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一种用于观察植物花药发育结构变化的染色方法与流程

花匠小妙招
2024-12-17 22:45

本发明涉及植物组织，特别是一种用于观察植物花药发育结构变化的染色方法。

背景技术：

花药发育和结构的研究一直是生殖生物学研究的一个热点。在花药中，花粉母细胞减数分裂形成花粉的过程中所需要养料以及构成花粉外壁的孢粉质是由花药壁的绒粘层细胞分泌产生或者由绒粘层细胞解体产生，在花粉发育成熟之后，绒粘层消失；因而，绒粘层的在形成和解体的恰当时间对花粉的正常发育是十分重要的。另外，在花药发育的研究中，清晰地观察到绒粘层形成、消失时间和花粉壁的结构变化时间以及两者变化在时间上的关系是非常必要的。以往对于花粉发育和结构研究上常采用石蜡切片后染色，例如苯胺蓝可以细胞中的多种大分子进行染色显示不同的颜色，而对多糖/淀粉、脂类和蛋白质染色则分别采用高碘酸-希夫试剂（PAS）、苏丹黑B和考马斯亮蓝染色，所有这些染色方法都是用显微镜在亮视野下观察，由于花药壁的结构层次复杂（含有绒粘层在内的四层结构），上述这些花药染色和观察方法往往不能很清晰地观察花药壁绒粘层和花药壁的结构变化。

以往对花药结构的发育研究中，常利用PAS法进行染色，但是PAS法主要用于对不溶性多糖进行染色，使得花药的各层细胞壁和花粉以及其中的淀粉粒都染成红色，由于都是在亮视野下观察，不能清晰观察到花药壁绒粘层和花药壁的结构变化。因此，发明一种简便、成本低廉、安全的用于观察花药壁绒粘层和花药壁的结构变化的染色方法，是亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于观察植物花药发育结构变化的染色方法，可有效解决清晰观察花药壁绒粘层和花药壁的结构变化的问题。

本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：

1、摘取花药；

2、将花药用甲醛、冰醋酸和酒精的混合液固定；

3、脱水：将固定后的花药依次在不同浓度的酒精中脱水；

4、正丁醇处理：经过酒精脱水后的花药依次在正丁醇和酒精的混合液中处理三次，然后将花药转入正丁醇中浸泡处理；

5、浸蜡：将花药转入正丁醇和石蜡的混合液中，密封，60℃下6-10h，每隔3h倒出一半混合液，每次加入等重量的石蜡，连续进行两次；最后将混合液倒出，用100%的石蜡过夜8-12h浸泡；

6、包埋：将花药用石蜡包埋成包埋有花药的蜡块；

7、切片：将包埋有花药的蜡块切成蜡带；

8、沾片：用明胶涂在载玻片上，将切好的蜡带沾在载玻片上，烤干，将沾有蜡带的载玻片放入二甲苯中脱蜡，然后转入酒精和蒸馏水各处理一次；

9、染色：配置希夫试剂：将碱性品红和焦亚硫酸钠加入到蒸馏水中，搅拌均匀，冷却，加入浓盐酸和活性炭，成希夫试剂，将沾有花药的载玻片在高碘酸中处理，用蒸馏水冲洗，将载玻片转入希夫试剂中染色；

10、封片：将载玻片用蒸馏水冲洗，加盖玻片，实现对植物花药发育结构变化的染色。

本发明方法易操作，染色效果好，对植物花药发育结构变化的观察清晰、准确，有利于对药用植物的研究和栽培，使用安全、成本低，有良好的经济和社会效益。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，包括以下步骤：

1、取花药：采集植物的花或花序，用镊子摘取花药；

2、固定：将花药用甲醛10ml、冰醋酸3ml和50%酒精87ml的混合液在4℃进行固定12-24h；

3、脱水：室温下，将固定后的花药依次在质量浓度50%、70%、85%的酒精中脱水20-40min，置入质量浓度95%的酒精中脱水8-12h，而后转入质量浓度100%的酒精中脱水两次，每次20-40min；

4、正丁醇处理：经过酒精脱水后的花药依次在正丁醇和酒精的混合液中处理三次，每次20-40min；第一次：水15ml、质量浓度95%酒精50ml和正丁醇35ml；第二次：水5ml、质量浓度95%酒精40ml和正丁醇55ml；第三次：质量浓度95%酒精25ml和正丁醇75ml；然后将花药转入正丁醇中60℃下浸泡处理6-10h；

5、浸蜡：将花药转入按重量计的正丁醇和石蜡各占50%的混合液中，密封，在60℃下，保持6-10h，每隔3h倒出一半混合液，每次加入等重量的石蜡，连续进行两次；最后将混合液倒出，全部更换为100%的石蜡，去掉盖子，60℃保温；

6、包埋：60℃下，花药在石蜡中过夜8-12h，将花药转入包埋盒中，用石蜡包埋，将包埋好的蜡块取出，用刀片修理平整，成包埋有花药的蜡块；

7、切片：将包埋有花药的蜡块切成厚度4-6μm的蜡带；

8、沾片：用质量浓度1%的明胶涂在载玻片上，将切好的蜡带沾在载玻片上，在38-40℃下烤干，将沾有蜡带的载玻片放入二甲苯中脱蜡1-3h，然后依次转入质量浓度100%酒精、质量浓度70%酒精和蒸馏水各处理一次，每次处理时间为20-40min；

9、染色：配置希夫试剂：将碱性品红0.5-1.5g和焦亚硫酸钠1.0-2.0g加入到蒸馏水50-100ml中，搅拌均匀，冷却1-2h，加入浓盐酸0.5-1.5ml，加入5g活性炭6-10h后，过滤，成希夫试剂；

将沾有花药的载玻片在0.5%-1.0%的高碘酸中处理10-20min，用蒸馏水冲洗，将载玻片转入希夫试剂中染色处理20-30min；

10、封片：将载玻片用蒸馏水冲洗3-5min，加盖玻片，实现对植物花药发育结构变化的染色，用于观察花药壁绒粘层和花药壁的结构变化；

11、观察：用激光共聚焦显微镜在波长为400-500nm的激发光照射、照相，清晰看到花药绒粘层和花药壁的荧光，实现对花药壁绒粘层和花药壁结构变化的观察。

本发明在具体实施中，为了全面看到花药壁各层细胞壁的结构，可将同一花药先在亮视野下用激光共聚焦显微镜DIC功能照相，然后再用400-500nm激发光照相，利用操作及分析软件的图像叠加功能，将图像叠加后可以得到花药各个部分清晰完整的图像。

由上述可以看出，本发明提供了一种利用荧光显微镜研究绒粘层发育和花药壁形成的新颖而简单的染色及观察方法。本发明的技术方案是将花药经过FAA固定，酒精脱水，正丁醇处理后浸蜡，石蜡包埋后切片，脱蜡后，用高碘酸-希夫试剂（PAS）染色，封片后用激光共聚焦显微镜观察照相。

本发明方法以冬凌草、山茱萸、山楂等的花药为例，按上述方法，对花药进行染色，经多次反复试用和实验，观察结果清晰，花药的的绒粘层和花粉壁荧光强烈，绒粘层的形成、解体消失以及花药壁的形成都能清晰地观察到，结合DIC观察图像，花药的各部分结构可以清晰看到，与现有的染色方法相比，具有使用安全、成本低、操作容易的特点，染色剂方面可节约成本90%以上（即仅是原成本的1/10），观察结果不亚于现有的任何染色方法，成功率达99.9%，工作效率提高50%以上，可广泛有效用于多种植物花药的观察，清晰地观察花药壁绒粘层和花药壁的结构变化，本方法特在药用植物、农学和植物分类、园艺学等方面的研究上有重要的实用价值。本发明染色和观察方法的简易、成本低廉及安全有效，使用效果和染色质量之好是未曾料到的，其显著进步是现行方法无可相比的，是石蜡切片染色方法的一大创造，有显著的经济和社会效益。