导读
近年来，基因疗法已成为了癌症治疗的一种新兴策略，展现出了极大的潜力。
基因治疗是通过将外源正常基因导入人体靶细胞，以修复、替换或调节患者体内的基因，从而在根源上实现治疗目的的一种技术。在实际应用中，基因治疗通常通过使用质粒（一种最初从细菌中获得的小型环状分子）将治疗性DNA传递到靶细胞。据报道，全球已开展485项质粒DNA基因治疗试验，多数处于I期或I/II期，表明基于质粒DNA的癌症治疗手段仍处于研究和发展阶段。
今天，我们一起走进基于质粒DNA基因治疗的设计，靶向性的提高方法以及应用策略和递送方式等前沿动向[1]。
图1 质粒DNA在体内细胞表达的机制图
一、质粒DNA的设计
根据质粒DNA的定义，为了使细胞按照质粒上的基因指令制造治疗用的蛋白质，质粒必须至少包含一个有效的表达盒。由于质粒是环状DNA分子，这种结构的稳定性使它能够包含多个基因而不容易断裂，同时质粒还可以配备多个启动子。因此，一个质粒可以设计为携带并同时表达多个基因。
质粒的设计方式包括：独立表达（每个基因配有自己的启动子）、多顺式系统（多个基因由同一个启动子控制）以及融合蛋白（将两个基因序列结合在一起，中间添加连接子序列）。
图2 质粒DNA的设计方式
此外，质粒可以被设计为表达各种治疗蛋白，例如直接杀死癌细胞的治疗蛋白（如促凋亡蛋白、激活前药的酶、细胞毒性肽或细菌毒素等）、特定的siRNA分子、抗原、细胞因子或单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAbs）。其中，编码产生的抗原或细胞因子是通过刺激淋巴细胞或抗原呈递细胞（Antigen Presenting Cells，APCs）等免疫细胞对癌细胞进行破坏。
图3 质粒DNA的治疗策略
在确定质粒要表达的基因个数和蛋白质后，密码子的优化也非常重要。例如，富含鸟嘌呤和胞嘧啶的序列可以提高mRNA的水平，从而增强表达效果[2]。
二、DNA疫苗靶向性的实现
2.1
肿瘤特异性启动子的选择
肿瘤特异性启动子能够在癌细胞中活跃，而在正常细胞中不表达。常见的肿瘤特异性启动子包括：（1）人类端粒酶逆转录酶（The Promoter of Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）启动子：一种通过甲基化在不同类型的肿瘤组织中活跃，在大多数体细胞中没有活性；（2）BIRC5/survivin启动子：仅在多种癌症中表达，不在正常细胞中活跃，在临床上具有潜在的前列腺癌诊断应用；（3）Erb-B2受体酪氨酸激酶2（Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2，ERBB2）基因启动子：在20-25%的肿瘤中表达，是乳腺癌的候选启动子；（4）甲状腺转录因子-1（Thyroid Transcription Factor-1，TTF-1）启动子：在小细胞肺癌和腺癌中活跃；（5）前列腺特异性抗原（Prostate-specific Antigen，PSA）启动子：用于前列腺癌，它在前列腺癌细胞中高表达，但在正常前列腺细胞中的表达较低。
2.2
肿瘤特异性抗原的选择
DNA疫苗通常含有肿瘤特异性抗原（Tumor Specific Antigen, TSA）或肿瘤相关抗原（Tumor-Associated Antigen, TAA），能够诱导机体产生特异性抗肿瘤效应，激发机体自身的免疫保护机制，是一种主动免疫的治疗方法。肿瘤新抗原是在特定条件下新出现或新识别的TSA，在肿瘤细胞中特异表达，在正常组织中不存在。利用这些新抗原不仅能够增强免疫应答，还能实现个性化的治疗方案，是治疗肿瘤的理想靶点。表1整理了部分肿瘤抗原的分类情况。
表1 部分肿瘤抗原
三、DNA疫苗的应用策略
3.1
编码融合蛋白的DNA疫苗
单独使用DNA疫苗时，免疫刺激效果往往不佳。为提高免疫反应，融合其他抗原或免疫刺激蛋白是有效的策略之一。
（1）抗原融合到细胞器靶向序列：1999年，Chen等人[3]展示了在小鼠宫颈癌模型中，HPV-16 E7抗原与LAMP-1和TPA信号肽融合的DNA疫苗比单独使用E7抗原能产生更强的抗肿瘤效果；
（2）抗原与热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）的融合：HSP70作为分子伴侣不仅运输肿瘤衍生的免疫原性肽，还能刺激抗原呈递或作为自然免疫原，从而刺激抗肿瘤反应；
（3）抗原与细胞因子融合：细胞因子通过DNA疫苗接种诱导免疫激活或者与抗原融合，引发更强的特异性反应；
（4）抗原融合到其他免疫刺激序列：破伤风毒素C片段的Dom序列和B细胞活化因子（B-cell-activating factor，BAFF）等被报道能在对应小鼠模型中增强抗肿瘤作用[4, 5]。
3.2
与免疫检查点阻断疗法的联合使用
DNA疫苗与免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法的结合在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力。ICB疗法通过阻断免疫检查点，如PD-1/PD-L1或CTLA-4/B7-1/B7-2等，来增强T淋巴细胞对癌细胞的免疫应答。与DNA疫苗结合，可以协同增强抗肿瘤免疫效果。研究表明，这种联合疗法在黑色素瘤、肥大细胞瘤、结肠癌等肿瘤模型中能够显著抑制肿瘤生长以及特异性T-细胞的增加，提高了小鼠的生存率。
3.3
制备单克隆抗体
mAbs是由一个单一B细胞克隆产生的高度特异性抗体，能够针对特定抗原表位。传统的mAbs通常通过杂交瘤技术制备，但其生产过程复杂且成本高。近年来，DNA编码单克隆抗体（DMAb）在癌症治疗中显示了其潜力，有效克服了传统单克隆抗体的一些局限性，并且具有显著的治疗效果。2016年，Kim等人[6]报道，使用编码抗erbB-2 DMAb的质粒治疗携带erbB-2阳性人乳腺癌细胞系BT474的小鼠，能够持续表达抗体，并且其抗肿瘤效果与四次静脉注射Herceptin抗体相当。
四、质粒在癌症治疗中的递送方式
DNA疫苗的最简单递送方式是裸DNA疫苗注射，其注射方法多样，包括肌肉注射、皮内注射、肿瘤内注射等。然而，裸DNA疫苗也面临一些挑战，如递送效率低、免疫原性不足以及抗原表达时间较短。为了提高效果，通常会与其他递送方法结合使用，以改善DNA质粒进入细胞的效率。这些方法主要分为物理方法和化学方法。物理方法，如电穿孔法和基因枪等，通过直接物理手段将质粒DNA导入细胞，实现疫苗的递送。这些方法具有操作简便、效率较高的优点，但也可能对细胞造成一定的损伤。化学方法则主要依赖于载体转染法，其中脂质体类载体是常用的转染载体。脂质体类载体能够与质粒DNA形成复合物，可以包裹DNA质粒或将其封装在内部水相中，具有高稳定性、高细胞摄取率和低毒性的优点。
图4 质粒DNA的递送方式
五、RNA疫苗
RNA疫苗，特别是mRNA疫苗，近年来因其在SARS-CoV-2疫情中的成功应用而获得广泛关注。这类疫苗利用合成的mRNA作为抗原编码的载体，直接在体内指导细胞合成目标蛋白，从而触发免疫反应。RNA疫苗与DNA疫苗类似，具有易于设计和生产迅速、经济高效的优势，并且能够有效诱导特异性体液和细胞免疫反应。然而，它们的主要挑战包括低稳定性，需要在低温下储存和运输，并且可能引发不必要的炎症反应。尽管如此，mRNA疫苗在COVID-19大流行中已显示出其有效性和安全性，成为疫苗研发的重要方向之一。
结语
DNA作为生命的基本遗传物质，其重要性毋庸置疑。在疫苗研发领域，DNA疫苗展现出巨大的潜力，成为一种新型的疫苗选择。
质粒，作为DNA疫苗的关键载体，极大地推动了DNA疫苗的发展，使得能够编码抗原蛋白的外源基因更有效地导入宿主细胞，从而诱导出强有力的免疫应答。当前，DNA疫苗具备安全性高、生产简便、成本效益好等显著优势，且在传染病和癌症等领域展现了广泛的应用前景。
然而，DNA疫苗仍面临一些挑战，如如何提高免疫原性和优化接种方法等。我们有理由相信，在不久的将来，DNA疫苗将克服这些挑战，实现更高效、更广泛的免疫保护。
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参考文献
[1]GINN S, MANDWIE M, ALEXANDER I, et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update [J]. .J Gene Med, 2024, 26: e3721.
[2]GRZEGORZ K, LESZEK L, FANNY C, et al. High guanine and cytosine content increases mRNA levels in mammalian cells [J]. PLoS Biol. 2006, 4, e180.
[3]C H C, H J, K W S, et al. Gene gun-mediated DNA vaccination induces antitumor immunity against human papillomavirus type 16 E7-expressing murine tumor metastases in the liver and lungs [J]. Gene Ther.1999, 6, 1972–1981.
[4]WANG C, ZAINAL N, CHAI S, et al. DNA Vaccines Targeting Novel Cancer-Associated Antigens Frequently Expressed in Head and Neck Cancer Enhance the Efficacy of Checkpoint Inhibitor [J]. Front. Immunol. 2021, 12, 763086.
[5]WU C, WU F, HSU Y, et al. Enhanced anti-tumor therapeutic efficacy of DNA vaccine by fusing the E7 gene to BAFF in treating human papillomavirus-associated cancer [J]. Oncotarget. 2017, 8, 33024–33036.
[6]KIM H, DANISHMALIK S, HWANG H, et al. Gene therapy using plasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2 [J]. Cancer Gene Ther. 2016, 23, 341–347.
