首页 > 分享 > 一种文心兰的组织培养方法与流程

一种文心兰的组织培养方法与流程

花匠小妙招
2024-12-19 04:21

本发明属于兰花培育领域，尤其涉及一种文心兰组织培养方法。
背景技术：
：文心兰，又名跳舞兰、舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，叶片1-3枚，植株轻巧、滞洒，花茎轻盈下垂，花朵奇异可爱，形似飞翔的金蝶，极富动感，系兰科文心兰属植物的总称，属于热带复茎性着生兰，原产于西印度群岛、墨西哥、巴西等地。文心兰花小而繁多，形态多变，花期因品种而异，花朵可持续1～3个月，是上等的切花材料，也可以作为盆栽植物供人们观赏。按照传统的繁殖方式进行分株，一株文心兰1年仅繁殖2-3个芽，繁殖系数很低，不能满足消费者的需要。组织培养技术的应用，可以加快繁殖速度。对文心兰的组织培养已有很多报道，但文心兰工厂化育苗过程中存在的组培成苗率不高、幼苗长势弱等问题，从而阻碍了新品种进行大规模繁殖与推广。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题，提供了一种文心兰组织培养方法，具体是通过以下技术方案来实现。一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5-1cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1-1.5min、75％乙醇浸泡60-70s、浸泡于灭菌液中、15-20r/min摇晃灭菌18-22min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24-26℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500lx、光照8-10h/天的条件下培养85-90天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26-28℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500lx、光照8-10h/天条件下培养55-60天；随后在23-25℃、相对湿度50-55％、光照强度为1500-2500lx、光照10-12h/天的条件下培养20-25天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24-26℃、相对湿度50-55％、光照强度为2000-3000lx、光照10-12h/天条件下培养6-8周。进一步，所述的灭菌液，是将芹菜22-25份、稻生黄单胞菌发酵粗提物17-10份、野马追17-20份、刺五加10-12份、香加皮7-8份、苦地丁4-5份混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。进一步，所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8-10天，7000-8000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4-5倍的磷酸缓冲液，20-23khz超声提取30-35min，13000-13500rpm离心20-22min，取上清，既得。进一步，所述的分化培养基，是将1/3ms、提取物7.5ml/l、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。进一步，所述的ms培养基，包括以下制备步骤：1)大量元素：硝酸钾1.5份、二水氯化钙0.3份、硝酸镁0.22份、磷酸二氢钾0.17份、硝酸铵0.15份、硫酸铵0.2份、磷酸二氢钠0.04份；2)铁盐：乙二胺四乙酸二钠盐0.0373份、硫酸亚铁0.0086份；3)微量元素：碘化钾0.00083份、七水硫酸锌0.000025份、硼酸0.0062份、二水钼酸钠0.00025份、无水硫酸铜0.000025份、氯化钴0.000025份；4)有机成分：甘氨酸0.00025份、烟酸0.000025份、盐酸硫胺0.0004份、肌醇0.05份；5)激素容液：6-苄氨基腺嘌呤1份、吲哚丁酸1份、α-萘乙酸1份。进一步，所述的提取物，是将雪莲花25-27份、毕澄茄20-22份、高良姜17-19份、藜芦12-14份、海藻10-12份、五味子7-9份、七叶莲6-8份、大叶桉叶5-7份、丙烯酰胺4-5份、透明质酸3-4份、角鲨烷2-3份混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。进一步，步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5-7min，停留10-12min，所述的微电流为0.5-0.8毫安。进一步，所述的增殖培养基，是将1/2ms、提取物5.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac(活性炭)1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。进一步，所述的生根培养基，是将1/2ms、提取物8.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。本发明的有益效果：按照本发明的方法进行文心兰的组织培养，通过使用特制的灭菌液，对培养基的组分进行调整并在培养基中增加特制的提取物，分化培养时向培养基中通入微电流刺激组织分化，从而使得文心兰的组织培养过程中受污染率降低、组织分化叫较快，存活率高达92％，由于所含的培养成分较适合文心兰生长，所以苗分化增殖、生根速度较快，进行生根培养20天左右既有根长出，且生根率高达100％。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。实施例1一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种和灭菌：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天的条件下培养85天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照10h/天的条件下培养20天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000lx、光照10h/天条件下培养6-8周。所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20khz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。所述的分化培养基，是将1/3ms、提取物7.5ml/l、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。所述的ms培养基，包括以下制备步骤：1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g；2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g；3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g；4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g；5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g；6)按以上配比称取各成分溶解于1l去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得ms培养基。所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。所述的增殖培养基，是将1/2ms、提取物5.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。所述的生根培养基，是将1/2ms、提取物8.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。实施例2一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)灭菌：将外植体用清水清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于0.1％升汞中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天的条件下培养85天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照10h/天的条件下培养20天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000lx、光照10h/天条件下培养6-8周。所述的分化培养基，是将1/3ms、提取物7.5ml/l、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。所述的ms培养基，包括以下制备步骤：1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g；2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g；3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g；4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g；5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g；6)按以上配比称取各成分溶解于1l去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得ms培养基。所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。所述的增殖培养基，是将1/2ms、提取物5.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。所述的生根培养基，是将1/2ms、提取物8.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。实施例3一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天的条件下培养85天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照10h/天的条件下培养20天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000lx、光照10h/天条件下培养6-8周。所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20khz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。所述的分化培养基，是将1/3ms、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。所述的ms培养基，包括以下制备步骤：1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g；2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g；3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g；4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g；5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g；6)按以上配比称取各成分溶解于1l去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得ms培养基。步骤3)分化培养步骤，其还包括每天向培养基中通入微电流1h，期间处理5min，停留10min，所述的微电流为0.5毫安。所述的增殖培养基，是将1/2ms、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。所述的生根培养基，是将1/2ms、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。实施例4一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)灭菌：将外植体用洗衣粉溶液清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于灭菌液中、15r/min摇晃灭菌18min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天的条件下培养85天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照10h/天的条件下培养20天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000lx、光照10h/天条件下培养6-8周。所述的灭菌液，是将芹菜22kg、稻生黄单胞菌发酵粗提物17kg、野马追17kg、刺五加10kg、香加皮7kg、苦地丁4kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。所述的稻生黄单胞菌发酵粗提物，是将稻生黄单胞菌培养8天，7000rpm离心培养液，收集沉淀，加入4倍的磷酸缓冲液，20khz超声提取30min，13000rpm离心20min，取上清，既得。所述的分化培养基，是将1/3ms、提取物7.5ml/l、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。所述的ms培养基，包括以下制备步骤：1)大量元素，是将硝酸钾1.5g、二水氯化钙0.3g、硝酸镁0.22g、磷酸二氢钾0.17g、硝酸铵0.15g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钠0.04g；2)铁盐，是将乙二胺四乙酸二钠盐0.0373g、硫酸亚铁0.0086g；3)微量元素，将碘化钾0.00083g、七水硫酸锌0.000025g、硼酸0.0062g、二水钼酸钠0.00025g、无水硫酸铜0.000025g、氯化钴0.000025g；4)有机成分，甘氨酸0.00025g、烟酸0.000025g、盐酸硫胺0.0004g、肌醇0.05g；5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g、吲哚丁酸1g、α-萘乙酸1g；6)按以上配比称取各成分溶解于1l去离子水中，121℃灭菌20-25min，既得ms培养基。所述的提取物，是将雪莲花25kg、毕澄茄20kg、高良姜17kg、藜芦12kg、海藻10kg、五味子7kg、七叶莲6kg、大叶桉叶5kg、丙烯酰胺4kg、透明质酸3kg、角鲨烷2kg混合，加入5-6倍混合料质量的清水煎煮2-3h，过滤既得。所述的增殖培养基，是将1/2ms、提取物5.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。所述的生根培养基，是将1/2ms、提取物8.0ml/l、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。实施例5一种文心兰的组织培养方法，包括以下步骤：1)引种：取健壮、无病害、带腋芽或顶芽的文心兰嫩茎，截取为0.5cm每段，减去叶，留叶柄基部，即为外植体；2)将外植体用清水清洗1min、75％乙醇浸泡60s、浸泡于0.1％升汞中灭菌8min，取出外植体用灭菌水清洗4-5次；3)分化培养：将灭菌的外植体用滤纸吸掉灭菌水、接种在分化培养基上，微在24℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天的条件下培养85天；4)增殖培养：将分化培养得到的腋芽切成0.5-1cm每段接种到增殖培养基中，在26℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照8h/天条件下培养55天；随后在23℃、相对湿度50％、光照强度为1500lx、光照10h/天的条件下培养20天；5)生根培养：取生长健壮、高为5-6cm的无根苗切成单株后接种到生根培养基上，在24℃、相对湿度50％、光照强度为2000lx、光照10h/天条件下培养6-8周。所述的分化培养基，是将1/3ms、6-苄氨基腺嘌呤1.0ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l，椰子水40ml/l，混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.4。所述的ms培养基，按照传统的配方进行，各成分配比如下：1)大量元素，nh4no31650mg/l、kno31900mg/l/cacl2·2h2o440mg/lmg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4700mg/l；2)铁盐，feso4·7h2o27.8mg/l+na2-乙二胺四乙酸二钠盐·2h2o37.3mg/l；3)微量元素，ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2mno4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l；4)有机成分，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇(维生素b6)0.5mg/l、盐酸硫胺素(维生素b1)0.5mg/l、甘氨酸2mg/l5)激素容液，6-苄氨基腺嘌呤1g/l、吲哚丁酸1g/l、α-萘乙酸1g/l；6)按以上配比混合各成分，121℃灭菌20-25min，既得ms培养基。所述的增殖培养基，是将1/2ms、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、ac1.0g/l、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/l、蔗糖20ml/l、琼脂4.5ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.5。所述的生根培养基，是将1/2ms、土豆20ml/l、香蕉20ml/l、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/l、蔗糖20ml/l混合，121℃灭菌20-25min，其中ph＝5.6。实验例1、文心兰组织培养生长情况按照实施例1-5的方法对文心兰进行培养，采用长宽为12cm×15cm、厚0.05mm的聚丙烯塑料袋代替传统的玻璃容器进行培养，分别统计每个培养组存活率、生根情况，结果如表1和表2所示。表1文心兰组织培养存活率接种数存活数污染数枯死数成活率实施例120017211592％实施例2200130244665％实施例3200147431073.5％实施例4200128472564％实施例520098426049％从表1可知，实施例1按照本发明的方法进行文心兰的组织培养，通过使用特制的灭菌液，对培养基的组分进行调整并在培养基中增加特制的提取物，分化培养时向培养基中通入微电流刺激组织分化，从而使得文心兰的组织培养过程中受污染率降低、组织分化叫较快，存活率高达92％，由于所含的培养成分较适合文心兰生长，所以苗分化增殖、生根速度较快，进行生根培养20天左右既有根长出，且生根率高达100％。与实施例1相比，由于实施例2-5的培养方法不同，从而导致培养苗的存活率较低，生根速度较慢。表2文心兰组织壮苗生根情况当前第1页12