代农业高质量发展提
供更强大的科技和人才支撑，作出新的更大贡献。
广东省农业科学院农业生物基因研究中心
前 言
广东省农业科学院
农业生物基因研究中心
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组织架构
研究方向
农作物种质资源（种子）安全保存机理及共性关键技术研究；多组学技术与基因编辑技术研发；重要基因挖掘与突破性材
料创制；微生物资源挖掘与创新利用；病原微生物学与防控基础研究。
广东省农业科学院农业生物基因研究中心（以下简称“基因中心”）是成立于2012年的公益一类科研机
构。主要从事农业生物物种资源基础理论与应用研究、农业生物转基因研究，提供农业生物基因鉴评、保存
及信息共享等服务；受托日常管理中国农业科技华南创新中心公共实验室和广东农作物种质资源保护库。
人才团队
现有在职员工61人，其中具有博士学位31人（占比65%），具有高级职称16人（占比33%），具有国外访学或工作经历14人
（29%），45岁以下中青年占比80%。全国规模化养殖场动物疫病净化评估专家1人，广东省农业科技战略专家1人，广东省现代
农业产业体系首席专家1人、岗位专家1人，广东省特支计划科技创新青年拔尖人才1人，广州市政府重大行政决策咨询论证专家
1人，广州市青年托举计划人才1人。入选广东省百名博士博士后创新人物2人、院“金颖之星”1人、院“青年研究员”3人、院
“青年副研究员”1人。入选院“十三五”培育团队1个（农业生物基因组编辑团队）、院“十四五”新兴团队2个（基因编辑技
术创新应用团队、种子表型组与智慧生产团队）。
植物种质资源研究室
种子研究室
分子育种技术研究室
微生物资源研究室
华南创新中心公共实验室
5
个
科
研
部
门
4
个
管
理
部
门
办公室
财务科
科技管理科
科技条件与推广服务部
广东省农业科学院农业生物基因研究中心
第4页
“十三五”以来，基因中心承担国家、省市级重点基础研究、应用基础研究项目等300余项，立项经费1.08亿元，取得丰硕
的科研成果。发表学术论文240篇，SCI论文170篇（JCR一、二区68篇），其中在《Nature Plants》《Plant Cell》《Molecular
Plant》《Genome Biology》等10分以上期刊发表论文15篇；参编论著5部；获授权专利34项；获软件著作权11项；入选广东省主
推技术3项；获各类科研成果奖6项。
条件平台
建设农业农村部华南现代生物种业重点实验室分中心、广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室、广东省农作物种质
资源库、广东省农作物种子质量检验机构、广东省农作物种质资源库精准鉴评公共平台、广东省生猪精准养殖工程技术中心、
广州国际种业种质资源库、生物安全二级兽医实验室等平台。受托管理中国农业科技华南创新中心公共实验室和广东农作物种
质资源保护库。
科技合作
与美国、德国、俄罗斯、加拿大、日本、澳大利亚和东盟等20多所科研机构和高校建立了合作关系；与德国马普分子植物
生理研究所、阿根廷国家农科院、美国康奈尔大学、加拿大温莎大学、美国美国宾夕法尼亚大学、华中农业大学、华南农业大
学等国内外20余家单位开展项目合作研究。近年来，科技服务院外的科研事业单位74家、技术推广机构31家、企业单位104家，
院内研究所14个。先后派出281人次助力脱贫攻坚和乡村振兴工作，派驻各地分院15人，举办技术培训105场次。牵头落实广东
省农业科学院汕头分院建设工作。在学习强国、湖南电视台、广东电视台、南方农村报、南方都市报、南方+、广州日报、大湾
区卫视等10余家媒体宣传报道，不断提升影响力。
科研业绩
胡春华副总理访问阿根廷国家农业科学院
调研双方合作项目
大湾区（广东）农业科技论坛暨
生物育种国际学术研讨会
展望未来，基因中心以党建引领，“求实、创新、笃行、务农”院训指引科技创新、服务“三农”工作，努力构建全省乃
至华南地区领先的农业种质资源公益性、基础性科研机构，力争在农业生物基因编辑、种质智慧鉴评与利用、农用微生物多组
学、微生物病原学研究等技术领域走在全国前列，为科技支撑乡村振兴、农业农村现代化作出应有贡献！
“科创中国”中国-阿根廷畜病防控专业
科技创新院启动会
第5页
植物种质资源研究室 种子研究室
（种子表型组学与智慧生产研究团队）
主要开展农作物种质资源的理论与技术研究，包括种质资源的收集、保存、鉴评、创新利用与信息共
享，开展种子生物学研究、种子智慧生产和农作物种子质量控制研究等。建立了种质资源库（圃）、信息数
据平台相结合的种质资源安全保存平台系统和规范保存技术体系；建立了农作物种质资源智慧、高效表型组
学鉴评技术体系；建立了农作物种子质量检验技术体系。负责省重点实验室、省种质资源库和农作物种子质
量检验机构的运行管理服务。
人才队伍
团队学科带头人为刘军研究员。现有13名科技人员，其中具有博士学位8人，具有高级职称2 人。入选院“十四五”农业
优势产业学科新兴团队（种子表型组与智慧生产新兴团队）。
科技产出
主持承担科研项目56项，其中国家自然科学基金项目7项、广东省重点领域研发计划项目1项、农业农村部物种品种资源保护
费项目3项、广东省重点实验室建设项目1项等。研究成果在《Plant Journal》《Rice》《PlantCell》《NAR》等期刊发表学术论文
58篇。获得授权发明专利21项，参编著作2部，研发产品10个。获省科技进步奖等多项科技奖励，研究成果处于国内领先水平。
研究方向
贾俊婷 博士 助理研究员 研究室副主任
舒 洁 博士 助理研究员
钟明生 博士 助理研究员
戴彰言 硕士 助理研究员
吴柔贤 硕士 助理研究员
解 昊 硕士 助理研究员
高家东 硕士 助理研究员
张文虎 硕士 研究室主任
陈兵先 博士 副研究员 研究室副主任
李 清 博士 助理研究员
史敬芳 博士 助理研究员
刘圣杰 博士 助理研究员
方向1： 种质资源收集保存、种质资源鉴评利用
方向2：种子共性关键技术、种子质量控制
学科带头人：刘军 博士 研究员 研究室主任
论文论著代表作：
种质资源收集保存、种质资源鉴评利用、种子共性关键技术、种子质量控制。
第6页
华南创新中心公共实验室
（作物品质控制与多组学技术创新团队）
以“四个面向”为指导，聚焦基于质谱平台的组学技术研发与创新应用；围绕农作物果实/种子在储藏过
程中出现的品质下降、真菌毒素污染等制约产业发展的瓶颈问题，开展耐储藏优异基因发掘与品质的代谢调
控、作物储藏过程中的质量安全控制机理研究。
人才队伍
团队现有13名科技人员（固定在编9人、科研助理4人），其中具有博士学位8人，具有高级职称5人。入选广东省特支计划
科技创新青年拔尖人才1人、广东省百名博士博士后创新人物1人、广州市青年科技托举工程人才1人、院中青年学科带头人“金
颖之星”1人、院“青年研究员”2人。
科技产出
主持承担科研项目33项，其中国家自然科学基金项目5项、国家转基因重大专项调增课题1项、省重点领域研发计划项
目1项 、 省 市 级 项 目26项 。 以 第 一 作 者 或 通 讯 作 者 （ 含 并 列 ） 在 《Trends in Plant Sciences》 《Plant Cell》 《Green
Chemistry》《Food Chemistry》《Chemical Science》等重要期刊共发表学术论文51篇。获授权专利12项，参编著作2部。
研究方向
科学问题
技术问题
产业问题
理论创新
技术突破
产品创制
品质优异基因挖掘与代谢调控
作物储藏过程的质量控制机理研究
多组学精准检测与分析技术研发
优质、耐储藏作物新种质创制
作物储藏减损防控新技术
学
技
术
创
新
团
队
作
物
品
质
控
制
与
多
组
论文代表作：
方向1： 空间代谢组学与蛋白质组学技术研发及应用
方向2：作物果实/种子储藏品质形成机理与代谢调控
青年学科带头人：晏石娟 博士 研究员
殷志斌 博士 副研究员
吴绍文 博士 副研究员
张文洋 博士 助理研究员
黄文洁 硕士 助理研究员
李文燕 博士 副研究员 研究室副主任（主持工作）
陈中健 博士 副研究员
李秀梅 博士 助理研究员
陈园园 博士 助理研究员
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分子育种技术研究室
（基因编辑技术创新应用研究团队）
开展农业生物基因编辑技术研发和新种质创新研究，以及农业生物高产、优质和抗逆基因挖掘和应用。
人才队伍
团队现有10名科技人员，其中博士8人、副研究员4人。团队入选院“十四五”农业优势产业学科新兴团队（基因编辑
技术创新应用团队）。刘文华、刘勤坚、陈沛分别具有美国宾夕法尼亚大学、美国佛罗里达州立大学、香港中文大学学习
工作经历。1人入选广东省百名博士博士后创新人物。
科技产出
主持承担科研项目21项，其中国家自然科学基金项目2项，省市级项目13项；在《生物技术通报》《分子植物育种》
等期刊发表学术论文21篇；获授权专利1项，参编著作1部。
研究室目前已建立CRISPR RNP和供体DNA共位介导的基因替换技术平台，建立了无外源DNA的CRISPR RNP基因编辑
技术平台，创制了基因编辑的抗稻瘟病和白叶枯病水稻、高油酸大豆和抗青枯病番茄，制备了环保基因定点整合的猪成纤
维细胞系及基因编辑的抗蓝耳病猪，获得了猪全基因组蛋白编码基因的基因编辑文库，用于解析猪-病毒互作体系。
研究方向
于 洋 博士 副研究员 研究室副主任（主持工作）
薛 皦 博士 助理研究员
陈 沛 博士 助理研究员
冯彦钊 博士 助理研究员
朱庆锋 硕士 助理研究员
刘文华 博士 副研究员 研究室副主任
王 森 博士 副研究员
张爱霞 博士 副研究员
刘勤坚 博士 助理研究员
张 琪 硕士 助理研究员
作物重要农艺性状形成的遗传机理（产量、抗病性）
作物环境适应性演化的分子基础（作物对岭南自然环境的适应性）
基因编辑技术研发（精准控制、非精准控制）
基因编辑新材料的创制（调控区编辑、感病基因编辑）
方向1：优异基因挖掘
方向2：基因编辑技术
优异基因挖掘
基因编辑技术
分子
育种
技术
论文代表作：
第8页
微生物资源研究室
主要从事动物健康养殖重要理论研究及关键技术开发，主要包括动物病原诊断、感染机制和综合防控技
术研究，以及养殖微生物和环境微生物开发与应用。
人才队伍
团队现有12名科技人员，其中研究员2人、副研究员4人。贝锦龙、张晓爱、余界石分别具有美国康奈尔、德国海因里希·
海涅大学、美国南达科他州立大学海外留学经历。董博获第一届全国博士后创新创业大赛铜奖。
科技产出
主持承担科研项目51项，其中国家自然科学基金项目2项，省市级项目19项。研究成果在《Microbiology Spectrum》
《Journal of Hazardous Materials》《Scientia Horticulturae》《Journal of Animal Science》等期刊共发表学术论文75篇，获得授权
专利6项，参编著作1部。
研究方向
学科带头人：魏文康 博士 研究员
张晓爱 博士 副研究员 研究室副主任（主持工作）
贝锦龙 博士 副研究员 研究室副主任
余界石 博士 副研究员
董 博 博士 助理研究员
王 蕾 博士 助理研究员
吴斯宇 博士 助理研究员
罗帝洲 硕士 助理研究员
学科带头人：陈庄 博士 研究员
王志林 硕士 副研究员
俞 婷 博士 助理研究员
邓俊劲 博士 助理研究员
方向1：病原微生物与生物安全研究
方向2：功能微生物与种质研究
农业微生物资源收集鉴评及其创新利用研究；动物疫病诊断、病原感染机制和综合防控研究。
论文代表作：
第9页
广东农业科学
GUANGDONG NONGYE KEXUE 2022 年 11 月 第 49 卷 第 11 期
（月 刊）
目 次
丁型流感病毒在中国的流行状况及研究进展........................................................................余界石，魏文康（1）
纳米抗体在真菌毒素检测中的应用 ..........................................................吴绍文，邹新路，胥锦涛，晏石娟（9）
功能微生物在生态健康养殖中的应用研究进展
.........................................................邓俊劲，张艳彬，张健玲，刘书欣，俞 婷，牛志凯，王志林，陈 庄（22）
基于肠道宏基因组对弹涂鱼两栖适应性的研究
.......................................... 董 博，邓涵逸，孙艺秋，房元杰，彭淼曦，石 琼，贝锦龙，魏文康，陈 庄（33）
基于改进 YOLOX 模型的柑橘木虱检测方法
.........................................................王海漫，俞 婷，肖明明，杨嘉诚，陈富荣，易干军，林德球，罗 敏（44）
猪源发酵乳杆菌的筛选及其潜在益生性能
....................................................................... 张艳彬，王素峰，张健玲，刘书欣，邓俊劲，王志林，陈 庄（51）
植物提取物活性成分抗伪狂犬病毒研究进展............房元杰，张晓爱，莫敏莹，邓紫璇，施炜涛，魏文康（58）
流式细胞术在农业研究领域中的应用
.........................................................王 蕾，罗帝洲，邓紫璇，莫敏莹，张健玲，苏颖辉，房元杰，张晓爱（67）
脂质分析技术及其在植物种子脂质代谢调控研究中的应用进展..........殷志斌，陈旭峰，江 彪，晏石娟（76）
蛋白质互作组学技术及其在植物研究中的应用进展 .............................张文洋，张 胜，易干军，晏石娟（88）
基于质谱的代谢组学数据分析技术研究进展.......................... 黄文洁，吴绍文，刘 蕊，孔 谦，晏石娟（98）
利用 CRISPR/Cas9 技术创制水稻中花 11 号 dwarf1 突变体
...................................................................................................冯彦钊，朱庆锋，薛 皦，陈 沛，于 洋（113）
基于同源重组的 CRISPR 精准基因编辑技术及其在农作物育种中的应用
.......................................................江桐欣，李晓琳，朱庆锋，张 琪，张爱霞，刘勤坚，于 洋，刘文华（122）
水稻穗发芽研究进展................................................................张 琪，贾俊婷，张爱霞，刘文华，陈兵先（132）
植物 α- 半乳糖苷酶的进化及功能研究进展.......................................李秀梅，陈中健，李文燕，晏石娟（143）
水稻组蛋白去甲基化酶基因 OsJMJ719 的克隆及表达分析
.......................................................贾俊婷，陈兵先，吴柔贤，戴彰言，钟明生，解 昊，刘双幸，刘 军（157）
显齿蛇葡萄叶绿体基因组密码子使用偏好性分析...............................李 清，罗永坚，葛 蓉，刘 军（167）
小豆 AUX/IAA 基因家族全基因组鉴定及表达分析..............................罗永坚，葛 蓉，刘 军，李 清（176）
期刊基本参数：CN44-1267/S*1965*m*A4*188*zh*P*¥30.00*1000*19*2022-11
主管 ： 广东省农业科学院
主办 ： 广东省农业科学院
华南农业大学
协办 ： 广州市农业科学研究院
广州花卉研究中心
深圳市农业科技促进中心
广东现代金穗种业有限公司
张 华 广州市农业科学研究院 院长 研究员
周晓云 广州花卉研究中心 副主任 高级农艺师
李志强 深圳市农业科技促进中心 副主任 高级农艺师
张衍荣 广东现代金穗种业有限公司 总经理 博士 研究员
特邀编委 ：
第10页
GUANGDONG AGRICULTURAL SCIENCES
（Monthly）
Vol. 49 No. 11 Nov. 2022
MAIN CONTENTS
Epidemiology and Research Advances of Influenza D Virus in China .............................YU Jieshi, WEI Wenkang（1）
Applications of Nanobodies in Mycotoxin Detection ................WU Shaowen, ZOU Xinlu, XU Jintao, YAN Shijuan（9）
Progress in Application of Functional Microorganisms in Ecological and Healthy Breeding ............. DENG Junjin,
ZHANG Yanbin, ZHANG Jianling, LIU Shuxin, YU Ting, NIU Zhikai, WANG Zhilin, CHEN Zhuang（22）
Study on the Amphibious Adaptability of Mudskippers Based on Intestinal Metagenome ..................................................................................................................................DONG Bo, DENG Hanyi,
SUN Yiqiu, FANG Yuanjie, PENG Miaoxi, SHI Qiong BEI Jinlong, WEI Wenkang, CHEN Zhuang（33）
Detection of Citrus Psyllid Based on Improved YOLOX Model ....................................WANG Haiman, YU Ting, ........................................XIAO Mingming, YANG Jiacheng, CHEN Furong,YI Ganjun, LIN Deqiu, LUO Min（44）
Screening of Lactobacillus Fermentum from Piglets and Its Potential Probiotic Properties ..........ZHANG Yanbin, .......................... WANG Sufeng, ZHANG Jianling, LIU Shuxin, DENG Junjin, WANG Zhilin, CHEN Zhuang（51）
Research Progress in Active Components of Plant Extracts Resistant to Pseudorabies Virus ..............................FANG Yuanjie, ZHANG Xiaoai, MO Minying, DENG Zixuan, SHI Weitao, WEI Wenkang（58）
Application of Flow Cytometry in Agricultural Research ...............................................WANG Lei, LUO Dizhou, ...........................DENG Zixuan, MO Minying, ZHANG Jianling, SU Yinghui, FANG Yuanjie, ZHANG Xiaoai（67）
Progress in Lipid Analysis Techniques and Their Applications to Studies of Lipid Metabolic Regulation in Plant Seeds ................................................................................ YIN Zhibin, CHEN Xufeng1, JIANG Biao, YAN Shijuan（76）
Progress in Protein Interactomics Technologies and Their Applications to Plants Research ..........................................................................ZHANG Wenyang, ZHANG Sheng, YI Ganjun, YAN Shijuan（88）
Progress in Mass Spectrometry-based Metabolomics Data Analysis Techniques ..............................................................HUANG Wenjie, WU Shaowen, LIU Rui, KONG Qian, YAN Shijuan（98）
Construction of Dwarf1 Mutants in Zhonghua 11 (Oryza sativa L.) by CRISPR/Cas9 .................................................................. FENG Yanzhao, ZHU Qingfeng, XUE Jiao, CHEN Pei, YU Yang（113）
Homologous Recombination-based CRISPR Precision Gene Editing Technology and Its Application in Crop
Breeding ...............................................................................................................................JIANG Tongxin,
LI Xiaolin, ZHU Qingfeng, ZHANG Qi, ZHANG Aixia,LIU Qinjian, YU Yang, LIU Wenhua（122）
Research Progress in Pre-harvest Sprouting of Rice ................................................ ZHANG Qi，JIA Junting， .............................................................................................ZHANG Aixia，LIU Wenhua，CHEN bingxian（132）
Research Progess in the Evolution and Functions of Plant α-galactosidases ................................................................................LI Xiumei, CHEN Zhongjian, LI Wenyan, YAN Shijuan（143）
Analysis on Cloning and Expression of Histone Demethylase Gene OsJMJ719 in Rice ................ JIA Junting,
CHEN Bingxian, WU Rouxian, DAI Zhangyan, ZHONG Mingsheng, XIE Hao, LIU Shuangxing, LIU Jun（157）
Analysis on Codon Usage Bias of Chloroplast Genome in Ampelopsis grossedentata ...................................................................................................LI Qing, LUO Yongjian, GE Rong, LIU Jun（167）
Genome-wide Identification and Expression Analysis of AUX/IAA Gene Family Members in Vigna angularis ...................................................................................................LUO Yongjian, GE Rong, LIU Jun, LI Qing（176）
本刊声明：本刊已许可中国学术期刊全文数据库、万方数据 - 数字化期刊群、中文科技期刊数据库、超星数字图书馆
等国内外数据库以及博看网，以数字化方式复制、汇编、发行、信息网络传播本刊全文。作者向本刊提交文章发表的行为即
视为同意我刊上述声明。
第11页
收稿日期：2022-10-09
基金项目：广东省农业科学院科技人才引进专项（R2021YJ-QG008）；广东省农业科学院农业生物基因研究中
心创新基金重点项目
作者简介：余界石（1987—），男，博士，研究方向为流感病毒，E-mail：jieshi_yu@outlook.com
通信作者：魏文康（1971—），男，博士，研究员，研究方向为预防兽医，E-mail：weiwenkang@gdaas.cn
广东农业科学 2022，49（11）：1-8
Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2022.11.001
余界石，魏文康 . 丁型流感病毒在中国的流行状况及研究进展［J］. 广东农业科学，2022，49（11）：1-8.
丁型流感病毒在中国的流行状况及研究进展
余界石，魏文康
（广东省农业科学院农业生物基因研究中心 /
广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，广东 广州 510642）
摘 要：丁型流感病毒是继甲型、乙型和丙型流感病毒之后的一种新型正粘病毒，2011 年首次由美国从表
现出流感样症状的猪只中分离出来，并于 2016 年被国际病毒分类委员会正式命名为丁型流感病毒。目前丁型流
感病毒已广泛分布于美洲、亚洲、欧洲和非洲的数十个国家。丁型流感病毒利用牛作为其自然宿主和扩增宿主，
并定期扩散到其他哺乳动物物种，包括猪、马、羊和骆驼等。因此，丁型流感病毒具有广泛的地域分布和宽泛
的宿主范围。丁型流感病毒感染可导致牛患轻度至中度呼吸道疾病，被认 为是牛呼吸系统疾病综合征的重要关
联因子。血清学证据表明，丁型流感病毒具有感染人的潜在风险。我国研究人员于 2014 年首次在山东省的牛群
中检测到丁型流感病毒，随后，来自不同团队的研究人员分别于 2017、2021 和 2022 年报道了丁型流感病毒核
酸阳性病例。为更好地了解丁型流感病毒对我国畜牧养殖业的影响，系统综述了丁型流感病毒在我国的分布情
况和研究进展，并分析 了丁型流感病毒在我国的流行趋势及对我国畜牧养殖业的潜在威胁。
关键词：丁型流感病毒；流行趋势；遗传与演化；致病与传播；致 病性；人畜共患风险
中图分类号：S855.3 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2022）11-0001-08
Ep idemiology and Research Advances of
Influenza D Virus in China
YU Jieshi, WEI Wenkang
（Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences /
Guangdong Key Lab of Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou 510640, China）
Abstract: Influenza D virus, a new type of Orthomyxovirus following influenza A, B and C viruses, was first isolated
from pigs exhibiting flu-like symptoms in the United States in 2011, and was officially named by the International Committee
on Classification of Viruses in 2016. Currently, influenza D virus has been widely distributed in dozens of countries such
as the Americas, Asia, Europe and Africa. Influenza D virus uses cattle as its natural and amplified host, which regularly
spreads virus particles to other mammal species, including pigs, horses, sheep and camels. Therefore, influenza D virus has
a wide geographical distribution and a broad host range. Influenza D virus infection can cause mild to moderate respiratory
disease in cattle and is considered to be one of the major correlation factors of respiratory disease syndrome in cattle.
Serological evidence suggests that influenza D virus is a potential risk for human infection. In China, researchers first
detected influenza D virus in cattle in Shandong Province in 2014. Subsequently, researchers from different groups reported
positive cases of influenza D virus in 2017, 2021 and 2022. In order to better understand the influence of influenza D virus
on animal industry in China, this review systematically summarizes the distribution and research progress of influenza D
virus in China, and analyzes its epidemic trend and the potential threat to animal industry in China.
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2
流感 病毒属于正粘病毒科，包含 4 个属，分
别是 α 流感病毒属、β 流感病毒属、γ 流感病毒属
和 δ 流感病毒属，其中每个属只包括 1 种类型，
分别为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感
病毒和丁型流感病毒［1］。甲型流感病毒是所有类
型流感病毒中最具攻击性和最值得关注的病毒，
其宿主范围最广，感染造成的发病率和死亡率最
高，并且可以引发严重的呼吸道疾病，是季节性
流感和以往所有流感大流行的元凶［2］。乙型流感
病毒感染可引起轻度至重度呼吸道疾病，也会造
成季节性流感，但通常仅限于人类［3］。一般情况下，
丙型流感病毒感染只引起轻微的呼吸道症状［4］。
虽然大多数人在幼儿时期就产生了丙型流感病毒
的抗体（表明曾接触过这种病毒），但由丙型流
感病毒引起的临床疾病相关报告相对较少，因此
对其的关注度也相对较低。
丁型流感病毒是正粘病毒家族的最新成员。
2011 年，美国科研人员首次从表现出流感样症状
的猪只中分离出 1 株新型流感病毒。由于该病毒
与人类丙型流感病毒有 50% 的基因同源性，因此
其早期被认为是一种新亚型的猪丙型流感病毒［5］。
进一步研究发现，这种新型流感病毒在与甲型、
乙型或丙型流感病毒共同感染的情况下不会发生
基因组重配，而且其基因组组成和一些生物学特
性与已知类型的流感病毒存在明显差异［6］。第
一，在受体识别和结合方面，丁型流感病毒除了
与丙型流感病毒一样结合唾液酸分子 Neu5,9Ac2
作为进入细胞的受体，其还可以结合唾液酸分子
Neu5Gc9Ac 作为它的受体［7- 8］。丁型流感病毒表
现出更强和更广谱的受体结合能力［7］。第二，丁
型流感病毒基因组节段 M 的剪切方式不同于其他
类型流感病毒。甲型和乙型流感病毒的 M1 蛋白
由未拼接的 mRNA 转录而成，而丙型和丁型流感
病毒的 M1 蛋白由拼接的 mRNA 转录而成［6, 9］。
但丙型流感病毒 M 基因组节段剪接转录产生 1 个
终止密码子形成 M1 mRNA，而丁型流感病毒 M
基因组节段的剪接转录产生 1 个额外的 4- 氨基
酸肽，添加到其 M1 的外显子中［9］。目前，该额
外的 4- 氨基酸肽在丁型流感病毒生命周期中的
作用还未阐明。第三，丁型流感病毒具有独特的
耐热、耐酸特性，在 4 种类型流感病毒中最稳定［10］。
国际 病毒分类委员会于 2016 年正式将该病毒命名
为丁型流感病毒［9］。
大量研究证实，丁型流感病毒以牛为主要天
然宿主，尚未发现其与人类的临床感染有关［11］。
但有机会接触这种病毒的特殊人群（如牛场工
作人员）具有很高水平的针对该病毒的抗体阳
性率［12］。近年来，随着丁型流感病毒在牛群和
猪群中的检出率不断升高，其会否成为新的人
畜共患病病毒备受关注。目前，根据病毒主要
表面抗原 HEF 的序列差异，已发现 5 个遗传演
化谱系的丁型流感病毒，分别是 D/OK、D/660、
D/Yama2016、D/Yama2019 和 D/CA2019［13］。
在 欧 洲 和 美 洲， 主 要 流 行 D/OK、D/660 和 D/
CA2019 谱 系 的 丁 型 流 感 病 毒；D/Yama2016 和
D/Yama2019 谱系的丁型流感病毒主要在日本流
行［14-16］。对许多国家来说，丁型流感病毒的流
行状况依然不清楚。
我 国 研 究 人 员 于 2014、2017、2021、2022
年陆续报道了丁型流感病毒的核酸阳性病例。但
丁型流感病毒在我国的总体流行情况、遗传多样
性信息，以及对我国畜牧业的影响依然不明确。
本综述系统性地总结了丁型流感病毒在我国的分
布情况和研究进展，并且分析了丁型流感病毒对
我国畜牧业的潜在威胁，为我国相关科研人员深
入研究有潜在致病性的丁型流感病毒提供参考和
借鉴。
1 丁型流感病毒流行情况及致病性概述
1.1 丁型流感病毒具有宽泛的宿主范围且分布
广泛
虽然丁型流感病毒的首次分离源于猪，但越
来越多的研究发现，该病毒主要在牛群中流行［6,
17-19］。研究人员在牛群中发现了丁型流感病毒的
高阳性率（>80%）［9］。因此，牛被认为是丁型流
感病毒的主要天然宿主［6, 9, 11］。此外，回顾性血清
学研究发现，最早于 2003 年的牛血清中检测到丁
型流感病毒抗体［20］，说明该病毒存在的时间可能
比较长。除了 牛和猪外，在马、绵羊、山羊、骆驼、
野猪和鹿血清中也检测到丁型流感病毒抗体［5, 9, 21-
Key words: influenza D virus; epidemiology; genetics and evolution; pathogenesis and transmission; pathogenicity;
zoonotic risk
第13页
3
26］。马来 西亚研究人员在养禽场的气溶胶中检测
到丁型流感病毒基因组核酸［27］。可见，丁型流感
病毒具有宽泛的宿主范围。到目前为止，丁型流
感病毒已广泛 分布于全球数十个国家，包括美洲
的美国、墨西哥和加拿大，亚洲的中国、日本和
土耳其，欧洲的法国、爱尔兰、意大利、卢森堡、
英国等，以及非洲的埃塞俄比亚、多哥、摩洛哥、
肯尼亚、纳米比亚等［9, 28］。
1.2 丁型流感病毒是牛呼吸系统疾病综合征的重
要关联因子
考虑到丁型流感病毒的广泛分布与传播，充
分了解其致病性显得尤为重要。宏基因组学研究
表明，丁型流感病毒与牛呼 吸系统疾病综合征密
切相关［29-31］。牛呼 吸系统疾病综合征是一种多
因子疾病，由宿主、病原和环境因素之间的复杂
相互作用引起［32］。通常在有压力和不利环境条
件下的牛更容易受到原发性病毒感染，而病毒感
染可能继发细菌入侵，从而导致严重疾病甚至死
亡［32］。目前与牛呼吸系统疾病综合征直接关联
的病毒包括牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管
炎病毒、牛呼吸道实验室合胞病毒、牛副流感病
毒 3 型和丁型流感病毒［33］。研究表明，丁型流
感病毒可在牛中引起轻度至中度呼吸道症状，而
且病毒能够在牛的上、下呼吸道中复制［33-35］。
一项最新研究发现，与单 独感染相比，丁型流感
病毒和牛支原体合并感染会增加犊牛呼吸道疾病
的严重程度［36-37］。丁型流感病毒感染促进牛分
枝杆菌在下呼吸道的定殖，增加白细胞向气道腔
的汇集［36］。由于牛是丁型流感病毒的自然宿主，
因此在牛群中加强对该病毒的持续监测和风险评
估十分必要。
1.3 丁型流感病毒具备潜在人畜共患风险
丁型流感病毒是否具备人畜共患潜能仍无定
论，迄今为止没有直接证据表明丁型流感病毒可
在人体内致病或在人群之间传播。然而，有实验
证明丁型流感病毒能够通过豚鼠和雪貂的直接接
触传播，而这两种动物都是已建立的人类流感病
毒感染模型［5, 38］。此外，美国早期的一项血清学
调查显示，1.3%（n=316）的普通人群具有丁型
流感病毒抗体［5］。来自 美国佛罗里达州的一项血
清学研究显示，在有牛接触史的工人血清中，丁
型流感病毒抗体阳性率高达 98%［12］。意大 利一
项更全面的血清学研究显示，2005—2017 年期间，
所调查区域内携带丁型流感病毒抗体的人群占比
5.1%~46.0% 不等［39］。美国环境公共卫生学相关
研究发现，在公共场所（如医院和机场）收集的
气溶胶样品中存在丁型流感病毒基因组核酸［40-
41］。上述研究结果提示丁型流感病毒具有人畜共
患风险。虽然丁型流感病毒被证明只在牛中引起
轻度或中度呼吸道疾病，但是丁型流感病毒在全
球数十个国家持续传播，并具有人畜共患传播的
可能性，因此，系统性地分析和了解丁型流感病
毒的流行与演化及致病性与传播，对评估和预防
该病毒对畜牧业的危害至关重要。
2 丁型流感病毒在中国的流行与分布
继美国研究人员在俄克拉荷马州首次分离出
丁型流感病毒［5］后不久，美国其他地区［18, 21, 42］
以及一些国家，如中国［23, 43］、日本［44］、意大
利［19, 45］、法国［17］、加拿大［21］、爱尔兰［46］、
卢森堡［47］、英国［48］和埃塞俄比亚［49］，也陆续
报道了该病毒的核酸或血清阳性病例。20 14 年，
研究人员在我国山东省的牛群中检测到丁型流感
病毒。研究人员从 15 个养牛场的表观健康牛群中
采集了 453 份鼻拭子样本，通过 RT-PCR 检测，
发现其中有 3 份（0.66%）呈丁型流感病毒核酸
阳性，并且获得了它们的基因组序列［43］。这些
毒株分别被命名为 D/bovine/Shandong/Y127/2014、
D/bovine/Shandong/Y125/2014、D/bovine/Shandong/
Y217/2014。这是 继欧洲和美洲之后，首次在亚洲
报道丁型流感病毒的阳性病例。
随后，科研人员在我国南方牛群中也检测到
丁型流感病毒。该研究团队收集了来自伴有临床
症状的不同动物共 607 份临床样本和 250 份无症
状动物的鼻拭子样本［23］。被采集样本的动物包
括牛（奶牛、黄牛和水牛）、猪和山羊，主要分
布于广东省广州、清远、河源和江门 4 市的 16
个农场［23］。检测结果显示，奶牛、黄牛和猪鼻
拭子样品中丁型流感病毒的核酸阳性率分别为
12.8%(20/156)、7.3%(4/55) 和 36.8%(7/19)［23］。
该 团 队 研 究 人 员 还 首 次 在 奶 牛、 水 牛 和 山 羊
的血清样本中检测到丁型流感病毒基因组核
酸， 阳 性 率 分 别 为 7.8%(15/193)、5.9%(3/51) 和
33.8%(27/80)；他们还发现猪肺样本中丁型流感病
毒阳性率也比较高、为 28.9%（13/45)［23］。
为了监测丁型流感病毒在我国的流行与分
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4
布，研究人员检测了来自安徽 (124)、广东 (88)、
福 建 (460)、 山 东 (17)、 江 苏 (235) 和 河 南 (21)7
个省份共 945 份具有呼吸道疾病的猪肺组织样
本，结果发现，其中 6 份呈丁型流感病毒核酸
阳 性， 这 些 毒 株 分 别 被 命 名 为 D/swine/China/
Fujian706/2018、D/swine/China/Anhui7/2018、
D/swine/China/Anhui8/2018、D/swine/China/
Anhui119/2018、D/swine/China/JiangsuQF54/2018
和 D/swine/China/JiangsuQF52/2018［50］。该研究结
果表明，在我国南方的安徽、江苏和福建省份的
猪群中存在丁型流感病毒流行。尽管丁型流感病
毒最早是从猪身上被分离到，但其在猪群中的流
行率低于其在牛群中的流行率。该研究首次报道
了丁型流感病毒在亚洲的猪群中流行。
在最新的一项丁型流感病毒的监测研究中，
研究人员从广东的一个肉牛屠宰场采集了 250 份
表观健康牛的鼻拭子样本，其中 10 份呈丁型流感
病毒核酸阳性［51］。这些丁型流感病毒阳性样品
分别来自 甘肃、内蒙古、安徽、陕西、辽宁、宁夏、
河北、青海和广东的养牛场［51］。以上研究结果
提示，丁型流感病毒可能已在我国广泛流行。
3 丁型流感病毒中国毒株的遗传多样性
丁型流感病毒与丙型流感病毒一样含有 7 种
基因组节段［5］，其中最长的 3 个节段分别编码
病毒聚合酶复合体的 3 个组分 PB2、PB1 和 P3，
第 4 长节段编码病毒唯一的表面糖蛋白 HEF，第
5 长节段编码病毒核蛋白 NP，最短的两个基因组
节段（M 和 NS）分别通过不同的策略产生病毒
基质蛋白 M1、离子通道蛋白 M2 以及非结构蛋白
NS1 与 NS2。HEF 是丁型流感病毒中最易变异的
基因组节段，主要用于该病毒的系统演化分析。
根据 HEF 的序列差异，丁型流感病毒被分为 5 个
不同的遗传演化谱系，分别为 D/OK、D/660、D/
Yama2016、D/Yama2019 和 D/CA2019。
D/OK 谱系是目前被报道最多的谱系［9］。在
D/OK 谱系中，来自中国的毒株与来自美国和意
大利的毒株在遗传演化关系上彼此分离，表明不
同国家的丁型流感病毒可能存在亚谱系。如图 1
所示，D/OK 谱系的丁型流感病毒中国毒株自成
一个小分支［23, 43, 50］。此外，来自美国和意大利的
D/OK 谱系中的猪源毒株和牛源毒株通常聚集在一
起，表明 D/OK 谱系的丁型流感病毒在猪和牛之
间可能相互传播。然而，已报道的丁型流感病毒
中国毒株表现出非常低的遗传多样性（遗传距离
<0.005）。在 D/660 谱系中，来自美国的毒株不
断分化，演化出新的亚谱系毒株（图 1）。最近
在日本出现的丁型流感病毒株被认为属于新的遗
传演化谱系，分别是 D/Yama2016 和 D/Yama2019
（图 1），这两个谱系的毒株只存在于日本，并
且与其他国家流行的 D/OK 和 D/660 谱系的毒株
有很大差异［9, 16］。目前 D/CA2019 谱系的丁型流
感病毒只在美国被报道［13］。值得重视的是，研
究人员最近在中国牛群中发现了 D/Yama2019 谱
系的丁型流感病毒［51］。该研究是首次在日本以
外的国家检测到 D/Yama2019 谱系的丁型流感病
毒。这说明丁型流感病毒中国毒株也存在遗传多
样性。
在美洲和欧洲，D/OK 和 D/660 谱系的丁型流
感病毒在牛群中共同传播且频繁重配。不同谱系
红色部分为丁型流感病毒中国毒株
Influenza D virus strains from China are labelled by red color
图 1 丁型流感病毒 HEF 基因组节段遗传演化分析
Fig. 1 Phylogenetic analysis of HEF segments
of influenza D virus
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5
丁型流感病毒之间的基因组重配加快了病毒的演
化与变异。新产生的变异毒株会突破原有的群体
免疫，对农业动物健康构成一定威胁。根据已有
研究结果，未发现丁型流感病毒中国毒株之间发
生了基因组重配［51］。但由于已报道的毒株数量
有限，目前还不能确定基因组重配事件是否真的
没有发生。尤其是当 D/Yama2019 谱系 的丁型流
感病毒也在中国牛群中流行时，这会大大增加其
与 D/OK 谱系的丁型流感病毒之间发生基因组重
配的概率。我们推测，这两个谱系之间的丁型流
感病毒频繁重组可能导致新的抗原变异株产生，
进而对动物健康构成潜在威胁。因此，加强对中
国丁型流感病毒的监测研究十分必要。
4 丁型流感病毒对我国畜牧养殖业的潜
在风险分析
4.1 丁型流感病毒在我国的总体流行情况还不明确
在我国，丁型流感病毒最早于 2014 年在山
东的养牛场被发现［43］。随后，研究人员在南方
一些省份（广东、江苏、安徽和福建）的牛群或
猪群中检测到该病毒［23, 50］。在最新的一项丁型
流感病毒流行病学调查研究中，研究人员通过屠
宰场采集了来自不同省份的牛鼻拭子样品，发现
来自甘肃、内蒙古、安徽、陕西、辽宁、宁夏、
河北、青海和广东的养牛场存在丁型流感病毒核
酸阳性的牛［51］。但以上数据不足以反映丁型流
感病毒在我国的总体流行情况。我国的养牛产业
（包括奶牛和肉牛）主要分布在四大区域：西北
产区（新疆、甘肃、陕西和宁夏）、西南产区（四
川、重庆、云南、贵州和广西）、东北产区（内
蒙古、吉林和黑龙江）和中原产区（山东、河南、
河北和安徽）。从目前仅有的流行病学调查数据
来看，四大产区可能都存在丁型流感病毒的分布
或传播。此外，伴随着不同产区之间、规模化养
牛场与小型牛场或散养场之间、产地与消费地之
间活牛的频繁交易及运输，丁型流感病毒很有可
能广泛流行于全国各地的牛群中。为了明确丁型
流感病毒在我国的总体流行情况，亟需更大规模
的流行病学调查研究。
4.2 丁型流感病毒对我国畜牧动物健康的影响依
然不清楚
已报道的牛丁型流感病毒监测研究表明，与
健康牛相比，患有呼吸道疾病（包括肺炎）的牛
更容易检测到丁型流感病毒［9, 11］。一项早期的丁
型流感病毒监测研究发现，在 55 头患有呼吸道
疾病综合征的犊牛中有 23.6% 出现了丁型流感病
毒感染，但在相同牛场内的 82 头健康犊牛中只
有 2.4% 出现了丁型流感病毒感染［18 ］。在我国牛
群中，无症状牛的丁型流感病毒阳性率普遍比患
病牛低［23, 41, 43］。值得注意的是，我国研究人员
在患病的牛和山羊的血清样本中检测到丁型流感
病毒基因组核酸，这意味着该病毒感染可能会诱
发病毒血症，并随着机体循环系统侵染其他组织
器官［23］。此外，该研究团队还在山羊直肠拭子
中检测到丁型流感病毒，表明丁型流感病毒可能
类似于甲型和乙型流感病毒可以在动物肠道内复
制［23］。为了明确丁型流感病毒的临床致病性，
有研究团队对犊牛鼻内接种了丁型流感病毒，与
对照相比，感染组犊牛均表现出呼吸道感染的相
关症状，但都较轻［35］。然而， 最新研究证实，
与丁型流感病毒或牛支原体单独感染相比，两者
合并感染会加重犊牛呼吸道症状［36-37］。总的来说，
丁型流感病毒单独感染会引起牛轻微的呼吸到症
状，但感染牛可能更易被其他病原侵袭，进而导
致严重的呼吸道症状。由于牛是丁型流感病毒的
自然宿主和主要传播源，因此应加强对牛群该病
毒的持续监测和风险评估。
丁型流感病毒分布于全球各地，可感染多种
动物物种［9］。我国和其他国家的研究人员都在猪
肺样本中检测到丁型流感病毒基因组核酸，表明
该病毒可以感染猪下呼吸道［23, 45, 50］。对野猪进行
该病毒感染实验，发现丁型流感病毒能够在下呼
吸道复制，并且在受感染的野猪中观察到丁型流
感病毒血症［24］。由于流感病毒很容易从猪传播
给人类和其他动物物种，因此需要进一步研究丁
型流感病毒在猪中的传播与发病机制。丁型流感
病毒还可以感染羊、马、骆驼和鹿［9, 26］，但是对
这些动物的致病风险依然不清楚。
5 展望
近年来，丁型流感病毒越来越受到病毒学领
域研究者的关注。首先，丁型流感病毒与甲型流
感病毒相似，具有比乙型和丙型流感病毒更宽泛
的宿主谱。这说明丁型流感病毒可能与甲型流感
病毒类似，具备快速传播和演化的能力。其次，
丁型流感病毒在四大类型流感病毒中表现出许多
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6
独特性，例如其拥有优越的耐热耐酸特性［10］、
可识别多样化的唾液酸分子作为其进入细胞的受
体［7-8］、特殊的基因组组成与配置模式［52］、不
一样的 M1 蛋白产生方式［6］等。此外，丁型流感
病毒表现出人畜共患的潜能。我国是畜牧业大国，
对有潜在风险的新发丁型流感病毒进行前瞻性研
究十分有必要。目前，我国相关研究人员对丁型
流感病毒的研究十分有限，只在 2014、2017、
2021、2022 年分别报道了丁型流感病毒的核酸阳
性病例。丁型流感病毒在我国的总体流行情况、
遗传多样性信息，以及对我国动物养殖业的影响
依然不明确，而且至今我国还未有分离出丁型流
感病毒的报道。这严重影响了相关科研人员对丁
型流感病毒的深入研究。要进一步了解丁型流感
病毒对养殖业的影响，研究人员需要对其进行较
大规模和较大范围的流行病学调查，包括我国丁
型流感病毒的总体阳性率、地域分布情况及与疾
病的关联性等。同时，通过对某一区域丁型流感
病毒的跟踪性调查，可以进一步了解其传播动力
学及其感染对养殖动物的影响；丁型流感病毒中
国毒株的分离鉴定及生物学特性研究（如病毒致
病性和跨宿主传播能力）也十分必要，这些研究
将为该病毒的防控提供指导。
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（责任编辑 崔建勋）
余界石，博士，广东省农业科
学院青年科技骨干，美国南达科他
州立大学微生物专业博士，现任职
于广东省农业科学院农业生物基
因研究中心微生物资源研究室。主
要从事丁型流感病毒、猪流行性
腹泻病毒等畜禽传染病病原生物
学的研究以及新型动物疫苗的研
发与应用等研究。在国际期刊发
表论文 17 篇，其中以第一作者在
《npj Vaccines》《Emerging Microbes & Infections》《Journal of
Virology》《Journal of Medical Virology》《mSphere》等学术期
刊上发表 SCI 论文 8 篇。主持国家自然科学基金青年项目、
广东省农业科学院科技人才引进专项、广东省农业科学院农
业生物基因研究中心创新基金重点项目各 1 项。
魏 文 康， 博 士， 研 究 员， 硕
士研究生导师，现任广东省农业科
学院农业生物基因研究中心主任，
兼任广东省畜禽疫病监测与防控
共性关键技术研发创新团队首席专
家、国家动物疫病预防控制中心规
模养殖场疫病净化专家。主要从事
动物疫病诊断与综合防控、微生物
资源等研究及科技管理工作。先后
承担国家、广东省重大课题专项、
省部市级各级课题 50 余项，参加国家“十三五”重点研发
项目 2 项。在《Emerging Infectious Diseases》（Top1 区）、
《Transboundary and Emerging Diseases》（Top1 区）等科技
期刊上发表论文 80 余篇，其中 SCI 论文 20 余篇，参与出版
著作 4 部。获得省部级成果奖励 13 项，其中中华农业科技
奖 1 项、广东省科技进步奖一等奖 1 项、二等奖 2 项，广东
省农业技术推广奖一等奖 2 项；获得授权专利、国家版权局
软件著作权 13 项、兽药证书 2 件，转化产品 20 余个已在生
产中广泛应用，获经济社会效益显著。2016 年被评为广东省
农业科学院“十二五”科技创新先进个人；2017 年获广东省
畜牧兽医学会首届广东省杰出畜牧兽医科技工作者称号。
第19页
收稿日期：2022-09-30
基金项目：国家自然科学基金（31500045）；广东省农业科学院高水平农科院建设 - 科技创新战略专项
（R2021YJ-YB1004，R2020PY-JX019）
作者简介：吴绍文（1992—），男，博士，副研究员，研究方向为真菌毒素合成调控机理和检测技术，E-mail：
wushaowen@agrogene.ac.cn
通信作者：晏石娟（1983—），女，博士，研究员，研究方向为作物品质控制与多组学技术，E-mail：shijuan@
agrogene.ac.cn
广东农业科学 2022，49（11）：9-21
Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2022.11.002
吴绍文，邹新路，胥锦涛，晏石娟 . 纳米抗体在真菌毒素检测中的应用［J］. 广东农业科学，2022，49（11）：9-21.
纳米抗体在真菌毒素检测中的应用
吴绍文，邹新路，胥锦涛，晏石娟
（广东省农业科学院农业生物基因研究中心 / 广东省农作物种质资源保存与
利用重点实验室，广东 广州 510640）
摘 要：真菌毒素是由真菌产生的次生代谢产物，给人类和禽畜健康造成严重危害，且其对农产品的污染
给全球经济造成重大损失。因此，控制毒素污染、毒素检测和降解的相关技术研发尤为迫切。目前农产品中真
菌毒素检测和大规模筛查的常用手段是以抗体为核心材料的免疫分析技术，相比于传统的单克隆 抗体和多克隆
抗体，新兴的纳米抗体具有体积小、易于体外表达、稳定性高等天然优势，因此其在真菌毒素检测技术研发中
广受重视。系统总结了黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等常见真菌
毒素检测相关纳米抗体的研发进展，重点综述抗真菌毒素纳米抗体和抗独特型纳米抗体在酶联免疫吸附测定、
生物发光酶联免疫分析、电化学免疫传感器和荧光共振能量转移免疫测定等不同免疫分析方法中的应用。通过
比较不同检测方法中纳米抗体的半数抑制率、检测限和线性范围等性能参数，分析基于不同类型纳米抗体的检
测技术的优缺点。探讨新抗体研发难度大、检测毒素种类少等亟待解决的关键问题，指出纳米抗体和真菌毒素
结合机制分析、理性设计、定向进化、结合多肽的筛选和设计等前沿技术在纳米抗体设计研究中的重要方向，
以期 为进一步开发基于纳米抗体的真菌毒素检测技术提供思路。
关键词：真菌毒素；纳米抗体；免疫分析；农产品；检测技术；IC50；检测限
中图分类号：S182 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2022）11-0009-13
Applications of Nanobodies in Mycotoxin Detection
WU Shaowen, ZOU Xinlu, XU Jintao, YAN Shijuan
（Agro-biological Gene Research Center , Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Guangdong Key Laboratory for
Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou 510640, China）
Abstract: Mycotoxins, as secondary metabolites produced by fungi, are a common threat to food safety and are
hazardous to human and livestock health. Mycotoxin contamination of agricultural products causes significant economic
losses worldwide. Therefore, it is particularly urgent to develop technologies for mycotoxins detection, degradation, and
controlling their contamination. Immunoassays, which use antibodies, are now commonly used for the detection and largescale screening of mycotoxins in agricultural products. As a new type of antibody, nanobodies have a small size, easy
expression in vitro, and high stability compared to traditional monoclonal and polyclonal antibodies. Therefore, they are
widely used in mycotoxin detection technologies. In this review, we summarize the development of nanobodies for common
mycotoxins (aflatoxin, ochratoxin, fumonisin, zearalenone, deoxynivalenol, etc.) detection, focus on the applications of antim ycotoxin and anti-idiotypic nanobodies in the context of several immunoassay methods, mainly compare the detecti on
第20页
10
真菌毒素是由曲霉属（Aspergillus）、青霉
属（Penicillium）、镰刀霉菌属（Fusarium）、麦
角菌属（Claviceps）等真菌产生的一类天然次生
代谢产物。这些产毒真菌能够污染含油量高的种
子（如花生、玉米）、谷物和坚果等，而这些农
作物及其加工而成的农产品是人类与畜禽的主要
食物来源，被食用真菌毒素污染的食物会导致癌
症、免疫缺陷等多种疾病，危害人类生命健康［1-2］。
目前，已经有数百种不同的真菌毒素被鉴定出来，
其中对人类健康和牲畜造成严重危害的真菌毒素
主要包括黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）、赭曲霉
毒素（Ochratoxin，OT）、伏马菌素 B（Fumonisin
B，FB）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）等。
产毒真菌的生长可能发生在农作物及农产品收获
前后、加工、运输和存储等过程中，而其产生的
大多数真菌毒素的化学性质稳定，可以在食物链
中残留［3］。在农产品贸易全球化和全球气候变暖
的背景下，农 产品存储和运输时间长、环境差异
大等因素促使真菌毒素污染概率增加，从而导致
国际贸易中的巨大经济损失。
由于真菌毒素是食品安全风险的常见因素，
许多国家和组织都制定了农产品中真菌毒素的限
量标准。例如，欧盟委员会规定，未加工谷物中
黄曲霉毒素 B1（AFB1）、赭曲霉毒素 A（OTA）、
FB、DON 和 ZEN 的 限 量 分 别 为 2、5、4 000、
1 250、100 μg/kg［4］。因此，真菌毒素高灵敏检
测方法的研发对于防控真菌毒素污染至关重要。
目前，常用的真菌毒素检测方法包括高效液相色
谱法、色谱 - 质谱联用法和免疫测定法［5-7］。其中，
免疫测定法基于抗原和抗体特异性结合的原理，
具有低成本、高通量和高灵敏度等特点，且操作
简便，对检测设备的要求较低，是真菌毒素大规
模筛查的常用检测手段。
抗体是免疫测定法的核心试剂，针对真菌毒
素的检测，人们已经研发了大量抗体，包括多克
隆抗体、单克隆抗体和重组抗体等多种类型［4,8］。
常规的单克隆抗体和多克隆抗体由两条重链和两
条轻链组成，其中重链包含 3 个恒定区（CH1、
CH2、CH3）和 1 个可变区（VH），而轻链只包
含 1 个恒定区（CL）和 1 个可变区（VL），重链
和轻链的互补性决定区（CDR）有助于形成抗 体
的抗原结合表位（图 1）。在骆驼科和软骨鱼的
血清中，存在一种 缺乏轻链和 CH1 结构域的重链
抗体（hcAb），其抗原结合位点由重链的可变区
（VHH）形成。这些独特的 VHH 结构域能够通
过重组蛋白表达的方式获得，是目前已知的抗原 -
抗体相互作用的最小单元，由于其大小在纳米尺
度，因此被称为纳米抗体（Nanobody，Nb）。与
抗原结合片段（Fab）、单链可变片段（scFv）等
重组抗体片段相比，纳米抗体具有相当或更强的
抗原结合能力、优异的物理化学稳定性和折叠能
力，且更容易进行遗传改造，这些特性使得纳米
抗体成为用于免疫测定的极佳抗体试剂［9-10］。目
前，已有许多与真菌毒素检测相关的纳米抗体被
报道，这些抗体被广泛应用于真菌毒素检测技术
的开发。本文围绕常见真菌毒素检测相关的纳米
抗体研发现状进行总结，并分析基于纳米抗体开
发的真菌毒素检测技术，以期为进一步开发高灵
敏、低成本、易应用的真菌毒素检测方法提供线
索和思路。
1 抗不同真菌毒素特异性纳米抗体的研发
用于真菌毒素检测的纳米抗体主要包括抗
真菌毒素特异性抗体和抗真菌毒素单克隆抗体的
独特型抗体两种类型（图 2），其中抗真菌毒素
特异性纳米抗体可直接结合毒素小分子或其偶联
的蛋白复合物，而抗独特型纳米抗体则通常结合
真菌毒素的单克隆抗体。在已知的真菌毒素中，
黄曲霉毒素和赭曲霉毒素由于毒性强、危害大、
parameters such as half inhibition rate, detection limit, and linear range. We further describe the advantages and disadvantages
of detection technologies based on anti-mycotoxin and anti-idiotypic nanobodies and discuss the key issues in the development
of mycotoxin detection methods, such as the difficulty of developing new nanobodies and the small number of detectable
mycotoxins when using current methods. Moreover, we point out the future directions of applying rational design, directed
evolution, and peptide screen and design methods to develop nanobody variants and propose potential avenues for the future
development of nanobody-based mycotoxin detection technologies.
Key words: mycotoxins; nanobody; immunoassay; agricultural products; detection technology; IC50; detection limit
第21页
11
分布广等特点，被欧盟委员会列为致癌物质，并
引起人们的广泛关注，进而在这两种真菌毒素的
抗特异性纳米抗体和检测技术的研发上做了大量
工作。
1.1 抗黄曲霉毒素纳米抗体
黄曲霉毒素主要由生长在土壤、腐烂植被、
干草和谷物中的一些霉菌（特别是黄 曲霉菌、寄
生曲霉菌等）产生。这些霉菌容易污染谷物（如
玉米、高粱、小麦和大米）、油料作物种子（如
大豆、花生、向日葵和棉花种子）、香料作物（如
辣椒、黑胡椒、芫荽、姜黄和生姜）、坚果（如
开心果、杏仁、胡桃和巴西坚果）等及其加工而
成的农产品（如陈皮）［1-2,11］。目前已有 20 余
种黄曲霉毒素被报道，主要包括 AFB1、AFB2、
AFG1 和 AFG2 等 4 种类型 ［12］。此外，在饲喂受
污染饲料后动物乳汁中也发现含有 AFM1。黄曲
霉毒素具有遗传毒性，可以造成 DNA 损伤，因此
食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈
正相关性，大剂量的黄曲霉毒素还可导致急性中
毒甚至危及生命。
早在 20 世纪 80 年代，人们就开始了抗黄曲
霉毒素单克隆抗体和多克隆抗体的研发，而抗黄
曲霉毒素的纳米抗体则在近 10 年才取得突破［12］。
2014 年，He 等［12］ 首次使用牛血清白蛋白 BSA
偶 联 的 AFB1（AFB1-BSA） 免 疫 羊 驼 构 建 的
VHH 噬菌体展示文库，筛选得到两种抗 AFB1 的
特异性纳米抗体 NB26 和 NB28。基于这两种纳米
抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）实验结果显示，
其检测 AFB1 的半数抑制率（IC50）分别为 0.754、
1.012 ng/mL，表现出很强的 AFB1 结合能力。不
同黄曲霉毒素的交叉反应实验结果显示，NB26 和
NB28 对 AFB2、AFG1、AFG2 的交叉反应性均低
于 10%，而对 AFM1 的交叉反应性分别为 1 0.75%
和 32.7%，表明这两种纳米抗体结合 AFB1 的特
异性均较强。进一步试验发现这两种纳米抗体的
热稳定性和抗有机溶剂的特性明显优于传统单克
隆抗体。在水稻、花生、玉米和饲料等实际样品
的检测中，基于 NB26 的 ELISA 实验检测的回收
率在 80%~115%。上述结果表明，这两种抗 AFB1
的纳米抗体具有优异的检测能力。曹冬梅等［13-14］
使用相似方法筛选得到抗 AFB1 的纳米抗体 G8，
其 结 合 AFB1 的 能 力 比 NB26 和 NB28 稍 弱， 在
图 1 单克隆抗体、单链可变片段、抗原结合片段、重链抗体和纳米抗体的结构示意图
Fig. 1 Schematic structures of monoclonal antibody, single-chain variable fragment (scFV), antigen-binding fragment (Fab),
heavy-chain-only antibody (hcAb) and nanobody (Nb)
CDRs
Fab
Fc
VL
CL
VH
CH1
CH2
CH3
scFV
单链可变片段 CDR3
VHH
单克隆抗体 Fab
抗原结合片段
hcAb
重链抗体
Nb
纳米抗体
CH2
CH3
抗真菌毒素特
异性纳米抗体
抗独特型
纳米抗体
单克隆抗体
真菌毒素 Nb
Nb
图 2 抗真菌毒素特异性纳米抗体和抗独特型
纳米抗体的结构示意图
Fig. 2 Schematic structures of anti-mycotoxin nanobody
and anti-idiotypic nanobody
纳米抗体
纳米抗体
第22页
12
最优的 ELISA 实验条件下测定结合的 IC50 值为
4.61 ng/mL。
除上述提到的 ELISA 方法外，抗黄曲霉毒
素特异性的纳米抗体还被广泛应用于不同免疫测
定方法的开发，主要包 括一步法酶联免疫吸附分
析 ALP-ELISA、生物发光酶联免疫分析 BLEIA
和磁性化学发光酶联免疫分析 MCLEIA 等。使用
纳米抗体 G8，曹冬梅等［13］开发了一种基于 G8-
碱性磷酸酶 ALP 融合蛋白的 ALP-ELISA。使用
G8- 纳米荧光素酶 NLUC 融合蛋白，Ren 等［15］
开 发 了 一 种 检 测 AFB1 的 BLEIA 方 法， 通 过 对
检测体系进行优化，使用这一方法检测 AFB1 的
IC50 值 为 0.41 ng/mL， 低 于 ALP-ELISA 和 传 统
ELISA 方法，检测灵敏度更高。使用生物素标记
的纳米抗体 NB26，Yan 等［16］开发了一种基于生
物素 - 链霉亲和素放大检测信号的 BA-ELISA 方
法，该方法检测 AFB1 的 IC50 值为 0.21 ng/mL，
检测灵敏度得到进一步提高。通过筛选与纳米
抗体 NB28 结合的多肽，以多肽模拟人工抗原，
Zhao 等［17］开发了一种基于磁珠快速定向竞争的
MB-dcELISA 方 法， 这 一 方 法 检 测 AFB1 的 IC50
值为 0.75 ng/mL。使用相似策略，Zou 等［18］建立
了一种直接非竞争性磁化学发光酶联免疫分析方
法 Nc-MCLEIA，将基于 NB28 免疫测定的 IC50 值
降低至 0.089 ng/mL，明显提高了 AFB1 检测的灵
敏度。更为重要的是，He 等［19］使用核磁共振和
分子对接的方法解析了纳米抗体 NB26 的三维结
构及其结合 AFB1 的可能机制，并根据 NB26 与
AFB1 的结合位点信息设计了 NB28 的突变体，用
于提高其对 AFB1 的结合能力，其中基于 NB28
的 A50V、S102D 两个突变体的免疫分析检测灵敏度
分别比野生型提高 2.3 倍和 3.3 倍。
近年来，纳米抗体与传感器联用的方法得
到广泛关注。例如，Pan 等［20］首次筛选了多个
抗 AFB1 的 纳 米 抗 体 NB30、NB33 和 NB70， 尽
管其未对这些纳米抗体结合 AFB1 的能力进行详
细评估，但使用 NB70 制备的电化学免疫传感器
（EC-immunosensor） 测 定 AFB1 的 检 测 限 低 至
0.0033 ng/mL。而 Liu 等［21］将纳米抗体 G8 和辣
根过氧化物酶 HRP 串联体修饰的杂交链反应信号
放大系统相结合，构建了一种新型电化学竞争免
疫传感器（ECC-immunosensor），其检测限低至
68 fg/mL，且具有良好的检测特异性和稳定性。这
些研究表明，将纳米抗体与其他材料相结合能够
进一步拓宽其在真菌毒素检测方面的应用。
1.2 抗赭曲霉毒素纳米抗体
赭曲霉毒素是由赭曲霉菌、碳曲霉菌等曲
霉菌以及一些青霉菌产生的真菌毒素，主要包括
OTA、OTB 和 OTC 等类型，其中 OTA 是最常见
的赭曲霉毒素，主要在谷物、葡萄酒、肉类、奶
类和面包等农产品的储藏过程中形成［22］。OTA
对人类健康具有多种毒性作用，包括明显的肾脏
毒性、免疫毒性、致畸性和致突变性等，会导致
肾癌等癌症，被国际癌症研究机构列为 2B 类致
癌物，其对胎儿发育和免疫系统也有影响［23］。
因此，许多国家均对农产品和食品中的 OTA 含
量 进 行 严 格 限 定， 如 我 国 食 品 安 全 国 家 标 准
（GB 2761-2017）中规定谷物、豆类和坚果中的
OTA 限量为 5 μg/kg，葡萄酒中的限量为 2 μg/kg。
抗 OTA 纳 米 抗 体 的 研 发 最 早 可 以 追 溯 到
2014 年，Liu 等［24］从免疫羊驼获得的 VHH 文库
中筛选得到 VHH15、VHH28、VHH32 和 VHH36
等 4 个抗 OTA 纳米抗体。其中，VHH28（也称
NB28）在噬菌体 ELISA 实验中测定的 IC50 值为
0.31 ng/mL，交叉反应实验显示其对 OTB 的交叉反
应率为 3.5%，表明 NB28 对 OTA 具有优异的选择
性。基于这一抗体开发的实时免疫 PCR（RT-IPCR）
在 2.5% 的 甲 醇 -PBS 溶 液 中 OTA 检 测 限 为
3.7 pg/mL、线性范围 IC20~80 为 0.01~1 000 pg/mL，
在玉米、小麦和大米等实际样品中检测的回收率
为 80%~126%，表明基于 NB28 开发的方法具有
优异的 OTA 检测能力。Sun 等［25］开发了一种使
用 NB28- 短肽 AviTag 融合蛋白检测 OTA 毒素的
BA-ELISA 方 法， 该 方 法 检 测 OTA 的 IC50 值 为
0.14 ng/mL、 检 测 限 为 0.028 ng/mL， 在 大 麦、
燕麦和大米等实际样品中的 OTA 检测限分别为
1.40、0.56、0.84 µg/kg。
为简化基于抗 OTA 纳米抗体的检测方法，
Wang 等［26］开发了基于 Nb28- 碱性磷酸酶融合
蛋白的 AP-ELISA，该方法检测 OTA 的 IC50 值为
0.46 ng/mL、 检 测 限 为 0.12 ng/mL、 线 性 范 围
为 0.20~1.26 ng/mL。Tang 等［27］ 开发了一种非
竞争性的荧光共振能量转移免疫测定法（FRET
immunoassay）， 实 现 了 对 OTA 和 OTB 两 种
毒 素 的 同 时 检 测， 这 一 方 法 对 OTA 和 OTB 的
检 测 限 分 别 为 0.06、0.12 ng/mL； 该 作 者 还 进
第23页
13
一 步 搭 建 了 基 于 FRET 的 免 疫 传 感 器（NbFRET immunosensor），这一传感器的检测限为
5 pg/mL［28］。Li 等［29］研发了一种基于纳米抗体
和 Au/CaCO3 的新型电化学发光免疫测定法（ECIimmunosensor），该方法的检测限为 5.7 pg/mL，
接近于 Nb-FRET immunosensor 的检测限，实现了
对 OTA 的超灵敏检测。
2021 年以来，研究者们利用蛋白质工程开发
了一系列更加简便的 OTA 检测方法。例如，Su 等［30］
基于 Nb28-SGFP、SGFP-Nb28 两种不同荧光蛋白 -
纳米抗体融合蛋白，构建了 OTA 检测的荧光纳米
传感器（FN-Nanosens），FN-Nanosens 的检测限
为 5 pg/mL、线性范围为 5~5 000 pg/mL。而 Xie 等［31］
开发了一种基于纳米抗体 /NanoBiT 系统的生物发
光免疫传感器（NBL-Immunosens），这一传感器
检测 OTA 的 IC50 值为 0.31 ng/mL、检测限为 0.01
ng/mL、线性范围为 0.04~2.23 ng/mL。以上两种
传感器均可对 OTA 完成快速高灵敏检测。此外，
Wang 等［32］使用定向进化和饱和突变的方法获得
NB28 的双位点突变体 G53Q & S102D，不同温度
的测试实验显示 G53Q & S102D 突变体具有良好
的耐热性，而使用野生型和这一突变体检测 OTA
的 IC50 值分别为 0.41、0.29 ng/mL，表明突变体
的检测灵敏度相比野生型约提高 1.4 倍。基于
NB28 突变体 - 碱性磷酸酶融合蛋白和 MnO2 纳米
片，Zhang 等［33］建立了酶级联放大免疫测定法
（ECAIA）用于检测咖啡中的 OTA，这一方法检
测的 IC50 值为 7.65 ng/mL、检测限为 3.38 ng/mL，
实现了对咖啡中 OTA 的高灵敏检测。综合来看，
基于抗 OTA 纳米抗体 NB28 开发了多种快速、简
便且灵敏度高的检测方法，借鉴这些思路开发其
他真菌毒素的快速高灵敏检测方法是未来值得开
展的研究。
1.3 其他真菌毒素的特异性纳米抗体
目前，抗细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid，
TeA）、异细交链孢菌酮酸（Iso-tenuazonic acid，
ITeA）、DON 和 15- 乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇
（15-Acetyldeoxynivalenol，15-AcDON） 等 真 菌
毒素的特异性纳米抗体也有报道。细交链孢菌能
够污染谷物和水果等农产品并产生 TeA，TeA 是
一种独特的四酸衍生物，具有强效的真核蛋白质
合成抑制活性，可阻止核糖体释放新合成的蛋白
质，也是细交链孢菌产生的毒性最强的一种毒素。
Wang 等［34］使用噬菌体展示文库筛选得到一种抗
TeA 的特异性纳米抗体 Nb-3F9，并基于这一抗体
及其与 NLUC 的融合蛋白分别开发了 ELISA、化
学发光酶联免疫分析（CLEIA）和 BLEIA 等 TeA
检测技术，这些方法中 ELISA 检测的 IC50 值为
54.8 ng/mL，CLEIA 和 BLEIA 检测的 IC50 值分别
为 8.6 ng/mL 和 9.3 ng/mL，灵敏度比 ELISA 提高
近 6 倍。ITeA 是 TeA 的同分异构体，化学性质和
毒性有所不同。Wang 等［35］筛选得到一种抗 ITeA
的 特 异 性 纳 米 抗 体 B3G3， 基 于 这 一 抗 体 建 立
的 ELISA 方法检测 ITeA 的 IC50 值为 1.3 ng/mL，
交叉反应实验结果表明其检测 TeA 的 IC50 值为
19.8 ng/mL、交叉反应率为 6.6%，显示出较好的
ITeA 结合特异性。
DON 及其衍生物 3- 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯
醇（3-AcDON） 和 15-AcDON 是 谷 物 中 常 见 的
真菌毒素，主要由禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌在
侵染小麦时产生［36］。动物和人类摄入含有 DON
的食物会导致恶心、胃肠不适、呕吐和腹泻等
症状，乙酰化的 DON 由于在肠道中的吸收速度
更 快， 故 毒 性 比 DON 更 强［37］。Doyle 等［38］ 克
隆、表达并表征了一种抗 15-AcDON 的特异性
纳米抗体 NAT-267，但这一抗体结合 15-AcDON
的能力较弱，荧光偏振分析实验（Fluorescence
polarization，FP） 测 定 其 结 合 的 解 离 常 数 为
1.24 μmol/L（即 419.6 ng/mL）。进 一步研究发现，
将纳米抗体 NAT-267 在酵母细胞内表达能够明显
降低 15-AcDON 对细胞的毒性［39］。随后，Tu 等［40］
使用噬菌体展示文库筛选得到抗 DON 的特异性纳
米抗体 B10、C8 和 C15，噬菌体 ELISA 实验发现
B10 结合 DON 的能力更强。上述研发的特异性
纳米抗体在真菌毒素的检测方面表现出良好的性
能和应用前景（表 1），因此，进一步研发其他
常见真菌毒素的特异性纳米抗体并提高其应用性
能，是未来值得开展的重要工作。
2 抗独特型纳米抗体在真菌毒素检测中
的应用
抗独特型纳米抗体是一类可以与抗原竞争结
合其一级抗体可变区的第二抗体，能够替代小分
子化合物和蛋白偶联物用于免 疫测定［41-42］。因
此，相比于抗真菌毒素的特异性纳米抗体，抗独
特型纳米抗体应用于真菌毒素检测时有一个明显
第24页
14
优势，即可代替真菌毒素和蛋白偶联物作为抗原，
从而降低检测的潜在风险，更加绿色环保［41］。
抗独特型纳米抗体已经被广泛应用于常见真菌毒
素的检测。
2.1 应用于黄曲霉毒素检测的抗独特型纳米抗体
使用抗黄曲霉毒素单克隆抗体 1C11 免疫羊
驼的噬菌体文库，Wang 等［43］ 筛选得到 3 种抗
独特型纳米抗体 VHH2-5、VHH2-12 和 VHH2-
29，并将其作为包被抗原应用于黄曲霉毒素的免
疫分析。ELISA 实验结果表明，单克隆抗体 1C11
和 纳 米 抗 体 VHH2-5 的 组 合 能 够 识 别 AFB1、
AFB2、AFG1、AFG2 和 AFM1 等 5 种 黄 曲 霉 毒
素，其中识别 AFB1 的灵敏度最高，检测的 IC50
值为 0.16 ng/mL。基于含有 VHH2-5 的 M13 噬菌
体及其编码 DNA，Lei 等［44］建立了一种用于检
测农产品中黄曲霉毒素的 RT-IPCR 方法，这一
方法的检测限为 0.02 ng/mL，检测灵敏度优于传
统的 ELISA 方法。随后，Wang 等［45］ 通过建立
VHH 2-5 与 AFB1 之间的定量转换方程，研发了
一种定量测定农产品中 AFB1 含量的方法（toxinfree ELISA），这一方法的灵敏度进一步提升，
其检测限为 0.015 ng/mL。此外，Lei 等［46］ 基于
VHH2-5 - 噬菌体体系研发了一种免疫环介导等
温扩增（iLAMP）检测方法，能够完成对实际样
本中黄曲霉毒素的现场检测。
Tang 等［47］使用抗 AFM1 的单克隆抗体 2C9
筛 选 得 到 两 种 独 特 型 纳 米 抗 体 VHH4-1-1 和
VHH2-3-1，ELIS A 方法检测得到这些纳米抗体
结合 AFM1 和 2C9 的 IC50 值分别为 8.54 ng/mL 和
3.33 ng/mL；进一步使用纳米抗体 VHH4-1-1 功
能化的丝网印刷碳电极，研发得到一种无毒电化
学免疫传感器（Toxin-free EC-immunosensor），
表 1 基于抗特异性纳米抗体的真菌毒素检测方法和性能
Table 1 Performance of methods for mycotoxins detection using anti-mycotoxin nanobodies
真菌毒素
Mycotoxins
纳米抗体
Nanobody
检测方法
Assay format
IC50
(ng/mL)
检出限
Detection limit (ng/mL)
线性范围
Linear range (ng/mL)
参考文献
Reference
AFB1 NB26 ELISA 0.754 / 0.117~5.676 ［12］
BA-ELISA 0.21 0.04 0.08~0.65 ［16］
NB28 ELISA 1.012 / 0.171~6.431 ［12］
MB-dcELISA 0.75 0.13 0.24~2.21 ［17］
Nc-MCLEIA 0.089 0.006 0.019~0.407 ［18］
G8 ELISA 4.61 / 0.95~42.45 ［14］
AP-ELISA 19.8 2.6 4.3~92.0 ［13］
BLEIA 0.41 / 0.10~1.64 ［15］
NB28 A50V ELISA 1.70 / / ［19］
NB28 S102D ELISA 1.18 / / ［19］
NB70 EC-immunosensor / 3.3×10-3 0.1~100.0 ［20］
ECC-immunosensor / 6.8×10-5 0.5~10.0 ［21］
OTA NB28 ELISA 0.31 / / ［24］
RT-IPCR 3.7×10-3 1×10~5~1 ［24］
BA-ELISA 0.14 0.028 0.051~0.70 ［25］
AP-ELISA 0.46 0.12 0.20~1.26
FRET immunoassay / 0.06 / ［27］
Nb-FRET immunosensor / 5×10-3 / ［28］
ECI-immunosensor / 5.7×10-3 5.7×10~3~100 ［29］
FN-Nanosens / 5×10-3 5×10~3~5 ［30］
NBL-Immunosens 0.31 0.01 0.04~2.23 ［31］
ECAIA 7.65 3.38 4.55~12.85 ［33］
TeA Nb-3F9 ELISA 54.8 / / ［34］
CLEIA 8.6 0.3 / ［34］
BLEIA 9.3 1.1 / ［34］
ITeA B3G3 ELISA 1.3 0.09 / ［35］
15-AcDON NAT-267 FP 419.5 / / ［38］
注：“/”表示文献中未报道。
Note: “/” indicates no data in the reference.
第25页
15
用于检测牛奶中的 AFM1，结果表明这一传感器
检测 AFM1 的线性范围为 0.25~5.00 ng/mL、检测
限为 0.09 ng/mL，性能优异。
2.2 应用于赭曲霉毒素检测的抗独特型纳米抗体
使用抗 OTA 的单克隆抗体和天然纳米抗体文
库，Ji 等［48］筛选得到抗独特型纳米抗体 P28，基
于 P28 的噬菌体 ELISA 实验显示其检测 OTA 的
IC50 值为 0.3 ng/mL。使用抗 OTA 的单克隆抗体
1H2，Zhang 等［49］筛选得到其抗独特型纳米抗体
VHH2-24，ELISA 实验显示 VHH2-24 能够特异性
地识别 1H2，而不能结合抗 AFB1、DON 和 ZEN
的单克隆抗体，表明其具有良好的抗体结合特
异性，基于 VHH2-24 的 ELISA 实验显示其检测
OTA 的线性范围为 0.003~0.1673 ng/mL、检测限为
0.001 ng/mL。使用相同的单克隆抗体 1H2， Zhang
等［50］筛选得到两种新的抗独特型纳米抗体 NCA1
和 NCA2， 序 列 分 析 发 现，NCA1 和 NCA2 两 种
纳米抗体在 CDR 区域有 6 个氨基酸不同，它们
检测 OTA 的 IC50 值分别为 0.052、0.015 ng/mL，
表明 NCA1 的检测灵敏度比 NCA2 低。以上结果表
明抗独特型纳米抗体 CDR 区域的氨基酸变化能够
改变其结合亲和力从而提高免疫分析的灵敏度。
随后，Zhang 等［50］使用纳米抗体 NCA2 建立了一
种环境友好的 ELISA 方法，用于快速检测谷物中
的 OTA 含量，优化后的 IC50 值为 0.017 ng/mL、
检 测 限 为 0.003 ng/mL， 这 一 方 法 在 玉 米、 大
米和小麦等实际样品上的平均检测回收率在
80.0%~114.8%，具有良好的应用性。
2.3 应用于伏马菌素检测的抗独特型纳米抗体
伏马菌素是一类由镰刀菌属和赤霉菌属侵染
收获前或存储期间的农产品而产生的真菌毒素，
目前已鉴定出 10 多种结构，其中伏马菌素 B1
（FB1）的含量最高、毒性最强，能够引起癌症
等多种疾病，并被国际组织列为 2B 类致癌物［41］。
Shu 等［41,52］首先从抗 FB1 单克隆抗体的噬菌体
展示文库中筛选得到其抗独特型纳米抗体 B26，
ELISA 实 验 测 定 得 到 其 检 测 FB1 的 IC50 值 为
1.07 ng/mL，线性范围为 0.27~5.92 ng/mL，其灵
敏度约为基于 FB1-BSA 偶联物的 ELISA 方法的
20 倍（IC50 值为 21.14 ng/mL）。进一步交叉反应
实验结果显示，基于纳米抗体 B26 的 ELISA 实验
检测伏马菌素 B2（FB2）的 IC50 值为 27.67 ng/mL、
交叉反应率为 4.93%，表明 B26 具有很好的 FB1
结合特异性。使用玉米、大米和饲料等实际样本
检测的结果显示，基于 B26 的 ELISA 方法的检测
回收率为 71.90%~112.15%，表明其适用于实际样
品的检测。基于 B26- 碱性磷酸酶融合蛋白，Shu
等［52］进一步开发了用于 FB1 检测的 AP-ELISA，
这一方法检测的 IC50 值为 0.89 ng/mL、线性范围
为 0.29~2.68 ng/mL，灵敏度略高于传统 ELISA。
2.4 应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测的抗独特型
纳米抗体
为建立基于纳米抗体的环境友好型 DON 免
疫 分 析 方 法，Qiu 等［53］ 使 用 抗 DON 单 克 隆 抗
体和天然噬菌体展示文库筛选得到两种抗独特
型 纳 米 抗 体 N-28 和 N-31，ELISA 实 验 结 果 表
明这两种抗体检测 DON 的 IC50 值分别为 8.77、
19.97 ng/mL， 检 测 灵 敏 度 分 别 约 为 传 统 基 于
DON-BSA 的 ELISA 方 法（IC50 值 为 163.69
ng/mL）的 18、8 倍；随后，作者又使用饱和诱变
技术进行 N-28 的突变体筛选，并证实 T102Y、
V103L 和 Y105F 等位点的突变能够进一步提高
N-28 检测 DON 的灵敏度［54］。
2.5 应用于玉米赤霉烯酮检测的抗独特型纳米
抗体
玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由禾谷镰刀菌、
木贼镰刀菌和黄色镰刀菌等镰刀菌属合成的非甾
体雌激素类真菌毒素，具有致畸性、遗传毒性、
致癌性、肝毒性和免疫抑制等多种危害作用，也
是谷物中常见的风险因素之一。为建立基于无毒
替代试剂的 ZEN 免疫分析方法，Wang 等［55］使
用抗 ZEN 单克隆抗体和 VHH 噬菌体展示文库筛
选得到纳米抗体 Z1，这一纳米抗体具有很好的抗
ZEN 单克隆抗体结合能力；该作者利用纳米抗体
Z1 建立了间接竞争噬菌体 ELISA 方法，结果显示
该方法检测 ZEN 的 IC50 值为 0.25 ng/mL、线性范
围为 0.11~0.55 ng/mL，相比于传统的基于 ZENBSA 的方法灵敏度提高 26 倍。而使用这一纳米抗
体建立的噬菌体展示介导的 IPCR 方法检测限更
低（6.5 pg/mL）、线性范围为 0.01~100 ng/mL，
比噬菌体 ELISA 方法的灵敏度更高、检测范围更
宽［55］。此外，Tang 等［56］使用两种抗独特型纳
米抗体建立了一种能够同时检测 AFB1 和 ZEN 的
时间分辨荧光免疫层析法，这一方法的最大特点
是实现了两种真菌毒素的同时检测，其 IC50 值分
别为 0.46、0.86 ng/mL。随后，Ren 等［57］又开发
第26页
16
了一种双功能噬菌体展示 IPCR 技术用于同时检
测 AFB1 和 ZEN，这一方法检测 AFB1 和 ZEN 的
IC50 值分别为 0.43、2.12 ng/mL，检测限为 0.03、
0.15 ng/mL；试验表明这一方法可以同时检测小
麦、大米、玉米和饲料样品中的 AFB1 和 ZEN，
拓宽了抗独特型纳米抗体在真菌毒素检测中的应
用范围。
2.6 应用于其他真菌毒素检测的抗独特型纳米
抗体
除上述常见的真菌毒素外，还有一些关于
TeA 和橘霉素（Citrinin ，CTN）的抗独特型纳米
抗体的研究。例如，Wang 等［58］使用抗 TeA 的单
克隆抗体 3F10 和噬菌体展示文库筛选得到用于
TeA 检测的独特型纳米抗体 1B、2C 和 2D，ELISA
实 验 测 定 其 检 测 TeA 的 IC50 值 分 别 为 45.8、
129.3、24.5 ng/mL，表明纳米抗体 2D 的检测灵
敏度最高。Wang 等［58］进一步使用 2D-NLUC 和
2D- 铁蛋白 -NLUC 建立了 TeA 检测的 BLEIA 方
法，其中铁蛋白能够形成 24 个分子的聚合体，
因此被认为能够进一步增强检测灵敏度；结果
显示，基于 2D-NLUC 的 BLEIA 实验检测的 IC50
值 为 26.6 ng/mL， 而 基 于 2D- 铁 蛋 白 -NLUC
的 BLEIA 实 验 检 测 的 IC50 值 为 10.3 ng/mL，
灵敏度相比于 2D-NLUC 提高约 2.5 倍。
CTN 是一种由曲霉属、青霉属和红曲属等多
种菌种产生的真菌毒素，主要存在于谷物、豆类、
水果、蔬菜、草药和香料以及其他植物中，且通
常与其他真菌毒素尤其赭曲霉毒素共存［59］。已
有研究表明 CTN 具有肾毒性，且能够通过氧化应
激参与诱导细胞凋亡［60］。为建立基于抗独特型
纳米抗体的 CTN 检测技术，Xu 等［61］使用抗 CTN
的单克隆抗体和天然噬菌体 VHH 展示文库筛选
得到纳米抗体 X27，基于这一抗体建立的 ELISA
方法检测 CTN 的 IC50 值为 44.6 ng/mL、线性范围
表 2 基于抗独特型纳米抗体的真菌毒素检测方法和性能
Table 2 Performance of methods for mycotoxins detection using anti-idiotypic nanobodies
真菌毒素
Mycotoxins
纳米抗体
Nanobody
检测方法
Assay format
IC50
(ng/mL)
检出限
Detection limit (ng/mL)
线性范围
Linear range (ng/mL)
参考文献
Reference
AFB1 VHH2-5 ELISA 0.16 / / ［43］
RT-IPCR / 0.02 / ［44］
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AFM1 VHH4-1-1 ELISA 8.54 / / ［47］
toxin-free EC-immunosensor / 0.09 0.25~5.0 ［47］
VHH2-3-1 ELISA 3.33 / / ［47］
OTA P28 ELISA 0.3 4.17×10-3 / ［48］
VHH2-24 ELISA / 0.001 0.003~0.1673 ［49］
NAC1 ELISA 0.052 / / ［50］
NAC2 ELISA 0.015 / / ［50］
eco-friendly ELISA 0.017 0.003 0.01~0.51 ［50］
FB1 B26 ELISA 1.07 0.15 0.27~5.92 ［41］
AP-ELISA 0.89 0.12 0.29~2.68 ［52］
DON N-28 ELISA 8.77 1.16 2.18~62.25 ［53］
N-31 ELISA 19.97 2.39 4.98~107.42 ［53］
ZEN Z1 ELISA 0.25 0.08 0.11~0.55 ［55］
IPCR / 6.5×10-3 0.01~100 ［55］
TeA 1B ELISA 45.8 / / ［58］
2C ELISA 129.3 / / ［58］
2D ELISA 24.5 / / ［58］
BLEIA 26.6 / / ［58］
Nluc(F)- BLEIA 10.3 0.7 / ［58］
CTN X27 ELISA 44.6 / 5.0~300 ［61］
IPCR 9.86 / 0.1~1000 ［63］
/ ELISA 10.9 / 2.5~100 ［63］
注：“/”表示文献中未报道。
Note: “/” indicates no data in the reference
第27页
17
为 5.0~300.0 ng/mL，其灵敏度是传统 ELISA 方法
的 2 倍。Xu 等［62］还研发了另一种用于 CTN 检测
的抗独特型纳米抗体，其 ELISA 检测的 IC50 值为
10.9 ng/mL，灵敏度进一步提高。Huang 等［63］使
用纳米抗体 X27 建立了 CTN 检测的 IPCR 方法，
其 IC50 值为 9.86 ng/mL、线性范围为 0.1~1 000 ng/
mL，该方法检测灵敏度提高、且检测范围更宽。
目前已开发出多种常见真菌毒素的抗独特型纳米
抗体，这些抗体在多种方法中表现出很好的检测
性能（表 2），但是基于抗独特型纳米抗体的新
的检测方法开发相对较少，是未来值得开展的研
究工作。
3 总结与展望
随着我国社会经济的不断发展，人们的食品
消费观念正在快速转变，由“吃得饱”向“吃得好”、
“吃得营养”、“吃得健康”转变，而要满足人
们“吃得健康”的需求则必须加强食品安全监管。
根据联合国粮农组织统计，全球每年约有 25% 的
农产品受到真菌毒素污染。此外，很多中药如柏
子仁、槟榔、地龙等也容易受真菌毒素的污染。
中药在我国人民群众生命健康和社会经济发展中
发挥着特殊作用，近年来国家也加强了对中药中
真菌毒素限量的监管，如《中国药典（2015 版）》
明确了其收载的 19 味中药中黄曲霉毒素含量的限
值，并在《中国药典（2020 版）》中将限制的中
药品种提高到 24 味。我国对真菌毒素污染的监
管必将进一步加强，因此迫切需要建立快速、灵
敏、成本低且适用于多种毒素同时大规模检测的
方法。
近年来，在噬菌体展示技术和蛋白质工程
等方法的推动下，多种常见真菌毒素相关的纳米
抗体和检测方法被成功研发。就特定的真菌毒素
而言，黄曲霉毒素和赭曲霉毒素有多种抗特异性
和抗独特型纳米抗体及相关的检测方法被开发出
来。伏马菌素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌
烯醇的抗独特型纳米抗体研究较多，但其抗特异
性纳米抗体的研究很少。抗独特型纳米抗体相比
于抗特异性纳米抗体的优势在于其能够替代真菌
毒素 - 蛋白偶联物作为抗原的特性，使得检测体
系更环保，但是需要使用单克隆抗体进行检测，
考虑到单克隆抗体通常无法体外表达，在检测成
本上未必具有优势。目前，还尚未见到基于这两
种纳米抗体的检测技术在稳定性、应用性和检测
成本等方面的详细比较，值得未来进一步探索。
从检测方法来看，相比于传统的 ELISA 方
法，ALP-ELISA、BLEIA、荧光和免疫传感器以
及实时免疫 PCR 等方法的灵敏度均有提升，检测
参数也均能满足实际检测的需求。其中，纳米抗
体 -ALP、纳米抗体 -NLUC 融合蛋白均能通过体
外表达体系获得，且检测所需的设备简单，适合
应用于大规模筛查。其中，NLUC 能够在催化底
物存在而不需要其他辅助因子的条件下发出高强
度荧光，反应条件简单，但催化底物的成本偏高。
因此，通过蛋白质工程、小分子设计等方法改造
NLUC 及其催化底物，从而研发出一套成本更低、
灵敏度更高的生物发光体系，有望进一步提升其
在一步法酶联免疫分析技术中的应用性。
从检测的真菌毒素种类来看，目前免疫分析
测定大多数针对单个真菌毒素，少数方法能够实
现两种真菌毒素的同时检测。然而，现实农业生
产过程中农产品的污染往往是多种真菌毒素同时
存在，建立一种能够实现多种真菌毒素同时检测
的免疫分析技术无疑具有重要意义。另外，建立
多种真菌毒素同时检测的免疫分析技术依赖于高
性能的纳米抗体，而许多常见的真菌毒素仍然没
有抗特异性纳米抗体的研究报道，已有报道的纳
米抗体也还存在一些应用的缺陷。并且真菌毒素
均为小分子化合物，从噬菌体展示文库中筛选理
想的纳米抗体具有较高的难度。因此，利用抗体
研发的新技术，进一步开发具有高亲和力和稳定
性的纳米抗体极具有挑战性，也是拓展纳米抗体
在真菌毒素检测中应用能力的重要方向。
近年来，抗体和小分子结合机制分析技术、
抗体结合多肽的筛选和设计技术、蛋白质理性设
计、定向进化、饱和突变和虚拟筛选等前沿技术
迅猛发展，为真菌毒素相关纳米抗体的研发和改
造提供了全新思路。已有研究表明，通过突变体
筛选和设计的方式能够提高纳米抗体的真菌毒素
结合能力和稳定性，因此通过实验和计算方法表
征真菌毒素与抗体结合的分子机制、解析参与结
合的关键氨基酸和相互作用力，从而得到抗体与
真菌毒素的结合界面信息，对抗体的设计和改造
具有重要作用。基于抗体和真菌毒素结合界面的
信息，一方面，可以指导抗体结合多肽的实验和
计算筛选，根据结合界面的氨基酸性质，设计和
第28页
18
优化多肽文库，以得到高亲和力和稳定性的多肽，
并进一步开发基于抗体 - 模拟肽的真菌毒素检测
方法；另一方面，可以指导纳米抗体的定向进化
和饱和突变文库的设计，针对结合界面的氨基酸
进行突变，能够更高效地筛选高亲和力的纳米抗
体突变体，针对结合界面以外的不稳定氨 基酸进
行突变，能够进一步筛选高稳定性的突变体甚至
研发全新的抗真菌毒素纳米抗体，这些研究是未
来非常值得尝试的方向。
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（责任编辑 张辉玲）
吴绍文，博士，副研究员，硕
士研究生导师。复旦大学化学生物
学博士，美国宾夕法尼亚大学分子
生物物理学博士后，现任中国农业
科技华南创新中心公共实验室党支
部书记。长期从事蛋白质动态变化
和功能关系、作物质量安全控制与
营养品质评价研究及计算代谢组学
技术研发。主持或参与国家重点研
发计划、国家自然科学基金面上项目、广东省“海外名师”、
广州市基础与应用基础研究项目等 10 余项。研发了多项研
究蛋白质与蛋白质及底物小分子相互作用机制的方法和策
略，并将这些方法和策略应用于无序蛋白、ABC 转运体底物
结合蛋白等多种蛋白的功能机制研究中，揭示了多种类型的
蛋白质构象运动和功能关系的详细信息，为靶向蛋白质的分
子设计、基于蛋白构象变化的代谢工程提供了重要理论基础
和新的思路。以第一作者（含并列）在《Angewandte Chemie
International Edition》《Chemical Science》、《Communications
Biology》等领域内重要期刊发表高水平论文 8 篇；参编专著
1 部；获授权国家发明专利 2 项。
晏石娟，博士，研究员，硕士
研究生导师。现任广东省农业科学
院农业生物基因研究中心副主任，
作物品质控制与多组学技术创新团
队的负责人。德国马普植物分子生
理研究所和康奈尔大学生物技术研
究所访问学者。先后获广东省特支
计划科技创新青年拔尖人才、广东
省农科院“青年研究员”“金颖之
星”等人才称号。华中农业大学、兰州大学兼职硕士研究生
导师。主要从事代谢组与蛋白质组学技术研发、作物品质性
状形成机理与调控研究。主持承担国家自然科学基金，省重
点研发计划等科研项目 18 项；研究成果发表学术论文共 84
篇，其中以第一或通讯（含并列）身份在《Plant Cell》《Trends
in Plant Science》《Green Chemistry》等领域内重要期刊发表
论文 41 篇；获授权专利 12 件。参编著作 1 部。
第32页
收稿日期：2022-10-08
基金项目：广东省科技专项资金（“大专项 + 任务清单”）项目（江科〔2020〕182 号，江科〔2021〕183 号）；
肇庆市科技计划项目（2021N003）
作者简介：邓俊劲（1992—），男，博士，助理研究员，研究方向为功能微生物， E-mail：489697222@qq.com
通信作者：陈庄（1963—），男，博士，研究员，研究方向为微生物资源，E-mail：chenzh1963@vip.sina.com
广东农业科学 2022，49（11）：22-32
Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2022.11.003
邓俊劲，张艳彬，张健玲，刘书欣，俞婷，牛志凯，王志林，陈庄 . 功能微生物在生态健康养殖中的应用研究进展［J］.
广东农业科学，2022，49（11）：22-32.
功能微生物在生态健康养殖中的应用研究进展
邓俊劲 1
，张艳彬 1
，张健玲 2
，刘书欣 1
，俞 婷 1
，牛志凯 1
，王志林 1
，陈 庄 1
（1. 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 / 广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，
广东 广州 510640；2. 江门海关技术中心，广东 江门 529085）
摘 要：养殖业中抗生素滥用和环境污染问题已引起国家和行业的广泛关注。功能微生物可以有效替代养
殖用化学物质，取代激素和抗生素，提高动物综合生长性能，在生态健康养殖中发挥关键作用。为实现我国养
殖业的可持续发展，在动物养殖中应用功能微生物实现生态健康养殖已成为一条重要发展路径。功能微生物的
作用贯穿整个养殖前端、过程和末端：利用功能微生物处理饲料原料，可以有效去除抗营养因子，提高饲料转
化利用率和营养价值；以养殖功能微生物饲喂动物，可以调节肠道微生物群平衡，维持肠道稳态，调节机体免疫；
应用于养殖环境中，可以控制臭气排放和环境病原 , 在养殖废弃物的无害化处理和资源化利用方面也发挥重要作
用。结合有关养殖功能微生物的研究成果，对功能微生物在动物养殖中的应用研究进展进行综述，包括它们在
生物饲料加工、动物肠道健康、养殖环境控制和废弃物处理中的应用及相关作用机制，以期为功能微生物在动
物养殖中的进一步应用与推广提供参考。
关键词：禁抗；功能微生物；动物健康；生物饲料加工；废弃物处理
中图分类号：S8-1 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2022）11-0022-11
Progress in Application of Functional Microorganisms
in Ecological and Healthy Breeding
DENG Junjin1
, ZHANG Yanbin1
, ZHANG Jianling2
, LIU Shuxin1
, YU Ting1
,
NIU Zhikai1
, WANG Zhilin1
, CHEN Zhuang1
（1. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences /
Guangdong Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou 510640, China;
2. Jiangmen Customs Technical Center, Jiangmen 529085, China）
Abstract: Antibiotic abuse and environmental pollution caused by animal husbandry has aroused extensive concern
from the government and the industry. As a kind of efficient alternative to agricultural chemicals like hormones and
antibiotics, functional microorganisms can enhance the comprehensive growth performance of animals and thus play a
crucial role in ecological and healthy breeding. The use of functional microorganisms in animal breeding for eco-agriculture
has been a key development pathway for achieving the objective of sustainable development. Functional microorganisms
are used at the beginning, middle, and end of the entire breeding process. Functional microorganisms can effectively
eliminate anti-nutritional factors from feed sources, increasing their utilization rate and nutritional value. Animals fed with
functional microorganisms not only have balanced gut microbiota and intestinal homeostasis, but their immune system is
第33页
23
功能微生物是指具有特定功能和生物活性
的微生物，其独特、多样而灵活的作用方式是微
生物在长期与外界环境和其他生物之间的相互作
用中不断进化而形成的，在生态系统中发挥不可
替代的作用。近年来随着分子生物学、蛋白组学
和微量分析技术的快速发展，越来越多的新型微
生物及其新颖的代谢方式不断被发现和阐明，各
种具有独特功能的微生物也被不断挖掘和应用。
随着最近关于对动物体内最庞大、最复杂的微生
态系统—肠道微生物认识的加深，功能微生物在
动物养殖中的应用研究也进入了新的快速发展阶
段。多种功能微生物如芽孢杆菌、乳酸菌和双歧
杆菌等已被广泛开发研制成动物养殖用微生态制
剂，用于促进动物生长、提高饲料利用率和动物
疫病防治等。
自 20 世纪 40 年代以来，抗生素作为促生长
剂被广泛应用于动物养殖中。随着畜牧养殖业的
规模化集约化发展，饲用抗生素的使用量也越来
越大。饲用抗生素滥用导致细菌耐药性增强和药
物残留，相关食品安全问题已经引起人们的重视。
自 2006 年起，欧盟、美国和中国相继出台相关政
策禁止在动物养殖中使用抗生素作为促生长剂。
在禁抗限抗的背景趋势下，探求新型替抗产品成
为行业研究的热点，其中，功能微生物及其引领
的生态健康养殖以绿色、安全、环保等优势，已
成为现今养殖业的主流发展方向。在畜牧养殖前
端，功能微生物可以发酵饲料原料，将大分子物
质分解为小分子物质，并消除抗营养因子，提高
饲料转化率。在养殖过程中，以功能微生物如益
生菌等饲喂动物，可以有效调控动物肠道菌群，
促进有益菌定植，并调节动物免疫，促进动物健
康生长，提高综合生产性能。在养殖环境中，功
能微生物也可有效抑制环境中的病原菌生长和养
殖臭气产生。在养殖末端，功能微生物可以实现
粪污、尸体的无害化处理，促进动物产品加工废
弃物的资源化利用。
虽然目前功能微生物在动物养殖中的应用研
究很多，但仍缺乏系统性的归纳和分析。本文就
功能微生物资源在饲料加工、动物肠道健康、养
殖环境控制到养殖废弃物处理的整个养殖过程等
相关方面的应用及潜在机制进行综述（图 1），
并分析其存在问题和不足，以期为功能微生物在
动物生态健康养殖中的进一步深入应用和相关机
制的挖掘提供参考。
功能微生物在生态健康养殖中的应用
养殖前端 养殖过程 养殖末端
图 1 功能微生物在生态健康养殖中的应用
Fig. 1 Application of functional microorganisms in
ecological and healthy breeding
1 功能微生物在生物饲料加工中的应用
在养殖前端，饲料是基础和关键，其成本占
畜禽养殖生产总运营成本的 2/3 以上。因此，提高
饲料转化效率对提高畜牧养殖业经济效益至关重
要。相对于动物饲料源，植物饲料源因价格低廉
和获取难度低而被广泛使用。但对养殖动物而言，
植物饲料源的消化压力大、营养价值低，因此需
进一步加工处理。通过功能微生物发酵处理饲料
原料，可以有效降解原料中的抗营养因子，促进
营养物质吸收。同时，也可降低非常规饲料原料
中有毒有害物质，提高饲料利用率和营养价值。
1.1 微生物发酵功能性饲料
豆粕、玉米粕和杂粕作为优质植物性蛋白源，
来源广泛，营养丰富，是主要的常规饲料原料。
但它们含有植酸、胰蛋白酶抑制剂、凝集素和抗
also well regulated. Functional microorganisms can also control odor emissions and pathogens in the environment. Finally,
functional microorganisms also play an important role in the bio-safety treatment and circular utilization of breeding wastes.
This study provides references for the continued application and promotion of functional microorganisms in animal breeding
by summarizing the progress of their application and related mechanisms in such areas as feed processing, intestinal health,
breeding environmental control and waste treatment.
Key words: antibiotic-free; functional microorganism; animal health; bidogical feed processing; waste treatment
第34页
24
原蛋白等多种抗营养因子，影响动物对营养物质
的消化吸收。此外粕中含有大量大分子蛋白、多
糖等难以消化的物质，也会对动物的消化系统造
成较大压力。通过功能微生物发酵可以有效解决
这些问题。研究表明，采用酿酒酵母、植物乳杆
菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌
5株益生菌对玉米深加工副产物进行固态发酵后，
粗蛋白含量可增加 14.3%，有机酸含量也显著提
高［1］。以黑曲霉、木霉和酵母固态发酵玉米秸秆
饲料后，粗蛋白含量可增长 10 倍，粗纤维含量
从 36.2% 下降到 18.47%［2］。通过豆豉芽孢杆菌
DP-2 发酵豆粕，大豆球蛋白和 β- 伴大豆球蛋白
的降解率分别为 96.14% 和 66.51%，可溶性蛋白
含量也提高 5.46 倍［3］。
生物发酵饲料在改善动物机体健康和提高动
物生长性能方面具有显著效果，其潜在作用机制
复杂。首先，饲料中的非淀粉多糖会增加粘度和
降低肠内营养消化率。由于缺乏内源水解酶，非
淀粉多糖不能被单胃动物消化［4］。因此发酵过程
中可溶性非淀粉多糖的降解改善了营养价值且是
提高单胃动物性能的重要因素。实验表明，与未
发酵原料相比，在饲料中添加发酵的菜籽粕［5］，
小麦［6］，糠麸［7］或大麦［8］可以提高动物生产
性能，其原因可能是由于发酵后原料中可溶性非
淀粉多糖减少。其次，发酵饲料具有酸味，可以
刺激食欲，提高动物生产性能。以含 6% 发酵大
豆粉（以嗜热链球菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌
发酵）的饲料饲喂断奶仔猪可以提高平均日增
重和平均日采食量［9］。研究表明，发酵饲料可
以降低肠杆菌科［10］和沙门氏菌［11］在胃肠道不
同位置的数量。发酵饲料含有较多乳酸和短链
脂肪酸，可以降低肠道 pH 值从而抑制病原菌生
长［12-13］。此外，酸的产生和 pH 值的降低也可促
进植酸降解，因为谷物或豆类内源植酸酶的最适
pH 均在 4.5~7.5。除内源植物植酸酶外，外源微
生物植酸酶在发酵过程中也可有效降解植酸［14］。
常用饲料发酵微生物如乳酸菌、酵母、黑曲霉和
曲霉等均可分泌植酸酶、促进植酸降解。除降解
抗营养因子外，发酵还可以通过形成与植酸竞争
结合矿物质的低分子量有机酸来提高饲料中矿物
质的生物利用度。发酵过程中产生的柠檬酸和乳
酸有可能抵消植酸盐的抑制作用，从而通过在肠
道中与铁和锌形成可溶性配体来增强宿主对它们
的吸收［15］。
1.2 非常规饲料原料发酵
我国饲料原料资源匮乏，豆粕和玉米等主要
饲料大部分依赖进口。为减少对进口饲料原料的
依赖，需要积极开辟新型非常规饲料资源。但非
常规饲料普遍存在适口性差、营养价值较低、营
养成分不均衡且含有多种抗营养因子或毒性物质
等问题。通过微生物发酵，可以改善非常规饲料
的适口性，提高利用率［16］。近年来，研究者已
开发出许多非常规饲料，如泔水［17］、桑叶［18］、
甜菜渣［19］、酒糟［20］和中草药等，以满足养殖
市场对多样化终端化产品的需求。将发酵酒糟添
加到鸭日粮中，可以提高其最终体重、日均采食
量和大腿肌肉产量，且降低料重比［21］。以发酵
罗汉果渣等量替代饲料中的玉米对黄羽肉鸡生长
性能、肉质和肠道功能并无不利影响［22］。非常
规饲料除可作为饲料成分的替代成分外，还可以
改善动物抗病性。在饲料中添加 4.0% 和 6.0% 的
发酵桑叶可显著增强金鲳鱼对哈维弧菌的抵抗能
力［23］。也有报道指出，酶和微生物联合发酵非
常规饲料的效果要优于单独发酵。以乳酸菌和纤
维素酶联合发酵的青贮饲料饲喂牛，胃中 pH 值
和氨氮 / 总氮显著降低，且干物质、粗蛋白质、
中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的瘤胃降解率显著
提高［24］。但非常规的饲料仍存在营养价值差异大、
发酵工艺无统一标准、对复合菌种的用量和配伍
不清晰等问题，非常规原料发酵的代谢产物及其
作用机制也有待深入研究［16］。
2 功能微生物在调控动物肠道健康中的
应用
在养殖过程中，动物健康是影响其生长性能
的关键因素。最近研究发现，胃肠道除了具有营
养消化和吸收的生理功能外，也是病原微生物栖
息以及动物机体免疫防护的重要器官。其中，肠
道微生物组起至关重要的作用，它们之间的相互
作用极大影响动物机体健康。通过添加功能性微
生物可以改善肠道菌群平衡，从而维护动物机体
健康状况。
2.1 功能微生物调控动物肠道菌群
肠道微生物组是一个复杂而动态的微生态
系统，易受多种因素影响。在动物幼龄时期，肠
道的初始定殖微生物对宿主至关重要，因为此时
第35页
25
的肠道微生物菌群是不成熟和不稳定的，宿主容
易受到环境中的条件致病菌影响。针对该情况，
饲喂功能益生菌可促进有益细菌生长，能够迅速
占据肠道中的微生物生态位，以防止条件致病菌
定植而对宿主健康造成威胁。有研究表明，在饲
料或饮水中添加微生物添加剂可保护幼猪免受感
染，并维持肠道健康［25］。据报道，复合益生菌
具有高效替抗功能，在饮水中添加复合益生菌可
显著改善 22~56 日龄岭南黄羽肉鸡的生长性能，
并有效降低死淘率［26］。以嗜酸乳杆菌 NP51 饲
喂牛能显著降低其粪便中大肠杆菌 O157:H7 的数
量［27］。给断奶山羊饲喂罗伊氏乳杆菌、营养乳
杆菌、粪肠球菌和双歧杆菌等复合菌，可以维持
肠道健康并有效减少粪便中沙门氏菌和志贺氏菌
等致病菌的数量［28］。一般来说，功能微生物对
肠道菌群的调控功能是通过抑制病原体对肠壁的
粘附和竞争对病原体在环境中定居至关重要的营
养物（底物）来实现的。
此外，一些功能微生物可以产生直接抑制病
原微生物的物质，从而减少动物体内病原微生物
数量而发挥益生功能。功能微生物产生的抑菌物
质主要有两种，一种是肠道中碳水化合物和蛋白
质发酵产生的代谢物，如挥发性脂肪酸 (VFAs)，
另一种是针对细胞膜完整性并阻碍质子动力功能
的细菌素或抗菌肽等。如罗伊氏乳杆菌产生的罗
伊氏菌素具有广谱抗菌性，已被报道可以有效抑
制家禽病原空场弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌的生
长［29］。王忠义等［30］从母乳喂养婴儿的粪便和
台湾酸菜中分离出多株潜在益生菌，其中罗伊氏
乳杆菌 F03 对革兰氏阳性菌蜡状芽孢杆菌、李斯
特菌和金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌
和沙门氏菌等病原体均具有抗菌活性，口服罗伊
氏乳杆菌 F03 发酵乳可显著提升肠道乳杆菌数
量，并明显减少粪大肠菌群和产气荚膜梭菌的数
量。许晓燕等［31］研究发现，乳酸乳球菌乳亚种
NCU036018 可以产生细菌素并有效抑制金黄色葡
萄球菌等病原菌。还有研究发现干酪乳杆菌会刺
激肠道分泌抗菌肽、清除肠道病原体、保护机体
肠道屏障［32］。体外表达重组的抗菌肽也表现出
对肠道致病菌的良好抑制作用。
2.2 功能微生物增强动物免疫
功能微生物还可刺激机体免疫［33-34］，改善
动物防御和健康状况。在对早期断奶仔猪生长性
能和肠道发育的研究中，日粮中同时添加活酵母
和超细酵母粉可提高饲料转化率、促进肠道发育
和增强机体免疫力［35］。Chaucheyras-Durand 等［25］
研究发现，以布拉迪酵母菌或乳杆菌饲喂小猪
可促进肠道 IgA 分泌，抑制产肠毒素大肠杆菌增
殖，从而保持小猪健康。Bai 等［36］研究发现，
在饲料中添加 0.1% 或 0.2% 的益生菌产品可增强
1~21 日龄肉鸡的肠道 T 细胞免疫，且对肉鸡生长
性能无不良影响。Lee 等［37］研究发现，肉鸡饲
喂 5×106
CFU 芽孢杆菌可降低巨型艾美耳球虫感
染率，胃肠道病变明显减少。此外，益生菌也可
增强动物接种疫苗的免疫效果。通过饮水添加益
生菌，可增强肉鸡接种新城疫疫苗产生的体液免
疫反应［38］。功能微生物增强动物免疫是通过调
节炎症因子和抗体产生、增强自然杀伤细胞和巨
噬细胞活性、调节树突状细胞功能和表型、调控
AP-1 和 NF-κB 通路、调节细胞凋亡和一氧化氮
释放来实现的［39］。如罗伊氏乳杆菌可以激活巨
噬细胞并增强其吞噬和杀死细胞内鼠伤寒沙门菌
的能力从而减轻鼠伤寒沙门菌引起的炎症反应，
其内在机制可能是一氧化氮产生的调节［40］。大
部分功能微生物免疫调节特性的介质是免疫细胞
尤其是辅助 T 细胞，且一般具有菌株特异性［41］。
3 功能微生物在改善养殖环境中的应用
随着规模化和集约化畜牧场的发展，养殖场
环境对动物养殖的影响越来越大。养殖动物与其
生活环境之间不仅存在物质和能量的交换，也存
在微生物的交换。动物自身携带的微生物能够影
响环境，环境中存在的微生物也不断影响动物。
而在养殖场中，粪便、尿液、饮水和呼吸是动物
与环境交流的主要方式和载体。目前养殖场环境
控制中的两个重要问题是有害微生物和臭味，功
能微生物也受到广泛关注和应用。
3.1 功能微生物抑制环境病原
在环境病原控制方面，陆生动物的养殖环
境较易使用化学试剂和药品等处理，因此功能微
生物的应用较少。在水产养殖中，高密度养殖伴
随的药物滥用和药物残留导致严重的环境污染和
食品安全问题。水产养殖因其水体环境特性而难
以使用畜禽养殖的方式处理，采用生态健康养殖
模式是确保水产养殖业绿色可持续发展的重要途
径，因此功能微生物在水产养殖环境控制中发挥
第36页
26
着重要作用。益生菌已被证明能拮抗多种水产动
物病原体，是遏制水产养殖疾病问题的一个很好
的解决方案。孙博超等［42］在水体中使用组合益
生菌能够有效抑制弧菌在水体和虾体内的增殖，
提高虾成活率。陈锦豪等［43］也报道了通过向鱼
虾混养池塘中添加益生菌和复合营养剂可显著降
低养殖水体中有害弧菌的浓度，使其远低于致病
浓度而保证养殖动物安全。Santos 等［44］从欧洲
海鲈、金头海鲈和白海鲈中分离出多株功能微生
物菌，均具有抗菌、抑制生物膜形成和抗群体感
应活性，可有效抑制常见水产病原菌如嗜水气单
胞菌和沙门氏菌等的生长与侵染。一些功能微生
物还会分泌一些抑菌活性物质，可被应用于养殖
水体病原控制。石广举等［45］在饲料中添加纳豆
菌抗菌脂肽可以有效降低水体和虾体中副溶血弧
菌和溶藻弧菌的数量。在水产养殖中虽然不断有
不同功能微生物用于拮抗各种病原微生物，但相
关作用机制仍不清楚，需要进一步深入研究。
3.2 功能微生物控制养殖臭气
除了抑制环境病原微生物外，臭气治理也
是功能微生物用于养殖环境控制的重要方向。养
殖臭气分子主要来源于动物体内未被利用的蛋白
质、多糖等成分的发酵分解，目前一般认为氨和
硫化氢是养殖臭气的主要组成。功能微生物用于
氨和硫化氢的降解研究已有深入研究，其应用方
式主要有减少臭气分子产生和降解臭气分子两
种，可通过在饲料中添加生物除臭菌剂和对粪污
喷洒生物除臭菌剂实现。饲料生物除臭添加菌剂
一般在饲料或饮水中添加，提高动物对饲料的消
化吸收率，间接减少臭气排放。张志峰等［46］报
道指出，通过在家禽日粮中添加枯草芽孢杆菌可
提高消化酶活性和氮利用率，从而减少氨排放。
除了直接使用益生菌饲料添加剂外，采用原位喷
洒功能微生物也是畜禽粪污臭气治理另一重要途
径。功能微生物对于臭气分子的降解研究已有较
长时间，大部分均集中于对于氨和硫化氢的降解。
邵栓等［47］使用具有除臭功能的贝莱斯芽孢杆菌、
枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌对猪
粪处理，在最优条件下猪粪中氨和硫化氢去除率
可达 63.60% 和 70.29%。李玥等［48］从鸡粪中分
离得到 5 株具有除臭功能的菌株，包括芽孢杆菌
属 MS03、贝莱斯芽孢杆菌 MS07、耐寒短杆菌
MS11、木糖葡萄球菌 MS42 和变异棒杆菌 MS82，
应用复合菌系 MS03+MS07 和 MS03+MS82 处理鸡
粪，氨和硫化氢去除率均可超过 60%。吲哚类分
子因其嗅阈值低，即使相对浓度较低，但其臭气
贡献率很高，且降解难度大、极性高、挥发性强，
已成为目前养殖臭气治理的难点。目前已有多株
吲哚降解菌的相关报道，但降解效率不够高，且
大部分只适用于工业废水废气处理，难以在养殖
业中应用［49］。最近本课题组［50］从猪粪中筛选鉴
定出高效吲哚无氧降解菌 GDIAS-5，非常适合于
养殖环境中粪污堆积的缺氧场景，并首次发现了
负责吲哚无氧氧化的单加氧酶 ycnE，促进了对吲
哚降解机制的理解。
4 功能微生物在养殖废弃物资源化利用
中的应用
功能微生物在粪便、动物尸体和加工副产
品等畜禽养殖末端废弃物的处理上也已被广泛应
用和研究。随着我国养殖规模的不断扩大，相关
废弃物的产生量也越来越大，对环境造成严重影
响［51］。但实际上，很多废弃物如羽毛、虾蟹壳
等仍具有较高的可利用空间，只是处理难度较大，
成本较高，其中含有的潜在病原菌也需要进行处
理，而使用功能微生物则可以有效解决这些问题，
促进养殖废弃物的资源化利用。
4.1 粪便和动物尸体堆肥处理
粪便和动物尸体堆肥处理需要微生物在高温
条件下对有机废物进行生物分解和转化，以产生
稳定的、无病原体且可有利于土地增肥的最终产
物［52］。影响堆肥的主要因素是碳氮比、颗粒大小、
水分含量、pH 值、氧气利用率、堆肥技术以及微
生物活力。尽管原料中也存在一些微生物可以降
解堆肥材料，但它们较少的数量和较差的降解能
力导致堆肥效率降低和堆肥质量不理想［53］。为
加快堆肥进程，堆肥过程中通常添加使用一些有
机肥发酵剂，可见，使用专门的功能微生物是促
进堆肥成熟和提高最终堆肥质量的有力手段。接
种耐热放线菌，包括链霉菌 H1、分枝杆菌 G1、
小单孢菌 G7 和糖单孢菌 T9，已经被报道可以增
强粪便中木质纤维素的降解并提高堆肥的效果和
质量［54］。堆肥过程中的纤维素酶、木聚糖酶、
锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶的活性
也都增加。最近，也有发现在堆肥原料中补充耐
热氨氧化细菌可以改善堆肥牛粪的腐殖化过程，
第37页
27
并显著提高产品的腐殖化因子和芽孢杆菌科丰
度［55］。Wan 等［56］将筛选得到的 25 种不同纤维
素降解菌与 7 种商业菌株结合接种堆肥，可以提
高堆肥温度，促进嗜热阶段发展，使堆肥产品的
发芽指数从 62% 提高到 96%。然而，目前对生物
强化在堆肥过程中作用和机制的了解仍然缺乏，
需要进一步深入研究［57］。
4.2 粪便、废水和动物尸体厌氧消解
厌氧消解是一种被广泛应用的处理养殖有机
废弃物的多功能技术，是一个由不同种类细菌和
产甲烷古菌进行的连续发酵过程，也被称为厌氧
消化产甲烷。在动物养殖废弃物处理中，厌氧消
解应用的功能微生物可用于原料预处理以及生物
强化消解。预处理主要是针对原料中纤维素和木
质纤维素等难降解组分，利用高效分解纤维素的
白腐真菌对在牛粪和谷类作物厌氧消解之前的原
料进行预处理可使甲烷产量提高 10%~18%，纤
维素降解率提高 80%［58］。使用烟曲霉 SK1 或木
霉预处理牛粪，木质素去除率达 60% 和 43%，还
原糖含量提升到 4.91、9.59 μmol，沼气产量显
著提高［59］。生物强化则是在厌氧消解过程中添
加不同的功能微生物，以增强系统对底物的消解
能力。以 15% 的接种量添加厌氧瘤胃真菌可以有
效增强牛粪中木质纤维素的水解，甲烷产量提高
60%［60］。在猪粪中接种 RY3、SH4、G1、G2 和
G3 产甲烷菌株明显促进产甲烷过程的启动和缩短
消解时间，沼气总产量提高 2.7 倍［61］。
4.3 羽毛深加工资源化利用
羽毛是家禽养殖业的主要副产品，主要由角
蛋白组成。一方面，家禽业产生的大量未经处理
的羽毛会因其难以降解而造成环境污染。另一方
面，羽毛富含蛋白，是肥料和动物饲料的潜在来
源。通过功能微生物处理，可以有效破坏角蛋白
结构，使其转化为可被消化吸收的小分子。目前
已从各种环境中分离出许多羽毛降解菌，其中地
衣芽孢杆菌和链霉菌被认为是细菌中最有效的角
蛋白降解菌［62］。最近文献报道了一株能固态发
酵高效降解羽毛的链霉菌 Streptomyces sp. SCUT3，可以在 6 d 内将羽毛中超过 90% 的角蛋白转
化为可溶的氨基酸及多肽［63］。该团队进一步揭
示了半胱氨酸双加氧酶 CDO1 产生亚硫酸盐还原
羽毛中二硫键的机制，还通过合成生物学改造了
其增强羽毛降解的能力，使发酵时间缩短至 3 d，
发酵产品中直接可溶氨基酸超过 30%，可溶多肽
超过 20%［64］。而虽然在应用功能微生物产角蛋
白酶有较多报道，但直接以酶处理完整的羽毛并
不成功，可能是由于受到角蛋白分子间众多二硫
键的阻碍。
4.4 虾蟹壳生物转化
随着水产养殖和加工业的迅速发展，大量
甲壳废弃物被产生。由于缺乏有效的几丁质酶，
这些废弃物很难被人类降解利用。传统物理及化
学处理法能耗高、污染大。甲壳通过功能微生物
直接发酵或酶处理可以有效提高其营养价值，使
其能被动物吸收利用。利用枯草芽孢杆菌发酵虾
壳，通过产酸去除 72% 的矿物质、产蛋白酶去除
84% 的蛋白质，可以从虾壳制备得到几丁质和壳
聚糖［65］。利用产蛋白酶的深层微小杆菌和产乳
酸的嗜酸乳杆菌连续两步发酵虾壳提取几丁质，
86% 的蛋白质和 95% 的矿物质均被去除［66］。此
外，以经过植物乳杆菌 LV33204、嗜麦芽寡养单
胞菌 LV2122 和气单胞菌 LV1111 发酵的虾壳饲
喂小鼠表现出降血糖和降血脂的效果［67］。在利
用功能微生物产酶处理虾壳方面，近期罗晓春教
授课题组取得系列进展：通过重组毕赤酵母发酵
获得一株现有报道酶活产量最高的重组几丁质酶
rChit46［68］；结合 rChit46 与重组酸性蛋白酶，首
次实现虾壳蛋白质、几丁质、虾青素和矿物质的
零浪费回收［69］；进一步以融合多糖结合域改造
rChit46，通过重组毕赤酵母发酵产酶，首次实现
几丁质酶一步法降解未经任何前处理的虾壳［70］；
获得的几丁寡糖具有免疫调节作用，可增强小鼠
巨噬细胞的吞噬活性和抑制脂多糖介导的炎症应
答［71］。
5 存在问题
我国大力推行生态健康养殖，微生物在养殖
领域的应用也越来越广泛，但目前仍然存在以下
问题，需要在未来进行更深层次研究。首先，用
于养殖业的微生物菌株准入门槛低，许多微生物
菌种来源不明，作用机制不明晰，且高性能、高
耐受性、高稳定性和高适应性的优良菌株资源仍
然匮乏。针对这一问题，应加大力度筛选更加优
良的菌株，以扩大菌种库和基因库。还应根据研
究目的，不断驯化、诱变和改造现有菌株，探索
更高通量的方法选育优良菌株。其次，目前许多
第38页
28
养殖用微生物缺乏具体的功效和安全性评价，部
分存在安全隐患的微生物仍被用于养殖业且缺少
评价体系，如许多含有毒力因子的粪肠球菌和屎
肠球菌等。当前应尽快建立完善的养殖微生物功
能和安全评价体系，设立综合评价指标和方法。
第三，养殖功能微生物菌剂加工工艺相对落后，
许多功能优良的乳杆菌、双歧杆菌等由于难以耐
受饲料加工的高温条件而难以实际应用。要解决
这个问题，需要大力开发微胶囊包被、后喷涂和
膜过滤等可保持微生物活性的新型饲料加工技
术。第四，产品设计落后，功效突出的个性化产
品少。市面上通用全能型产品居多，许多产品菌
株组合没有科学依据，针对性强和效果突出的个
性化产品少。加强认识养殖动物微生态平衡的重
要性，以及正常微生物群的普遍性和必要性，针
对不同部位、时期以构建合理的微生态菌群与结
构为目的设计产品是一个有效的解决方法。
6 结论
基于功能微生物的微生态制剂具有资源节
约、环境友好的特征，是解决我国面临的资源短
缺与环境污染等问题的重要途径。功能微生物制
剂可以逐渐替代养殖用化学物质，取代激素和抗
生素，提高动物综合生产性能，生产出健康食品，
恢复环境和宿主的生态和微生态平衡。随着我国
在畜牧养殖业禁抗无抗水平的提高，以及对饲料
安全和卫生的愈加重视，功能微生物制剂必将在
养殖业中受到重点关注和大力推广，其在动物饲
料、废弃物处理和环境控制方面也将会得到进一
步开发和利用，促进养殖业生态健康可持续发展。
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（责任编辑 白雪娜 ）
邓俊劲，博士，助理研究员，
研究方向为微生物资源对农业废弃
物处理与资源化利用，近期的研究
重点是畜禽养殖中的臭味消除。近
两年主持国家自然科学基金、中国
博士后科学基金和广东省自然科学
基金等项目 5 项。近 5 年发表 SCI
论文 10 篇，其中第一作者 8 篇，
共同第一作者 1 篇。申请发明专利
10 件，获得授权 5 件。参与研发的生物质降解技术“超级改
造菌降解农业含氮废弃物（羽毛、虾蟹壳、鱼皮）高值化利用”
获得 2022 年度广东省农业微生物领域十大可应用转化重大
科技成果奖。
陈庄，研究员，学科带头人，
现任广东省农业科技战略专家，国
家、广东省和浙江省自然科学基金
评审专家。主要从事畜牧胃肠道微
生物、畜牧营养调控研究。在农业
微生态制剂研究开发和动物基因编
辑等方面有深入研究，曾担任畜牧
育种国家重点实验室副主任，是业
内公认学术造诣高，工作业绩突出
的专业技术人员。主持省部级以上科技项目 10 余项，作为
首席科学家主持国家“973”重大项目农业生物技术及农产
品加工科学问题，在国内外期刊累计发表论文 80 余篇，申
请发明专利 18 件。参编广东省第一部动物转基因专著《转
基因动物》(1995)。获科技成果多项，其中省部级以上成果
奖励 4 项，包括农业部农业科技创新团队奖、广东省农业技
术推广二等奖、广东省自然科学三等奖和广东省科技进步三
等奖。
第43页
收稿日期：2022-09-30
基金项目：华南应用微生物国家重点实验室开放基金（SKLAM002-2021 ）；华南地区乡村振兴专项资金
（2021KJ382）；茂名实验室科研启动项目（2021TDQD002）；华南地区农业科学院地方分院和专家工作站工作经费
项目（2022 支撑 11）
作者简介：董博（1982—），男，博士，助理研究员，研究方向为海洋微生物组学，E-mail：dongbo@gdaas.cn
通信作者：陈庄（1963—），男，博士，研究员，研究方向为畜禽水产微 生物组学，E-mail：chenzhuang@gdaas.cn
广东农业科学 2022，49（11）：33-43
Guangdong Agricultural Sciences DOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2022.11.004
董博，邓涵逸，孙艺秋，房元杰，彭淼曦，石琼，贝锦龙， 魏文康，陈庄 . 基于肠道宏基因组对弹涂鱼两栖适应性的研
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基于肠道宏基因组对弹涂鱼两栖适应性的研究
董 博 1
，邓涵逸 1
，孙艺秋 1
，房元杰 1
，彭淼曦 1
，石 琼 2，3，
贝锦龙 1
，魏文康 1
，陈 庄 1
（1. 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 / 广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室，
广东 广州 510640；2. 深圳市海洋生物基因组 学重点实验室，广东 深圳 518083；
3. 深圳大学生命科学与海洋学院，广东 深圳 518061）
摘 要：【目的】从基 因组水平上报道两种有代表性的两栖鱼类大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris，
BP）和大鳍弹涂鱼（Periophthalmus magnuspinnatus，PM）对陆地生活的适应性，以揭示胃肠道微生物群对弹涂
鱼在陆地生活的适应性及其特殊免疫力具有关键作用。【方法】采用 16S 扩增子测序和宏基因组技术，利用两种
有代表性的弹涂鱼和 3 种典型水生鱼类（草鱼 Ctenopharyngodon idellus、鲢鱼 Hypophthalmichthys molitrix 和鳙鱼
Aristichthys nobilis）的宏基因组数据，比较两栖鱼类和水生鱼类肠道的微生物组成、多样性、丰度和功能，并研
究潜在陆生标志微生物群。此外，通过查阅大量文献得到具有代表性的海水鱼类、淡水鱼类、两栖动物和陆生动
物的胃肠道微生物群数据，比较弹涂鱼的肠道菌群组成和功能。【结果】在弹涂鱼的胃肠道微生物群中，厚壁菌门、
变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门占主导地位。这些菌的含量在大鳍弹涂鱼、大弹涂鱼和水生鱼类之间存在显著差
异。草鲢鳙和弹涂鱼二者胃肠道微生物群之间最大的区别是 CKC4 门（一种推测与宿主脂质代谢相关的胃肠道细
菌门类）的比例，草鲢鳙中该比例从 4％ ~27％不等，而在弹涂鱼中则没有发现。此外，弹涂鱼的胃肠道微生物
群中同时具有陆生动物、淡水和海水鱼类以及两栖动物的典型细菌家族，这与它们在水陆过渡咸淡水交界处的生
活特征相吻合。与陆生动物相比，鱼类拥有更高比例的梭状杆菌和变形杆菌，而陆生动物则具有更多的拟杆菌。
在大弹涂鱼和大鳍弹 涂鱼中还发现了此前被认为仅存在于陆生动物的 S24-7 菌株。【结论】推测弹涂鱼胃肠道微
生物群落相比水生性鱼类具有复合和多样性特征，可以通过病原体相关分子模式 PAMP 刺激宿主在进化中形成多
样性更高、拷贝数更多的天然免疫受体基因家族，以此适应更为复杂的两栖生活环境。
关键词：胃肠道微生物群；宏基因组学；两栖弹涂鱼；陆地适应；免疫学特异性
中图分类号：S917.1 文献标志码：A 文章编号：1004-874X（2022）11-0033-11
Study on the Amphibious Adaptability of Mudskippers
Based on Intestinal Metagenome
DONG Bo 1, DENG Hanyi1
, SUN Yiqiu1
, FANG Yuanjie 1, PENG Miaoxi1
, SHI Qiong2, 3,
BEI Jinlong1
, WEI Wenkang1
, CHEN Zhuang1
（1. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences /
Guangdong Key Lab of Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou 510640, China;
2. Shenzhen Key Laboratory of Marine Genomics, Shenzhen 518083, China;
3. College of Life Science and Oceanology, Shenzhen University, Shenzhen 518061, China）
第44页
34
【研究意义】弹涂鱼是一类可以在水中和陆
地上生存的硬骨鱼类，栖息于海洋潮间带滩涂，
低潮时暴露在空气中。3.6 亿年前，鱼类成功从水
生生物转变为陆地生物或四足动物，这一过渡期
间的形式尚存在化石中。两栖鱼类成为了解脊椎
动物水陆转变相关遗传变化提供了有用的研究模
型［1］。
【前人研究进展】依据基因组数据分析得
到的系统发育树结果对弹涂鱼分类，大弹涂鱼属
（Boleophthalmus） 和 青 弹 涂 鱼 属（Scartelaos）
构成一个类群，而齿弹涂鱼属（Periophthalmodon）
和弹涂鱼属（Periophthalmus）构成另一类群。这
个分群与它们的水生习性一致，前一类群水生习
性强，而后一类群陆生习性特别强，其中大弹涂
鱼（Boleophthalmus pectinirostris）栖息于中低潮
带的泥滩，植食性，刮食底栖硅藻，水生习性较强；
而大鳍弹涂鱼（Periophthalmus magnuspinnatus）
栖息于中高潮带的水草或红树林滩涂区域，肉食
性，主要捕食水生昆虫及小型甲壳生物等，一生
中约 2/3 的时间离水生活，陆生习性最强。作为
从水生鱼类进化到陆生四肢动物过渡环节的代
表，弹涂鱼及其两栖适应性一直受到国内外研究
者的关注，其陆地适应包括通过空气呼吸、有更
高的氨耐受性、使用改良的胸鳍进行陆地运动、
抗病能力强以抵抗水陆两种生境中众多不同的病
源微生物等［2］。这些进化的表型被认为是选择压
力驱动的遗传进化的结果［1］。然而，目前对胃肠
道微生物群宏基因组这一生物体第二基因组所赋
予的两栖适应性知之甚少。
免疫是两栖鱼类在从水到陆地过渡期间应对
多样化环境和各种病原体的关键因素。研究发现，
与其他硬骨鱼分离后，弹涂鱼的先天免疫系统基
因显著扩增［1］。在已测序的脊椎动物中，弹涂鱼
拥有最多数量（11 拷贝）的 TLR13［1-2］，这有利
于防御陆地病原体。除了提供陆地适应的基因组
外，弹涂鱼肠道微生物群在免疫等生理特征中起
重要作用［3-7］。胃肠道微生物群与宿主共同从水
到陆地的过渡期间进行了数百万年进化，鱼类的
Abstract:【Objective】In this study, we report the adaptability of two representative amphibian species, blue-spotted
mudskipper (Boleophthalmus Periophthalmodon, BP) and giant-fin mudskipper (Periophthalmus magnuspinnatus, PM)
to live on land are reported, with a view to revealing the key role of gastrointestinal microbiota in the adaptation and specific
immunity of mudskippers to amphibious life. 【Method】By using 16S amplicon sequencing and metagenomic tec hniques, the
microbial composition, diversity, abundance and function of the intestines of amphibian and aquatic fish species were compared
with metagenomic data were utilized to compare of two representative mudskippers (BP, PM) and three typical aquatic fish
species including Ctenopharyngodon idellus (CI), Hypophthalmichthys molitrix (HM) and Aristichthys nobilis (AN) and the
potential terrestrial marker gastrointestinal microbiota in mudskippers were investigated. In addition, the representative data of
gastrointestinal microbiota from marine fish, freshwater fish, amphibians and terrestrial animals were obtained through extensive
literature to compare the composition and function of intestinal microbiota in mudskippers.【Result】Firmicutes, Proteobacteria,
Bacteroidetes and Fusobacteria were dominant in the gastrointestinal microbiota of mudskippers. The contents of various dominant
phyla were strikingly different among BP, PM and aquatic fishes. Th e most significant difference in the gastrointestinal microbiota
between the two groups was the proportion of CKC4, a gastrointestinal bacterial phylum that is speculated to be related to host lipid
metabolism, which ranged from 4% to 27% in CI, HM, AN but was not found in the mudskipper. In addition, the gastrointestinal
microbiota of mudskipper containeds typical bacterial families in terrestrial animals, freshwater and seawater fishes fish and
amphibians, which iwas consistent with their life characteristics at the salt-water interface between water and land. It was also
observed that fishes had a higher proportion of Clostridium and Proteobacteria than terrestrial animals, which had more Bacteroides
species. More interestingly, certain bacteria strains like S24-7, previously thought to be specific in terrestrial animals, were also
identified in both BP and PM. 【Conclusion】The results suggest that the gastrointestinal microbial communitiesy of mudskipper
wasare more complex and diverse than thoseat of aquatic fishes, which subsequently stimulate the host to form innate immune
receptor gene families with higher diversity and more copy numbers through pathogen-related molecular pattern (PAMP) to a more
complicated amphibian environment.
Key words: gastrointestinal microbiome; metagenomics; amphibious mudskipper; terrestrial adaptation; immnological
specificity
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35
许多生理功能由它们维持或参与，包括病原体的
拮抗作用、肠上皮细胞的增殖和免疫系统的成熟
等［8-10］。
【本研究切入点】长期以来，人们认为所有
鱼类的宿主遗传背景和环境因素使其选择“核心
微生物群”来维持所有鱼类成员共有的一些基本
功能［11］。这个假设可以推广到两栖动物和陆生
脊椎动物。而弹涂鱼的独特生活习性将为这一假
设以及核心微生物群如何从水生变为陆地［12-13］
提供参考。【拟解决的关键问题】本研究采用
16S 扩增子测序和宏基因组技术，通过比较分析
两种水陆生习性差异较大的弹涂鱼代表种与具有
代表性的水生鱼类的胃肠道微生物群组成、丰度、
多样性和功能，以期得出有益于其两栖适应性的
标志胃肠道微生物群，为弹涂鱼对两栖生活的适
应性提供研究参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试的大弹涂鱼和大鳍弹涂鱼分别于 2016
年 7 月和 2017 年 7 月在广东省珠海市淇澳岛野
外捕获。供试的水生鱼类为草鱼、鲢鱼和鳙鱼，
于 2016 年 8 月在广东省广州市一孵化场收集，每
尾重约 1~2 kg，采用深圳澳华农牧有限公司的商
业饲料喂养。选择大而健康的个体，用无菌蒸馏
水冲洗鱼体表，并使用 70% 乙醇消毒，然后作无
菌解剖取出后肠，挤出肠道内容物和上皮粘膜，
于 -80 ℃下保存备用。所有试验均按照动物伦理
委员会的指导方针开展。
1.2 宏基因组 DNA 提取
本研究选取 4 条大弹涂鱼、3 条大鳍弹涂鱼、
8 条草鱼、5 条鲢鱼、1 条鳙鱼的肠道内容物和上
皮粘膜样品共 21 份，冰上解冻后采用 DNA 提取
试剂盒（CTAB 法）提取总细菌 DNA［14］。在 1%
琼脂糖凝胶上检测 DNA 的完整性和纯度，通过
Qubit 荧光计（Thermo Fisher Scientific，USA）测
量 DNA 浓度。将提取的宏基因组 DNA 保存于 -80
℃备用。
1.3 文库构建和验证
通过超声波基因剪切仪 Covaris 将宏基因组
DNA 分解成 350 bp 片段用于电泳测定。随后将片
段 化 的 DNA 与 End Repair Mix（NEB，USA） 混
合于 20 ℃下温育 30 min。用 QIAquick PCR 纯化
试剂盒（Qiagen，USA）纯化末端修复的 DNA，
然后加入 A-Tailing Mix（NEB，USA）。连接后，
通过 2% 琼脂糖凝胶选择接头连接的 DNA 以回收
靶片段。纯化凝胶并进行 PCR 扩增以富集接头
连接的 DNA 片段。然后通过 2% 琼脂糖凝胶选择
PCR 产物，并使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯
化以回收靶片段。构建的文库以两种方式定量，
包括使用 Agilent 2100 生物分析仪与 Agilent DNA
1000 试剂测定平均分子长度，以及通过定量实时
PCR 仪（Agilent，USA）对文库进行定量。
1.4 文库测序
首先在 cBot 仪器（Hiseq 4000 PE Cluster Kit，
Illumina，USA）的流动池内扩增合格的文库用
于生成簇。随后将聚集的流动细胞加载到 Hiseq
4000 测序仪（Hiseq 4000 SBS Kit，Illumina）上进
行双末端测序，推荐的测序基因长度为 100 bp 或
150 bp。
1.5 宏基因组的组装和注释
通过 Illumina Hiseq PE150 平台对总共 21 个
样品进行测序。宏基因组由 MEGAHIT 软件组装，
分析由深圳倍森基因科技有限公司实施［14-15］。
推断的氨基酸序列的注释通过蛋白质分子序
列 比 对 搜 索 工 具 BLASTP 针 对 NR 数 据 库 进 行
（E ≤ 1e-3，KAIJU）［16］。为了确定肠道微生
物群的准确系统发育组成，将所有宏基因组测序
基因比对到原核参考基因组，使用具有默认参数
的核酸分子序列比对搜索工具 BLASTN 提交至
NCBI 的基因组数据库，针对每个相应宿主的基因
组过滤序列相似性≥ 75% 的测序基因。
1.6 OTU 统计和维恩图绘制
通 过 软 件 USEARCH（v7.0.1090）［17］ 将 标
签 聚 类 到 OTU（ 操 作 分 类 单 元）：（1） 使 用
UPARSE 将标签聚集为 97% 阈值，得到 OTU 唯
一代表序列。每个样本的 OTU 数主要代表样本多
样性程度。（2）使用 UCHIME（v4.2.40）过滤掉
嵌合体。（3）使用 USEARCH GLOBAL（扩增子
分析软件）将所有标签映射到每个 OTU 代表性序
列，然后将每个样品中每个 OTU 的标签号总结为
OTU 丰度表。使用核糖体数据库 RDP（v.2.2）分
类器对序列进行分类（在 Greengenes 数据库上训
练，以 0.8 信任值作为阈值）。
基于 OTU 丰度列出每组的 OTU 用于比较。
维恩图由软件 R（v3.1.1）绘制，其中汇总了公共
第46页
36
或特定的 OTU ID。不同的颜色代表不同的样本或
组，每个圆圈的内部象征性地表示观察到的 OTU
数量，重叠区域或交叉点表示公共 OTU 集，单层
区域表示在某个样本 / 组中唯一标识的 OTU 数量。
2 结果与分析
2.1 鱼类宏基因组数据集的总结
本 研 究 选 取 4 条 大 弹 涂 鱼、3 条 大 鳍 弹 涂
鱼、8 条草鱼、5 条鲢鱼、1 条鳙鱼的肠道内容物
和上皮粘膜样本进行 16S rRNA 测序，分别生成
29 Mb、17.39 Mb、22 Gb、46.7 Gb 和 12 Gb 的原
始数据。由于宿主污染占原始数据的大部分，因
此对所有序列数据过滤以去除宿主污染并生成鱼
类宏基因组数据。最终从宏基因组数据中，本研
究 注 释 共 4 966 种、1 453 属、378 科、178 目、
76 类和 54 门。
草鱼的胃肠道微生物群（表 1）由梭杆菌门
（35.39%）、 厚 壁 菌 门（20.34%）、 拟 杆 菌 门
（18.10%）、 变 形 菌 门（14.89%） 和 CKC4 门
（7.66.%）主导，这与之前的研究结果一致［12,18］，
但丰度可能因饲养条件和鱼类年龄不同而有所不
同。代表性的属分别是气单胞菌属（19.02%）、
希瓦氏菌属（3.79%）、鲸杆菌属（2.96%）、拟
杆菌属（1.60%）和梭菌属（0.81%）。
表 1 弹涂鱼与草鱼、鲢鱼、鳙鱼在胃肠道微生物门水平上的相对丰度（%）
Table 1 Relative abundance (%) of the gastrointestinal phyla annotated in mudskippers and Ctenopharyngodon idellus,
Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis
门类
Phylum
草鱼
Ctenopharyngodon idella
鲢鱼
Hypophthalmichthys
molitri
鳙鱼
Aristichthys nobilis
大弹涂鱼
Boleophthalmus
pectinirostris
大鳍弹涂鱼
Periophthalmus
magnuspinnatus
梭杆菌门 Fusobacteria 35.39 20.61 41.99 14.55 43.12
厚壁菌门 Firmicutes 20.34 16.76 22.78 28.58 1.01
变形菌门 Proteobacteria 18.10 11.84 29.38 28.01 41.94
拟杆菌门 Bacteroidetes 14.89 18.88 0.25 20.94 13.93
CKC4 门 7.66 27.33 4.92 0.21 NA
疣微菌门 Verrucomicrobia 2.16 1.40 NA 0.12 NA
螺旋菌门 Spirochaetae 0.33 NA NA 0.12 NA
蓝细菌门 Cyanobacteria 0.32 1.05 0.40 6.11 NA
黏胶球形菌门 Lentisphaerae 0.31 NA NA NA NA
浮霉菌门 Planctomycetes 0.18 0.55 0.12 NA NA
放线菌门 Actinobacteria 0.16 0.76 NA 0.59 NA
绿弯菌门 Chloroflexi 0.14 0.24 0.15 NA NA
衣原体门 Chlamydiae NA 0.10 NA 0.51 NA
软壁菌门 Tenericutes NA 0.48 NA 0.26 NA
2.2 弹涂鱼和草鱼、鲢鱼、鳙鱼之间微生物物种
及丰度的比较
2.2.1 弹涂鱼胃肠道微生物组成 在弹涂鱼的宏
基因组中，本研究观察到胃肠道微生物群的厚壁
菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门占比较大
（表 1），然而每个菌的丰度在大弹涂鱼和大鳍
弹涂鱼之间显著不同。例如，厚壁菌门在大弹涂
鱼中占胃肠道微生物约 35%，而在大鳍弹涂鱼
中仅为 1%；相反，梭杆菌门在大鳍弹涂鱼中占
43%，远远超过其在大弹涂鱼中的比例。此外，
大弹涂鱼的胃肠道微生物门水平上的多样性显著
高于大鳍弹涂鱼。胃肠道细菌的多样性从杂食性
动物到食草性动物一般是增加的［19-20］，草食性
的大弹涂鱼胃肠道细菌多样性少于杂食性的大鳍
弹涂鱼也可以证明这一事实［2］。
这两种弹涂鱼物种胃肠道微生物组成的另
一个显著区别是蓝细菌在大弹涂鱼中所占比例
为 6.11%，而在大鳍弹涂鱼中则未发现，这种差
异与两者间较大的水陆习性差异相符合。前者
更偏水生且更多地摄取海水中的藻类（包括蓝
藻）［19-20］等。
2.2.2 草鱼、鲢鱼和鳙鱼胃肠道微生物组成 鳙
鱼、鲢鱼和草鱼的宏基因组结果（表 1）与之前
的报道［21-25］一致，其中 4 种主要门类厚壁菌门、
变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门丰度相对较高。
厚壁菌门和拟杆菌门的比例从这 3 种鲤科鱼类到
大弹涂鱼，再到大鳍弹涂鱼逐渐增加，与上述 3
种水生性鲤科鱼类及偏水生性的大弹涂鱼相比，
第47页
37
偏陆生性的大鳍弹涂鱼胃肠道中厚壁菌门和拟杆
菌门比例更高［20］。
2.2.3 弹涂鱼和草鱼、鲢鱼、鳙鱼之间胃肠道
微生物差异 胃肠道微生物群在 3 种鲤科鱼类与
弹涂鱼中的最大差异在于 CKC4 门，在鲤科鱼类
中占比从 4%~27% 不等，而在大弹涂鱼中仅为
0.21%，在大鳍弹涂鱼中则未发现（图 1）。目
前关于 CKC4 门细菌群的信息很少，其最早在斑
马鱼胃肠道中被发现。之前的研究表明 CKC4 门
可能对雌激素及其类似物敏感，推测内分泌暴露
显著改变了斑马鱼肠道微生物群中 CKC4 门的丰
度［26］，CKC4 门可能与宿主脂质代谢的变化有关。
2.3 不同物种之间的微生物群种类组成和丰度
比较
本 研 究 在 NCBI 上 下 载 了 38 种 物 种 的 16S
rRNA 测序数据，以及可用的宏基因组结果。对
收集的不同物种微生物组数据加以对比，可反映
每个进化群体中胃肠道微生物群的整体变化和
细微变化。将不同物种分为 5 类，分别为两栖鱼
类、海水鱼类、淡水鱼类、两栖动物和陆生动物
（表 2）。
弹涂鱼和草鱼、鲢鱼和鳙鱼的胃肠道微生物
组成与丰度在图 1 中的分布与表 1 呈现的结果一
致。根据 5 类鱼类中纲水平微生物群组成可知，
弹涂鱼中的黄杆菌含量远远高于其他鱼类。事实
上，黄杆菌属于条件致病菌，广泛分布于水和陆
地，并对野生鱼类和人工繁殖的鱼类种群构成严
重威胁［27］。 本研究通过搜索相应的宏基因组注
释结果，在大弹涂鱼的胃肠道微生物群中发现肠
球菌菌株（0.07%）。这些革兰氏阳性细菌通常
存在于陆生哺乳动物中［28］。
由 图 2 可 知， 瘤 胃 球 菌 科 Ruminococcaceae
和 毛 螺 菌 科 Lachnospiraceae 在 弹 涂 鱼、 两 栖 动
物和陆地哺乳动物中相对丰富（分别为 0.16%
和 0.61%，7.0% 和 4.4%，10.3% 和 11.9%）。
特别是 S24-7 家族，在陆地动物胃肠道微生物群
（14.60%）中特别丰富，在弹涂鱼（0.78%）中
也有少量，但不存在于水生鱼类和两栖动物中。
同 样， 梭 菌 科 Clostridiaceae、 莫 拉 氏 科
Moraxella、梭杆菌科 Fusobacteriaceae 在淡水鱼类
表 2 获取肠道 16S rRNA 数据进行比较的 40 个脊椎动物汇总
Table 2 Summary of 40 vertebrate species with available 16S rDNA data for comparisons
分组 Group 种类 Species
淡水鱼类 Freshwater fishes 鳙鱼（Aristichthys nobilis），蓝叉尾（Ictalurus furcatus），斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），鲤鱼（Cyprinus carpio），普通
鲮鱼（Leuciscus leuciscus），雅罗鱼（Leuciscus brandti），淡水石首鱼（Aplodinotus grunniens），金鱼（Carassius auratus），
高体雅罗鱼（Leuciscusidus），拟鲤（Rutilus rutilu），白鲢（Hypophthalmichthys molitrix），斑马鱼（Danio rerio）
海水鱼类 Seawater fishes 大西洋鳕（Gadus morhua），梭鲈（Sander lucioperca），褐蓝子鱼（Siganus fuscescens），虹鳟（Oncorhynchus mykiss），
麦奇钩吻鲑（Oncorhynchus mykiss），六带石斑鱼（Epinephelus sexfasciatus），棕点石斑鱼（Epinepehlus fuscoguttatu）
两栖性鱼类 Amphibious fishes 大鳍弹涂鱼（Periophthalmus magnuspinnatus），大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）
两栖动物 Amphibians 青蛙（纳林西牛眼蛙 Boophis narinsi，网纹纳林西牛眼蛙 B. reticulatus，里维拉小树蛙 Dendropsophus minutus，散氏
树蛙 D.sanborni，疣树蟾蜍 Hylodes asper，波拉西亚树蟾蜍 H. phyllodes，白边树蛙 Hypsiboas albomarginatus，黑史
密斯树蛙 H. faber，居氏白沫幼蛙 Physalaemus cuvieri，克氏树蟾 Phasmahyla cruzi，长鼻树蛙 Scinax fuscovarius，海
氏吻树蛙 S.hayii，绿鼻树蛙 S.littoralis，三纹吻树蛙 S.trapicheiroi，细趾蟾 Thoropa taophora），火蝾螈（Salamandra
salamandra）
陆生动物 Terrestrial animals 黑白疣猴（Colobus polykomos），人类（Homo sapiens），小鼠（Mus musculus），猪（Susscrofa domestica），猕猴（Macaca
mulatta）
其它 Others
软壁菌门 Tenericutes
浮霉菌门 Planctomycetes
放线菌门 Actinobacteria
疣微菌门 Verrucomicrobia
蓝细菌门 Cyanobacteria
CKC4 门 CKC4
拟杆菌门 Bacteroidetes
厚壁菌门 Firmicutes
变形菌门 Proteobacteria
梭杆菌门 Fusobacteria
大鳍弹涂鱼
Periophthalmus
magnuspinnatus
大弹涂鱼
Boleophthalmus
pectinirostris
草鱼
Ctenopharyngodon
idella
鲢鱼
Hypophthalmichthys
molitri
鳙鱼
Aristichthys nobilis
相对丰度 Relative abundance (%) 100
75
50
25
0
门 Phylum
图 1 弹涂鱼和草鱼、鲢鱼、鳙鱼宏基因组中注释的胃肠道
微生物门水平相对丰度比较
Fig. 1 Comparison of relative abundance of the gastrointestinal
phyla annotated in the metagenomes of mudskippers
and Ctenopharyngodon idellus, Hypophthalmichthys
molitrix and Aristichthys nobilis
第48页
38
中最为丰富（分别为 16.6%、3.3% 和 33.2%）；
在 弹 涂 鱼 中 比 较 丰 富（ 分 别 为 3.6%、4.0% 和
14.2%），但在其他 3 组中低于 1.5%、0.3%、6.0%。
已有研究发现，酪酸梭菌可以改善南美白对虾的
生长性能，增加体内粗蛋白含量，调节肠道消化
能力，增强对氨胁迫的肠道免疫功能［29］；产气
荚膜梭菌是鱼类中一种重要的食源性病原体，被
认为是鱼类的致病微生物［30］。
图 2 5 类物种的胃肠道微生物群的门（A）、纲（B）、科（C）水平分类组成
Fig. 2 Taxonomic compositions of gastrointestinal microbiota in five species at the phylum (A), class (B) and family (C) level
A
C
未分类 Unclassified
其它 Others
脱铁杆菌门 Deferribacteres
浮霉菌门 Planctomycetes
螺旋体门 Spirochaetes
疣微菌门 Verrucomicrobia
互养菌门 Synergistetes
蓝细菌门 Cyanobacteria
梭杆菌门 Fusobacteria
拟杆菌门 Bacteroidetes
厚壁菌门 Firmicutes
变形菌门 Proteobacteria
海水鱼类
Seawater fi shes
淡水鱼类
Freshwater fi shes
两栖性鱼类
Amphibious fi shes
两栖动物
Amphibians
陆生动物
Terrestrial animals
门 Phylum
相对丰度 Relative abundance (%) 100
75
50
25
0
B
海水鱼类
Seawater fi shes
海水鱼类
Seawater fi shes
淡水鱼类
Freshwater fi shes
淡水鱼类
Freshwater fi shes
两栖性鱼类
Amphibious fi shes
两栖性鱼类
Amphibious fi shes
两栖动物
Amphibians
两栖动物
Amphibians
陆生动物
Terrestrial animals
陆生动物
Terrestrial animals
相对丰度 Relative abundance (%) 100
75
50
25
0
未分类 Unclassified
其它 Others
螺旋体门 Brevinematae
芽孢杆菌纲 Bacilli
黄小杆菌纲 Flavobacteriia
甲型变形菌纲 Alphaproteobacteria
乙型变形菌纲 Betaproteobacteria
绿菌纲 Chloroplast
梭杆菌纲 Fusobacteriia
拟杆菌纲 Bacteroidia
梭菌纲 Clostridia
γ- 变形菌纲 Gammaproteobacteria
纲 Class
未分类 Unclassified
其它 Others
莫拉氏菌科 Moraxellaceae
普雷沃氏菌科 Prevotellaceae
毛螺菌科 Lachnospiraceae
S24-7
颤螺菌属 Ruminococcaceae
拟杆菌科 Bacteroidaceae
梭菌科 Clostridiaceae
丛毛单胞菌科 Comamonadaceae
弧菌科 Vibrionaceae
梭杆菌科 Fusobacteriaceae
科 Family
相对丰度 Relative abundance (%) 100
75
50
25
0
第49页
39
2.4 弹涂鱼与陆生动物胃肠道微生物比较分析
维恩图可以显示多样本 / 组中的共同 / 唯一
OTU 的数量。如果与 OTU 代表性物种结合，可
以获得不同环境的核心微生物组。通过文献找到
40 种物种的可用胃肠道宏基因组数据。OTU 集
的相关维恩图显示将有助于确定弹涂鱼和陆生动
物之间的关系。本研究发现，两栖弹涂鱼和陆生
动物（包括两栖动物和陆栖哺乳动物）肠菌之
间有 759 个 OTU 重叠；不同于鱼类的弹涂鱼与
陆生动物的 OTU 大部分来自 S24-7 以及毛螺菌
Lachnospiraceae、瘤胃菌 Ruminococcaceae、理研
菌 Rikenellaceae（图 3）。这些菌株的详细功能
值得进一步探索。
2.5 大弹涂鱼与草鱼宏基因组功能注释比较
基于所有弹涂鱼样本的宏基因组数据的功能
注释和丰度信息，选择每个样本中前 35 个功能类
别及其丰度信息来绘制热图并聚类以获得功能差
异。从图 4 可见，大弹涂鱼中宏基因组功能特征
与草鱼的功能特征具有显著差异，最显著的差异
是氨通道蛋白 AmtB，其在大弹涂鱼微生物群中
比在草鱼中更丰富，并且其高氨运输能力与弹涂
鱼适于潮间生活的氨抗性特征相关［1-2］。
3 讨论
鱼类微生物组研究目前在鱼类研究中的代表
性较低，特别是与其他动物宿主相比具有独特生
理和生化差异的两栖弹涂鱼。因此，本研究首次
研究了鱼类、两栖动物和陆地脊椎动物之间的胃
肠道微生物群差异或重叠。两栖鱼类、海水鱼类、
淡水鱼类、两栖动物和陆生动物的进化谱系虽然
清晰，但胃肠道微生物群和相应的宏基因组的进
化仍然不明确。
3.1 大弹涂鱼和大鳍弹涂鱼之间的胃肠道微生物
群组成的差异
为了研究弹涂鱼胃肠道微生物在两栖习性中
的作用，本研究选择大部分陆栖物种大鳍弹涂鱼
和相对偏水生大弹涂鱼来收集胃肠道微生物并对
其进行后续的 16S rDNA 扩增子测序。尽管这两
种弹涂鱼物种具有密切的遗传关系，但它们在地
理标志微生物类别、多样性和丰富程度之间存在
显著差异，这可能是由于不同的栖息地和饲养偏
好。本研究发现，大弹涂鱼胃肠道微生物中蓝细
菌丰度较高，这可能与其更多的水生生活方式和
图 3 弹涂鱼、两栖动物和陆生动物胃肠道微生物中不同
典型 OTU 科水平的分类组成
Fig. 3 Taxonomic compositions of various typical OTU in
gastrointestinal microbiota of mudskippers,
amphibians and terrestrial animals at family level
未分类 Unclassified
其它 Others
普雷沃氏菌科 Paraprevotellaceae
拟杆菌科 Bacteroidaceae
厌氧支原体科 Anaeroplasmataceae
理研菌科 Rikenellaceae
埃希菌科 Mogibacteriaceae
梭菌科 Clostridiaceae
鞘脂杆菌科 Sphingobacteriaceae
瘤胃菌科 Ruminococcaceae
毛螺菌科 Lachnospiraceae
S24-7
相对丰度 Relative abundance (%) 100
75
50
25
0
科 Family
两栖性鱼类
Amphibious fi shes
两栖动物
Amphibians
陆生动物
Terrestrial animals
大弹涂鱼
Boleophthalmus
pectinirostris
草鱼 1
Ctenopharyngodon
idella 1
草鱼 1
Ctenopharyngodon
idella 1
图 4 大弹涂鱼与草鱼宏基因组的功能注释热图
Fig. 4 Heat map of function annotation from the
metagenomes of Boleophthalmus pectinirostris
and Ctenopharyngodon idellus
第50页
40
对藻类的偏好有关［1-2］。另外，大弹涂鱼中胃肠
道微生物群多样性较大鳍弹涂鱼高，而这与偏植
食性动物的胃肠道微生物多样性通常较高是一致
的［19-20］。
3.2 弹涂鱼、水生鱼类和陆地动物的胃肠道微生
物群特征比较
鱼类（弹涂鱼和草鱼、鲢鱼、鳙鱼）胃肠道
微生物类别在门的水平上相对稳定。尽管每种门
的丰度在不同鱼类中变化很大，但最丰富的门是
厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和变形菌门。然
而，一个显著的例外是 CKC4 门，它仅在草鱼、
鲢鱼、鳙鱼的鲤科鱼类中普遍存在，在弹涂鱼中
仅存在 0.21%。为了仔细检查家族层面的差异，
本研究发现许多微生物菌株只存于两栖弹涂鱼和
陆生动物，如瘤胃菌科 Ruminococcaceae 和毛螺
菌科 Lachnospiraceae，特别是 S24-7，表明两栖
弹涂鱼通过细菌来适应陆地。研究还发现，大弹
涂鱼中的黄杆菌比其他鱼类多，检测到胃肠道微
生物群中的肠球菌菌株丰度为 0.07。据报道，肠
球菌菌株产生 AMP 样物质并且对从病鱼中分离的
病原菌表现出广谱抑制，特别是对革兰氏阴性菌
冷黄杆菌 Flavobacterium frigidarium、果胶弧菌
Vibrio pectenicida、对虾弧菌 V.penaeicida 和美人
鱼发光杆菌 Photobacterium damselae［31］。在弹涂
鱼胃肠道中肠球菌菌株和致病性黄杆菌之间可能
存在平衡关系，因此弹涂鱼可以在这种不利环境
中忍受相对高丰度的黄杆菌。在健康的弹涂鱼个
体中，这种病原体的相对高丰度表明两栖鱼可能
已经对不同生活栖息地的致命病原体产生了特殊
的抗性。弹涂鱼这种强大的免疫特性有待进一步
研究。
3.3 核心微生物群和影响胃肠道微生物群的关键
因素
许多因素促成了硬骨鱼类胃肠道微生物群
的组成，包括宿主遗传、环境、胃肠道生理、细
菌共生体和营养［32］。核心微生物组，即环境中
所有鱼类个体中存在的微生物群落成员，已经
成为研究胃肠道微生物群落科研人员的主要目
标［32-34］。
总 体 而 言， 包 括 海 水 鱼 类［34］ 和淡水鱼
类［26,35-38］在内的胃肠道微生物群主要是变形菌门，
其次是梭杆菌门和厚壁菌门，以及拟杆菌门、放
线菌门和疣粒菌门［38］，占总菌群的 90%，每个
主要门的含量在不同物种中都有显著差异。本研
究发现弹涂鱼的胃肠道微生物群同时拥有陆地、
淡水、海洋和两栖群体的典型家族，这与弹涂鱼
的水陆过渡和咸淡水界面栖息的特征情况非常吻
合［2］。在一定程度上，这一发现也为生态环境
和栖息特点影响核心微生物菌群的假设提供了证
据，即在过渡阶段两栖性的弹涂鱼依靠多样的肠
道微生物来应对不同环境。
3.4 与弹涂鱼两栖适应性相关微生物菌株
弹涂鱼是两栖鱼类，但很少有关于其先天免
疫系统成分的系统研究，尤其是当免疫力来自胃
肠道微生物群对病原体屏障的研究。本研究首次
分析了两种代表性两栖弹涂鱼（大弹涂鱼和大鳍
弹涂鱼）的胃肠道微生物群，并对其中的微生物
进行注释，以探讨胃肠道中是否存在特殊菌株或
抗菌肽以适应潮间带复杂多变的不利环境（如高
氨低氧）。
本研究结果表明，弹涂鱼中不同 OTU 最多
来 自 S24-7、 毛 螺 菌 Lachnospiraceae、 瘤 胃 菌
Ruminococcaceae、 理 研 菌 Rikenellaceae， 这 提
示以上菌株对陆地生物独特的功能值得研究。
从纲水平菌群比较大弹涂鱼和草、鲢、鳙鱼的
胃肠道微生物组成，黄杆菌在大弹涂鱼中含量
高于其他海洋鱼类和淡水鱼类。另外，瘤胃菌
Ruminococcaceae 和毛螺菌 Lachnospiraceae 在弹涂
鱼、两栖类和陆栖类群中相对丰富。
值得注意的是，S24-7 家族在陆地动物肠道
微生物群中占有独特地位（14.60％），在弹涂鱼
（0.78％）中也可以找到，但在鱼类和两栖动物
中均不存在，该家族表现出对于恒温性肠道的强
烈偏好性，核心代谢为发酵及厌氧细菌［38］。这
使得该类研究中大部分为陆生动物群体。据报道，
具有脲酶活性的 S24-7 产生脲酶，能够分解尿素
产生氨，增加血液循环中的氨含量，由此推测弹
涂鱼的氨耐受能力强，与胃肠道中的 S24-7 存在
一定关联。另外，多项研究报道了 S24-7 家族成
员丰度的改变与不同的环境条件有关 ，且至少有
一些成员是先天免疫系统的目标，该家族涉及宿
主 - 微生物相互作用，并且能够影响肠道功能和
健康，具体表现在其可以改变宿主肠道中的局部
免疫系统，细菌细胞在正常生理状态下不与肠细
胞接触；然而它们可能会将 DNA 释放到粘液层中，
通过特异性受体（如 Toll 样受体 9）影响宿主先
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