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转查尔酮异构酶（CHI）基因矮牵牛花色改变及其花器官变异的研究

花匠小妙招
2024-09-02 20:47

　　花色是观赏植物重要的质量性状和经济指标之一。虽然自然界中的花色种类繁多，但是一些重要花卉的色系却有限，如玫瑰、康乃馨、郁金香等缺乏蓝色和紫色。因此，经过花色改良的观赏植物具有极高的观赏、经济价值，和广泛的市场前景。采用传统杂交育种和定向育种技术虽然对花色改良作出了巨大贡献，但存在多种局限，且费时费力、周期长、效率低等；而采用基因工程技术能有效进行花色的定向育种，其改良效果通过目测和少量辅助手段即可判定。关于花色结构基因查尔酮异构酶CHI(Chalcone Isomerase)基因对花色改变的直接报道很少，因此，本论文选用了CHI基因为目的基因，以纯深红色和纯白色矮牵牛(Petunia hybida Vilm.)为材料，研究了CHI基因的共抑制和反义抑制以及表达产物增加对花色改良的作用，并在花色改变植株中首次观察到花器官变异。论文研究内容与结果如下： 1．水母雪莲CHI基因的克隆及其序列分析以水母雪莲(Saussurea medusa Maxim．)花的mRNA为模板，根据已知水母雪莲CHI基因(AF509335)序列，设计一对特异PCR引物，用RT-PCR方法扩增得到CHI基因。用TA连接法克隆到pUCm-T载体上，得到重组质粒p~(UCm-CHI)。序列分析表明，该CHI基因全长810bp，ORF框全长699bp，编码蛋白长232个氨基酸(含一个终止子)，预测分子量24913D，等电点PI为4.75。与以公布的CHI序列ORF完全一致。 2．CHI基因的正向和反向植物表达载体的构建用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切p~(UCm-CHI)和中间载体pTriplEx2，回收、连接目的片段与载体，构建中间载体p~(TripCHI)，选择正向重组质粒。用KpnI和XbaI双酶切p~(TriCHI)和表达载体质粒p~(BinAR)，回收、连接目的片段与载体，构建成正向植物表达载体p~(BinCHI+)。用KpnI和XbaI双酶切p~(TripCHI)和表达载体质粒p~(BL19)，回收、连接目的片段与载体，构建成反向植物表达载体p~(BLCHI-)。采用冻融法把p~(BinCHI+)和p~(BLCHI-)分别转化农杆菌EHA105，LBA4404。 3．根癌农杆菌介导的CHI基因对矮牵牛的遗传转化切取纯深红色矮牵牛无菌苗叶片，大小为5×5mm~2，以OD_(600)=0.2的农杆菌菌液感染西南农业大学硕士学位论文15min，暗培养3~4d取出，用含soom叭Cef的液体Mso培养基振荡脱菌2h，无菌水冲洗5次即用无菌滤纸吸干水分，然后接入Msl+Zoomg/L Cef的培养基上延迟筛选3~6d，再转入MSI+2 oom岁L Cef+50m留L Km培养基上进行筛选分化培养.将得到的长约Icm的芽切下接入1/2 Ms+l。mg/L Km中进行生根筛选，移栽能够正常生根的抗性苗并做进一步的鉴定。纯白色矮牵牛在延迟筛选培养和抗性选择培养中用MsZ代替Msl，其余条件不变。分别用EHA 105(pB‘ncH，+)和用LB^4404(pBLcH，一)转化纯深红色矮牵牛，其所得转化株系命名为RcH，+和R““，一。用EHA 105(pBinc川+)转化的纯白色矮牵牛，所得转化株系命名为wC“卜。未转化的纯深红色矮牵牛对照用R“表示;未转化的纯白色矮牵牛(对照)用w。表示。统计结果，RcH卜获得28株存活的抗性苗;RCHI一获得株存活的18株抗性苗:wCHI十获得存活的抗性苗15株.4.转化植株的2 x MPCR鉴定和转基因植株花色素昔含量的测定为避免内源CHI基因的干扰，分别以CaMV35S启动子和NPTll基因为目的片段进行普通PCR检测。对普通PCR检测两种结果均为阳性的转化株系，又同时以355和NPTll为目的片段进行2 x MPcR检测，结果得到TG一RCH卜n二l一20(表示检测结果为阳性的转基因矮牵牛RcH卜有加个株系)、Te一RCH，一n=z一10和To一wcH，+n=l一10。对2“MPCR检测结果阳性，且花色发生明显变化的TG-RcH卜，TG-R“H1一和TG一wcHI+各选取其不同花发育时期的花为材料，用R”和w”为对照，提取花中的花色素昔，用比色法测量其相对含量.结果表明，To一RcH，+和TG一R CH，一的花色素昔含量比Ro低一些;To一R CH，一的花色素昔含量比TG一RCH卜略低一些;TG一wcH卜花色素昔含量比w“略高一些。5.转CHI基因矮牵牛花色的改变与花器官变异分析对TG一RcH卜、TG一RCHI一和TG一wcH卜株系的花发育各个时期花色进行全面观察记录，特别对花发育的V期及其以后2d内盛开的花，观察性状主要是各期花色变化、花瓣上颜色表达分布、花瓣上的网状纹路等情况。结果发现，TG一RcH卜和TG一RcH，一的花瓣颜色均比R0淡，都出现浅粉红颜色并带深色网状纹路，有的还带有不同表达模式的白色斑块;TG一R cHI一株系还具有一种新的花色模式，即花瓣上具有类似于叶部彩斑中的扫迹斑的深色纹路.TG·wC川十株系的花瓣颜色均比w0略深一些，花冠边缘具有浅粉红色的纹路，或是花冠中部具有浅粉红色的斑块，并且其颜色变化随温度升高而变浅。对TG一RcH卜、TG一R“川一和TG一wCHI十株系的花发育各个时期花器官变化进行全面观察记录，观察性状主要是花芽形状、曹片数、花冠管粗细、花冠大小、花冠裂片、雌蕊与雄蕊数等情况。观察中发现TG一RcH卜中出现了4个变异花器官，在TG一RcH卜中出现了8类变异花器官，而在TG一wcH卜中则未观察到变异花器官。观察到一种具有独特花器官表型和全新花