控制桃花/果实果皮颜色的基因及其应用

• 花匠小妙招
• 2024-12-16 22:30

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种控制桃花/果实果皮颜色的基因及其应用。

背景技术：

桃[prunuspersica(l.)batsch]属于蔷薇科，李属，桃亚属果树植物，是我国重要的落叶果树之一。据不完全统计，2019年我国桃栽培面积超过1400万亩，占世界栽培总量的50％以上(fao)。近年来，果树重要经济性状的基因定位和分子辅助选种体系取得了重要进展(fresnedo-ramírez等，2016)，完成了许多经济性状基因定位和克隆，包括分枝角度(hollender等，2018)、抗绿蚜(张南南等，2017)、节间长度(lu等，2016)、矮化(鲁振华等，2017)、酸/非酸(cao等，2016；eduardo等，2014)、果形圆/蟠(dirlewanger等，1999；cao等，2016；lópez-girona等，2017)、粘/离核(dirlewanger等，2004；gu等，2016)、果肉质地(pan等，2015；eduardo等，2015)等，这些都为桃主要性状的遗传改良和基因克隆奠定了基础。但特异资源优异基因的挖掘和利用进展仍比较缓慢，限制了其进一步的利用和遗传机制解析。

中国作为桃的起源中心，有丰富的遗传资源，叶有红叶和绿叶；花有粉花、红花、淡粉、深红、白花和绛红；果肉有红肉、黄肉、白肉和绿肉；果皮有亮红皮、红皮、深红皮等。其中，果实的色泽是重要的商品性状之一，决定着果实的商品价值。近年来，“纯黄”和“纯白”特异类型桃深受亚洲消费者的喜爱，具有较高的商品价值。生产者主要通过套袋获得“纯色”类型。套袋措施既增加了用工成本(约450元/亩)又降低了果实可溶性固形物(约1.5％)。

因此，利用特异资源研究桃外果皮颜色，特别是花青苷“缺陷型”形成的遗传机制具有重要的科学价值和产业意义。色泽是桃果实最重要的品质性状之一，由外果皮和中果皮共同决定。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种控制桃花/果实果皮颜色的基因及其应用。

技术方案：一种控制桃花/果实果皮颜色的基因，所述基因序列如seqidno.1所示。

含有上述基因的质粒。

沉默上述基因的病毒。

上述基因作为靶点在调控桃花/果实果皮颜色中的应用。

利用花/果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘白花山碧桃’和“05-2-144”，构建杂交群体，对控制花/果皮颜色缺陷的基因进行精细定位，确定候选基因，验证基因功能，开发分子标记并应用于分子标记辅助选种。主要通过如下方法得到：

(1)基于“05-2-144”自交后代分离群体，使用bsa-seq，将该基因定位在染色体03上的0.421951mb和3.227115mb之间；

(2)对151个个体进行基因分型后，将候选基因精细定位在536.154kb间隔内，整合了重测序和rna序列数据，将基因pp3g013600视为候选基因；

(3)基于[(中油4号×白花山碧桃)×中油4号]的bc1群体的基因型和表型将，控制花/果皮颜色基因定位在染色体03的0mb和1178149mb之间；同时利用bc1s1群体(18-17)的75个单株，将控制目标性状的基因定位在染色体03的699325bp(引物pp03-indel-69932)5和1251352bp(引物pp03-snp-1251352)之间，物理距离区间为552.027kb；

(4)基因组dna的提取采用改良ctab高通量法，略作修改；

(5)使用参照“05-2-144”的基因组的primer3(可在http://primer3.ut.ee获得)设计引物。pcr扩增以40μl反应体积进行sanger测序，以15μl反应体积进行indel分析；参考中油4号和白花山碧桃的基因组重测序数据，开发snp和ssr分子标记，进行目标性状的精细定位；

(5)以indel为基础，开发了indel标记，并对122份非白色和6份白色类型的材料进行了验证，与目标性状100％连锁；

(6)病毒诱导的gst基因沉默降低了花青素的积累并降低了gst的表达水平；

(7)综合以上结果，确定控制桃花/果皮颜色的基因，开发了分子标记，建立了目标性状的分子标记辅助选种体系。

有益效果：利用花/果皮颜色“缺陷型”的遗传资源‘白花山碧桃’和“05-2-144”，构建杂交群体，对控制花/果皮颜色缺陷的基因进行精细定位，结合重测序、rna-seq等数据确定了候选基因，验证基因功能，开发分子标记并应用于分子标记辅助选种。该发明为分子标记辅助选种，创制新品种，为纯色(纯黄和纯白)果实外观品质的改良提供了技术支撑，同时为明确桃果皮颜色“缺陷型”的遗传和调控机制奠定基础。

附图说明

图1来源‘05-2-144’的f2花和果实性状颜色。注：a为种植在育种圃花分离群体；b-d为花颜色表型(白、粉和红色)；e-f分别为嫩芽和幼果的果皮颜色；

图2基于‘05-2-144’f2群体的bsa-seq(a和b)和白花山碧桃来源的bc1基因分型目标性状的初定位(c)；

图3基于两个群体控制桃花/果皮颜色性状(白/非白)基因的精细定位。注：a为来源‘05-2-144’目标性状的精细定位(151个f2单株)；b为‘白花山碧桃’来源目标性状的精细定位(75个bc1s1单株)；

图4基于rna-seq精细定位区14个基因的表达量(fpkm)注：s1为花蕾期；s2为盛花期；

图5pp013600两种不同等位基因(2bp插入和5bp缺失)。注：a为两个不同来源亲本的bam文件中突变类型；b为基因的两种不同突变类型示意图；c为编码蛋白序列差异(野生型为215aa、等位i型为167aa、等位ii型为175aa)；

图6vigs技术诱导目标基因沉默表型图(目标基因沉默导致桃果肉花青素积累降低和基因表达量下降)；

图7基于等位基因开发的分子标记在122非白花品种(系)和6份白花野生类型的连锁关系。

具体实施方式

实施例1

(一)、植物材料、表型和定位群体

以中国农业科学院郑州果树研究所(郑州)桃育种种质资源库为材料，利用‘05-2-144’自花授粉获得的151株f2桃群体进行基因定位。05-2-144是由‘97矮化’桃和‘鸳鸯垂枝’杂交后代自花授粉的f1个体，呈白色和紫色花瓣的花。对于bsa-seq，分别采集了20个非白色(红色和粉色)和白色花个体的叶片。2014年和2015年，对f2分离群体进行采集，以获得足够的个体进行精细制图。一年生桃树的白色和非白色。另外，我们用肉眼来区分红色、粉红色和白色花瓣型的表型。来源白花山碧桃目标性状的定位群体为[(中油4号×白花山碧桃)×中油4号]的bc1群体和bc1s1(18-17)，其中，用于精细定位的群体75个单株，包括20个白花和55个非白花。

(二)、不同花药品种花色及花青素含量及水平的研究

根据表型，取非白(红、粉红)和白色花瓣，立即在液氮中冷冻，然后用带有氧化锆珠的混合磨机(mm400，retsch)在30hz下冷冻1.5min。100mg粉末在4℃下用1.0ml70％甲醇水溶液萃取过夜。在10000克离心10分钟后，提取物被吸收，在lc-ms分析之前过滤，花青素含量由acquity超高效液相色谱系统(waters，milford，ma)测定。

(三)、基于bsa-seq的dna提取、定量及基因定位

(1)基因组dna的提取、定量

选择分离群体个体的幼叶，用镊子将其放入1.2ml八行引流管底部。用ctab法分离总dna，用纳米滴分光光度计(thermo-fisher-scientific)测定总dna的质量和数量。将20个dna样本按相等比例混合，生成白色和非白色花瓣池，用于illuminahiseqtmpe150测序。

(2)snp开发的引物设计

参考桃基因组(version2.0)序列，采用primer3input(version4.0)(http://primer3.ut.ee/)设计引物，引物参数为退火温度在60-62℃之间，引物长度20-25bp，开发基于sanger测序的snp标记，选择约每1mb设计1对引物，扩增片段长度约为700-1600bp。

(3)pcr反应体系以及snp标记的获得

pcr扩增体系总体积为40μl，具体组分如下：

混匀后，在离心机(5810r，eppendorf)离心，并在pcr仪(eppendorf)上进行扩增。pcr扩增程序为95℃3min；95℃30s，56.5℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。

对亲本、后代各4个单株进行pcr扩增，pcr扩增成功后，产物送上海生工生物工程有限公司进行sanger测序，将测序结果在contig软件中打开，序列对齐后寻找与目标性状连锁的多态性snp标记。

(4)基于重测序数据的标记验证和基因精细定位

基于bsa-seq的delta(snp-index)分析结果(目标区值为0.667)，利用indel标记对含有花(或果皮)颜色性状的候选区域进行了验证，并在page中进行了检测。为了精细定位，参考重测序数据，在‘05-2-144’亲本的作图区域内选择杂的snp；初定位区选择单株18-17的杂合snp和indel。用40μl反应体积进行sanger测序，15μl反应体积进行indel分析。

(四)、rna-seq分析

确定精细定位区的基因表达水平，并对3个重复的花蕾期和开放期的花瓣(红、粉、白)进行rna-seq分析。总rna提取采用试剂盒planttotalrnaisolationkit(上海生工生物工程股份有限公司)，经凝胶、agilent2100bioanalyzer和agilentrna6000nanokit检测、oligo(dt)富集mrna后使其短片段化，以短片段mrna合成双链cdna，纯化后进行末端修复、加碱基a、加测序接头处理，最后进行pcr扩增完成测序文库制备，三个生物学重复在illuminahiseqxten进行二代测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)。将rawreads去掉通用接头，采用tophat(v2.0.12)软件将reads与桃参考基因组(version2.0)比对后，分析基因的表达量、结构变异、go途径等分析。基因表达分析采用htseq、差异表达基因分析采用dgerpackage和deseq2(loveet等，2014)，差异表达阈值参数设为>2或者<0.5(p<0.05)，表达量fpkm值小于1的过滤掉；基因表达水平分析采用htseq软件，使用的模型为union；go富集分析采用的软件方法为goseq(young等，2010)；keggpathway分析使用kobas(2.0)进行富集分析；snp分析采用gatk2。

(五)、基于vigs分析目标基因的功能验证

用非白色cdna作为模板扩增313bp，并用clonexpressii一步克隆试剂盒(vazyme)与trv2连接。将trv1，trv2和trv2-gst分别转移至农杆菌gv3101中，并在28℃下用lb培养基进行培养，以使od600达到0.8-1.0。将沉淀物以8000rpm离心后重悬于农杆菌缓冲液(10mmoll-1mgcl2、10mmol·l-1mes和400μmoll-1as，ph5.6)中，以使od600达到0.8～1.0。将ptrv2或ptrv2-pp3g013600分别与ptrv1以1：1的比例混合。静置3小时后，将混合物注入到红肉桃果实中。每个重复注射10个果实，设置3个生物学重复。

(六)、候选基因序列特征分析

根据精细定位区间，结合参考桃基因组注释(version2.0)，确定目标基因物理区间所包含的基因。根据rna-seq测序结果，分析不同类型外果皮的基因表达差异，筛选出差异表达的基因；采用igv可视化软件分析亲本的重测序bam文件数据，结合桃基因注释信息，比较精细区域内亲本的序列差异，综合以上结果初步确定候选基因。根据目标基因变异信息设计的引物在更多自然群体中验证，最终确定候选基因。

(七)、目标基因的qpcr分析

用于基因表达水平总rna提取、cdna双链的合成采用与以上相同的试剂和步骤。real-timeqpcr反应在480ii(roche，瑞士)上进行。采用primer3.0软件(http://primer3.ut.ee/)设计pcr引物，其退火温度设定在60～63℃之间，目的片段在编码区5’端，长度约250bp跨2个以上外显子，已actin为内参基因。

表1用于定位的引物信息。

序列表

<110>中国农业科学院郑州果树研究所

<120>控制桃花/果实果皮颜色的基因及其应用

<141>2021-05-28

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