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实验十二细胞中微丝的显示与观察

花匠小妙招
2024-12-17 22:33

一、实验目的
　　掌握微丝的显示方法，了解光镜下细胞骨架的基本形态结构。
二、实验用品
　　材料：盖片培养的成纤维细胞或洋葱表皮细胞、
　　器材：光学显微镜、镊子、小平皿、载玻片、吸水纸、37℃恒温箱。
　　试剂：PBS液（PH7.2）2%tritonX-100液、M-缓冲液，3%戊二醛液、0.2%考马斯亮兰染液
三、实验内容
　　（一）原理
　　　　真核细胞中的细胞骨架可通过电镜来观察，但由于设备条件和操作技术比较复杂，难于普遍应用。1989年S.D.Pone曾用考马斯亮兰染液培养人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。
　　　　当细胞用适当浓度的triton“X”—100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，是一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，有利微丝的显示，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
　　（二）方法
　　　　1.在培养人皮肤纤维细胞进行继代培养时，将消毒的薄玻片放入培养瓶中，当生长在玻片条上的细胞尚未致密时，取玻片条放入小培养皿中，或将0.5×0.5cm大小的洋葱表皮细胞置于小培养皿中，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，每次3分钟。
　　　　2. 将玻片条（洋葱表皮细胞）浸在2%triton“X”-100液中，置于37℃恒温箱处理20~30分钟，以除掉骨架以外的蛋白质。
　　　　3.立即用M—缓冲液轻轻地洗涤3次，每次3分钟，使细胞骨架稳定。
　　　　4.在3%戊二醛液中固定10分钟，再以PBS液洗3次，每次5分钟，吸去多余液体。
　　　　5.滴加0.2%考马斯亮兰染液染色20分钟，自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封片。
　　（三）结果
　　　　在光镜下可见一些充分伸展的成纤维细胞中，分布着被染成深兰色的细直纤维，这就是由许多微丝聚集成的最大的微丝束，也称张力纤维，它们多沿细胞长轴方向、细胞突起而分布，在有些细胞（多角形）中则一组组纤维沿不同方向交叉分布，在洋葱表皮细胞中可见交织成网状结构。
四、操作程序
取材
↓
PBS洗涤3次，每次3ˊ
↓
2%triton“X”-100处理
（37℃恒温20-30ˊ）
↓
37℃恒温20~30ˊ
↓
M-缓冲液洗涤3次，每次3ˊ
↓
3%戊二醛固定10ˊ
↓
PBS洗涤3次，每次5ˊ
↓
0.2%考马斯亮兰染色20ˊ
↓
自来水冲洗
↓
空气干燥
↓
二甲苯透明
↓
胶封片
↓
镜检
五、作业：
　　1.描绘所观察到的动物成纤维细胞张力纤维和植物细胞微丝网络图象。
　　2.说明该实验的原理和其中的几个关键步骤。