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一种基于母本矮化的桉树人工杂交育种的方法与流程

花匠小妙招
2024-12-19 15:31

1.本发明涉及林木育种和桉树栽培技术领域，特别涉及一种基于母本矮化的桉树人工杂交育种的方法。

背景技术：

2.桉树原产于澳洲，属于桃金娘科(myrtaceae)，杯果木属(angophora cav.)、伞房属(corymbia k.d.hill&l.a.s.johnson)和桉属(eucalyptus l'herit)树种的统称。桉树的资源丰富，共有808个种和137个亚种或变种，计有945个分类群。因生长快，用途广，目前已成为世界公认的三大人工林树种之一。我国自1890年开始零星引种，1982年“中澳技术合作东门桉树示范林项目”在东门林场实施，系统地开展大量引种试验，选出了尾叶桉、巨桉、园角桉、赤桉、粗皮桉、大花序桉六个适生树种。1986年之后，在尾叶桉、巨桉、园角桉、赤桉以及部分杂交桉等九个亲本树种之间进行广泛的人工杂交育种，共开展1200个杂交组合，其中905个组合获得种子。从这些杂交子代中选育出的一批生长迅速、遗传增益大、抗逆性强的优良f1代单株，通过扦插、组织培养等无性繁殖方法建立无性系，经无性系对比测定和区域试验、筛选出优良无性系，在华南地区大规模推广造林。这些优良杂交子代无性系推广对我国林业发展影响深远。
3.如果要持续不断提高桉树生长量和品质，人工控制授粉是重要方法之一。它可以根据人的主观意愿——育种目标来确定，并能够获得不存在于自然界中的优良杂交组合，从而产生遗传增益更大的杂交子代。随着桉树无性育苗技术的发展，采用“有性育种、无性利用”的模式发展无性系林业已成为现实，人工杂交育种重要性更加突出。
4.要获得优良杂交子代，首先需要选择优良的亲本。亲本选择需要满足以下条件：杂交亲本具有亲和性；亲本具有所期望的优良性状；亲本是经过选择的优良单株；父母本的优缺点要互补。问题在于，亲本表现性状优良的单株大部分是接近成熟的大树，这就使得人工控制授粉必须在十多米高的树冠层进行，通常通过搭建脚手架或用高空作业车来实施，如图1。而人工控制授粉是一项复杂精细的工作，耗时长而工作量低，导致桉树人工杂交育种难度大，成本高，获得的杂交种子数量有限。为解决这些难题，主要采用的方法是把亲本矮化，达到能够在地面进行授粉的目的。矮化的技术手段有嫁接、高空压条、使用化学药剂如多效唑等。高空压条在树冠进行，难度大。而多效唑矮化方法能用于幼树，不宜用于经过优选的大树。嫁接矮化相对易于实施，但技术要求相当高，嫁接后能否存活，存活后能否及时开花，都是制约因素。因此，接穗选择、嫁接方法、嫁接植株培育成为关键技术环节
5.现有技术中关于桉树杂交育种的研究比较多，对母本矮化的桉树人工控制授粉的探索比较少。薛鹏等《桉树人工杂交育种技术研究》表示嫁接后营建矮化杂交圃，每个矮化材料4～6株，有助于收集父本花粉，选择亲本组合，以增加杂交子代多样性；其主要目的在于遗传多样性研究，处于试验探索阶段，而且使用多效唑来控制高生长。多效唑是一种植物生长延缓剂，通过干扰植物体内生理活动，以控制植物的生长发育，多效唑在草本植物中应用效果明显。在桉树这类木本植物中，多效唑施用浓度难以把握，浓度低则控制高生长的效
果不明显，浓度高造则成植株畸形甚至死亡。更重要的是，在以育种为目标的植株矮化中使用，能直观呈现出母本性状变化，如植株变矮、结果增多等，但会不会对子代形成不良影响，乃至发生变异，尚不明确。曾奇等《桉树矮化人工杂交技术研究初报》中指出通过在砧木1米高处截顶，去除顶端优势，增加侧枝生长，并把侧枝固定在人工设置的钢丝绳上，压迫枝条高度，达到矮化人工杂交育种目的，然后进行嫁接，接穗成活后进行人工控制授粉。问题在于，砧木高度达到1米处时直径比较大，而且砧木侧枝会消耗水分及养分，导致嫁接成活率低。另外，由于桉树是速生树种，使砧木留高1米时，获得侧枝的养分，伸长快。但侧枝的顶端优势去除作用不足以控制植株高度的生长，所以桉树的矮化作用有限。

技术实现要素：

6.本发明针对上述技术问题，发明一种母本矮化的桉树人工杂交育种方法，把尾叶桉、巨桉、园角桉、粗皮桉等优良家系的优良单株树冠层结果母枝嫁接到育苗杯的砧木上，成活后移植到矮化育种园栽培。当母本到达花期时，用尾叶桉、巨桉、园角桉、粗皮桉等优良家系的优良单株花粉在地面上进行人工控制授粉，从而获得相应的杂交种。
7.为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
8.一种基于母本矮化的桉树人工杂交育种的方法，包含以下操作步骤：
9.(1)优良单株的筛选：由连续多年测定的胸径、树高，通过统计学方法计算家系蓄积量及年平均生长量，分析比较后选出优良家系，然后在成熟龄的优良家系中选择表型性状最佳的1～2株优良单株，并编号，培育作为接穗优良单株；所述确定优良家系的方式是在家系间进行生长量(胸径、树高、蓄积量)、干形、抗性(抗风、抗病和抗虫)材性等性状的遗传变异分析，构建优良家系和单株选择指数方程，综合评分排名前20％作为入选家系，计算入选家系和单株的遗传增益，筛选优良单株；具体地先看平均蓄积量排名(年平均蓄积量30～45m3·
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)，然后是胸径、树高，优良单株的胸径、树高等范围随着生长年限而改变，6年生优良单株年平均胸径范围为2.5～3.5cm，年平均树高范围为3.5～4.5m；
10.(2)砧木培育：播种培育与接穗优良单株相同的树种实生苗，萌芽后选择长势好的小苗，移植到直径20cm的育苗杯中，培养备用；
11.(3)嫁接：在春季或秋季，用采种专用的高空采样器，攀爬梯子或直接在地面，采集步骤(1)中接穗优良单株的结果母枝作为接穗，用水浸泡枝条切口处带回，在苗圃挑选步骤(2)中培育好的砧木，砧木地径要求≥0.35cm，将砧木截顶至10～15厘米，把结果母枝修剪嫁接到砧木上，嫁接方法按照砧木大小，采用劈接法、对接法和切接法(依据接穗大小和砧木相对大小来选择不同的方法：接穗和砧木一样大的时，用对接法和劈接法；接穗小且而砧木大时，用切接法)，确保砧木和接穗的形成层对正，对正后用封口膜绑紧接口，完成嫁接；其中，劈接法和对接法，接穗可以留叶片；切接法接穗为带节枝段，不留叶片；用结果母枝嫁接，嫁接后第二年就能开花，所得嫁接桉木即为矮化桉木，后期再对矮化桉树主干截顶修剪，控制长高；
12.(4)嫁接植株培育；
13.(5)花粉收集；
14.(6)花粉储存；
15.(7)人工控制授粉：当观察到步骤(4)中移栽到矮化育种园长大的嫁接植株开始开
花，开始人工控制授粉；
16.(8)授粉后管理：授粉后减少人畜干扰，对便于集中管理的植株进行防风避雨管理，防治脱落或霉变，在最后一次授粉后7～14天，去掉隔离袋，在至果实成熟的四到六个月时间中，经常观察树枝生长和果实发育情况，当发现影响授粉枝条生长的竞争枝条，及时剪去，确保果实发育，同时做好病虫害防治等工作；
17.(9)果实采收：在果实成熟季节(一般为杂交第二年的3～4月)观察到果实膨大即将开裂时及时采收，并统计坐果率，同时填写人工杂交育种档案，包括亲本情况、花粉采集和去雄、授粉时间、坐果率和种子数量等；
18.(10)果实处理：采果后，将果实置于蔑箩(垫牛皮纸)上晾晒，果实开裂后，收集从果实中脱出的种子，即得到杂交子一代(f1)种子，严格标记后贮存待用。
19.优选地，步骤(1)中桉树优良单株选优标准，分两个阶段；第一阶段选择标准：(a)无病虫害特征：无明显虫害特征；(b)干形通直：干形指标分为5个等级评分：弯曲1分；在平均直度范围内，多主干，2分；在平均直度范围内，单一主干，3分；稍微弯曲，单一主干，4分；干形通直，单一主干，5分；(c)分枝小：分枝指标根据树枝大小按3个等级评分；大枝1分，中枝2分，小枝3分；(d)蓄积生长量指标：年平均蓄积量30～45m3·
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；第二阶段选择标准：(e)树皮和材性：主要是考虑纸浆材树种非常重要的材性基本密度，要求轮伐期(6年)木材基本密度指标为500～600kg/m3；(f)萌芽能力和扦插成活能力：作为无性繁殖材料，被选木必须是萌芽能力强，扞插成活率不能太低，至少要在70％以上。
20.作为优选，步骤(3)中所述结果母枝是指当年生长出来，第2年时将成为结果枝，开花结实的枝条。
21.作为优选，步骤(4)所述的嫁接植株培育为将嫁接苗木放入半自动控温控湿喷灌系统进行管护，控制湿度70％以上，防治病虫害，7～14天后，接穗开始有萌芽并逐步长高，及时清除砧木上的萌芽，防止其争夺养分和水分，当嫁接口愈合完全后，适量追肥，促进生长，在新芽生长至10～15厘米后，将嫁接苗种植到矮化育种园中，株行距5.0
×
5.0m，种植后及时开展除草施肥等抚育管理，一年后开始开花。
22.作为优选，步骤(5)中所述的花粉收集为根据桉树的花期物候情况，选取的优良父本单株花蕾蒴盖变白即将脱落时，用专用高空采样器采下花枝，去掉叶片，将枝条切口迅速插入水中培养，带回实验室，剪去已开放的花蕾后，转移至新的水中培养，待朔盖完全脱落，花丝外露，花药开始释放花粉时，取下花药，放置于玻璃干燥器中，干燥24～48小时后，过100～200目分样筛，将筛取的花粉装到经灭菌干燥处理过的小瓶中。
23.作为优选，步骤(6)中所述的花粉储存为：为解决不同树种和品种间的人工杂交育种中，父母本花期不遇的问题，将步骤(5)中获得的花粉贮藏在专用冰箱或冷库中，由于常温下花粉易失去活性，所以对贮藏温度要求严格，温度维持在-4℃。
24.作为优选，步骤(7)中所述的人工授粉包括以下(a)(b)(c)项内容；
25.(a)花粉萌发试验：为利用步骤(6)中储存的花粉进行人工控制授粉，需要检测花粉活性，开展花粉萌发试验，具体方法为在26℃下，抽取少量花粉，在1.5％琼脂+35％的蔗糖+100～250ppm硼酸的培养基上，培养24小时，当花粉萌芽率≤30％，花粉活力低或丧失活性，不再用于授粉；花粉萌芽率在30％～60％间，可用于授粉，并且为达到授粉效果，要增加单个柱头授粉量；花粉萌芽率≥60％，可以用于授粉，单个柱头的授粉量可以少一些；
26.(b)去雄和套袋隔离：当母本花蕾呈淡黄色且萼环出现裂缝时，是去雄的最佳时期，把附近枝条已开放的花朵以及青色的花蕾剪掉，然后用手术剪或刀片切去即将脱落的花蕾蒴盖，也可以直接用手拿掉，再用镊子或刀片去掉雄蕊，用细毛刷刷去柱头和花杯基部的花粉，用蒸馏水或无菌水冲洗柱头，以防止花粉污染，在去雄完毕后，套上硫酸纸袋或棉布袋隔离，布袋需要用铁丝螺旋架支撑，两端系在枝条上，铁丝与枝条接触处垫上棉花，以免擦伤枝条，硫酸纸袋用棉线绑扎，使用方便，但透气性差；
27.(c)控制授粉：去雄后5～6天，当观察到柱头膨胀且有白色粘液时，打开套袋的一端，用医用棉签蘸取步骤(6)中经检测的花粉，轻轻涂抹在柱头上，每支棉签仅用于一个杂交组合，防止花粉污染，动作要轻，确保花粉均匀涂抹于柱头，为提高授粉成功率，在第一次授粉后1～2天再授粉一次，另一种授粉方式为把柱头上端三分之一切去，将花粉一次性涂于切口处，然后再套袋隔离，授粉完成后做好标记包括授粉日期、花粉信息、授粉花蕾数量等。
28.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
29.(1)本发明用桉树优良家系中优良单株的枝条嫁接，属于无性繁殖，枝条萌芽后开花结果，能完整保持优树的遗传性状，比采用化学药剂多效唑处理幼龄植株矮化，母本遗传性状更可靠，也不会有变异的风险；
30.(2)本发明采取桉树优良家系中优良单株树冠层接果母枝嫁接，接穗的生理年龄处于成熟态，嫁接成活后，萌芽条经生长发育，能及时开花结果，其果形等生物学特性与桉树优良单株一致；
31.(3)本发明矮化母本后，在矮化的桉木上进行人工控制授粉，去雄、授粉、套袋隔离、种子采收时可在地面上进行，本发明基于矮化桉树的人工杂交育种方法大量节省了人力物力，不用升降机、不用经过脚手架，一个人一天授粉量大大提高，同时，避免了高空作业的风险，而且收获种子多，育种成本下降；
32.(4)桉树杂交子代的优势作用，是选择利用优势基因重组产生的优良杂交子代；本发明基于矮化母本的桉树人工杂交育种方法因为矮化母本收获杂交种子数量增加，杂交子代中具有高遗传增益的个体数量增加，为杂交子代筛选提供了一个更大的群体，选出优良单株的概率大大增加，能够更好地体现出杂交育种的优势；
33.(5)获得了整套母本矮化杂交育种技术，用本发明方法培育优良杂交子一代(f1)无性系36个，选出优良品种12个，其中1个通过广西壮族自治区林木良种委员会定为良种，所以本发明具有很好的应用价值；
34.(6)通过本发明方法嫁接矮化的植株，既可以作母本授粉，也可以作父本采集花粉；营建矮化育种园，就可以加大杂交育种的力度，正交、反交、回交、测交都可以同时开展，从而获得遗传基础更广泛的杂交子代种群，对加速桉树育种的进程具有里程碑的意义。
附图说明
35.图1是现有技术高空授粉。
36.图2是本发明所得矮化后的桉树授粉现场。
37.图3是本发明方法嫁接苗。
38.图4是本发明园角桉矮化母本开花期。
39.图5是本发明方法花粉收集。
40.图6是本发明方法花枝套袋隔离。
41.图7是本发明方法杂交种子处理与晾晒。
具体实施方式
42.下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
43.各实施例的步骤(1)中桉树优良单株选优标准，分两个阶段；第一阶段选择标准：(a)无病虫害特征：无明显虫害特征；(b)干形通直：干形指标分为5个等级评分：弯曲1分；在平均直度范围内，多主干，2分；在平均直度范围内，单一主干，3分；稍微弯曲，单一主干，4分；干形通直，单一主干，5分；(c)分枝小：分枝指标根据树枝大小按3个等级评分；大枝1分，中枝2分，小枝3分；(d)蓄积生长量指标：年平均蓄积量30～45m3·
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～2
；第二阶段选择标准：(e)树皮和材性：主要是考虑纸浆材树种非常重要的材性基本密度，要求轮伐期(6年)木材基本密度指标为500～600kg/m1；(f)萌芽能力和扦插成活能力：作为无性繁殖材料，被选木必须是萌芽能力强，扞插成活率不能太低，至少要在70％以上。
44.实施例1
45.一种基于母本矮化的桉树人工杂交育种的方法，具体操作步骤如下：
46.(1)优良单株的筛选：在尾叶桉家系试验林中，根据上述桉树优良单株选优标准，由连续多年测定的胸径、树高，通过统计学方法计算家系蓄积量及年平均生长量，分析比较后选出优良家系，然后在成熟龄的优良家系中选择表现型性状最佳的1～2株优良单株，并编号，培育作为接穗优良单株；表型性状最佳的优良单株是指树高、胸径最值大，而且树干通直、尖削角度小的个体；确定优良家系的具体方式是在家系间进行生长量(胸径、树高、蓄积量)、干形、抗性(抗风、抗病和抗虫)材性等性状的遗传变异分析，构建优良家系和单株选择指数方程，综合评分排名前20％作为入选家系(即排名前100的前20名)，计算入选家系和单株的遗传增益，筛选优良单株，先看平均蓄积量排名(年平均蓄积量30～45m3·
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)，然后是胸径、树高，优良单株的胸径、树高等范围随着生长年限而改变，6年生优良单株年平均胸径范围为2.5～3.5cm，年平均树高范围为3.5～4.5m；
47.(2)砧木培育：播种尾叶桉种子，培育实生苗，萌芽后选择长势好的小苗，移植到直径20cm的育苗杯中，培养备用；
48.(3)嫁接：在春季，用采种专用的高空采样器，攀爬梯子或直接在地面，采集步骤(1)中接穗优良单株的结果母枝作为接穗(结果母枝是指当年生长出来，第2年时将成为结果枝，开花结实的枝条)，用水浸泡枝条切口处带回，在苗圃挑选步骤(2)中培育好的砧木，砧木地径要求≥0.35cm，将砧木截顶至10厘米，用劈接法把结果母枝修剪嫁接到砧木上，确保砧木和接穗的形成层对正，对正后用封口膜绑紧接口，完成嫁接；用结果母枝嫁接，嫁接后第二年就能开花，所得嫁接桉木即为矮化桉木，后期再对矮化桉树主干截顶修剪，控制长高；
49.(4)嫁接植株培育：将嫁接苗木放入半自动控温控湿喷灌系统进行管护，控制湿度70％以上，并进行病虫害防治工作，7天后，接穗开始有萌芽并逐步长高，及时清除砧木上的萌芽，防止其争夺养分和水分，当嫁接口愈合完全后，适量追肥，促进生长，在新芽生长至15
厘米，生长稳定时，将嫁接苗种植到矮化育种园中，株行距5.0
×
5.0m，种植后及时开展除草施肥等抚育管理，一年后开始开花；
50.(5)花粉收集：采用巨桉作为杂交父本，根据桉树的花期物候情况，在巨桉开花期，选取的优良父本单株花蕾蒴盖变白即将脱落时，用专用高空采样器采下花枝，去掉叶片，将枝条切口迅速插入水中培养，带回实验室，剪去已开放的花蕾后，转移至新的水中培养，待朔盖完全脱落，花丝外露，花药开始释放花粉时，取下花药，放置于玻璃干燥器中，干燥24小时后，过100目分样筛，将筛取的花粉装到经灭菌干燥处理过的小瓶中；
51.(6)花粉储存：将步骤(5)中获得的花粉贮藏在专用冰箱中，由于常温下花粉易失去活性，所以对贮藏温度要求严格，温度维持在-4℃；
52.(7)人工控制授粉：当观察到步骤(4)移栽到矮化育种园长大的嫁接植株开始开花，开展人工控制授粉；包括以下(a)(b)(c)项内容；
53.(a)花粉萌发试验：为利用步骤(6)中储存的花粉进行人工控制授粉，需要检测花粉活性，开展花粉萌发试验，具体方法为在26℃下，抽取少量花粉，在1.5％琼脂+35％的蔗糖+200ppm硼酸的培养基上，培养24小时，当花粉萌芽率≤30％，花粉活力低或丧失活性，不再用于授粉；花粉萌芽率在30％～60％间，可用于授粉，并且为达到授粉效果，要增加单个柱头授粉量；花粉萌芽率≥60％，可以用于授粉，单个柱头的授粉量可以少一些；
54.(b)去雄和套袋隔离：当母本花蕾呈淡黄色且萼环出现裂缝时，把附近枝条已开放的花朵以及青色的花蕾剪掉，然后用手术剪或刀片切去即将脱落的花蕾蒴盖，再用镊子去掉雄蕊，用细毛刷刷去柱头和花杯基部的花粉，用无菌水冲洗柱头，以防止花粉污染，在去雄完毕后，套上白色棉布袋隔离，用铁丝螺旋架支撑，两端系在枝条上，铁丝与枝条接触处垫上棉花，以免擦伤枝条；
55.(c)控制授粉：去雄后5天，当观察到柱头膨胀且有白色粘液时，打开套袋的一端，用医用棉签蘸取步骤(6)中经检测的花粉，轻轻涂抹在柱头上，每支棉签仅用于一个杂交组合，防止花粉污染，确保花粉均匀涂抹于柱头，每支棉签仅用一次，在第一次授粉后2天再授粉一次，然后再套袋隔离，授粉完成后做好标记包括授粉日期、花粉信息、授粉花蕾数量等；
56.(8)授粉后管理：授粉后减少人畜干扰，便于集中管理的植株，进行防风避雨管理，防治脱落或霉变，在最后一次授粉后7天，去掉隔离袋，在至果实成熟的四到六个月时间中，经常观察树枝生长和果实发育情况，当发现影响授粉枝条生长的竞争枝条，及时剪去，确保果实发育，同时做好病虫害防治等工作；
57.(9)果实采收：在果实成熟季节(杂交第二年的3～4月)观察到果实膨大即将开裂时及时采收，并统计坐果率，同时填写人工杂交育种档案，包括亲本情况、花粉采集和去雄、授粉时间、坐果率和种子数量等；
58.(10)果实处理：采果后，将果实置于蔑箩(垫牛皮纸)上晾晒，果实开裂后，收集从果实中脱出的种子，即得到尾巨桉杂交子一代(f1)种子，严格标记后贮存待用。
59.实施例2
60.一种基于母本矮化的桉树人工杂交育种的方法，具体操作步骤如下：
61.(1)优良单株的筛选：在尾叶桉家系试验林中，根据上述桉树优良单株选优标准，由连续多年测定的胸径、树高，通过统计学方法计算家系蓄积量及年平均生长量，分析比较后选出优良家系，然后在成熟龄的优良家系中选择表现型性状最佳的1～2株优良单株，并
编号，培育作为接穗优良单株；表型性状最佳的优良单株是指树高、胸径最值大，而且树干通直、尖削角度小的个体；确定优良家系的具体方式是在家系间进行生长量(胸径、树高、蓄积量)、干形、抗性(抗风、抗病和抗虫)材性等性状的遗传变异分析，构建优良家系和单株选择指数方程，综合评分排名前20％作为入选家系(即排名前100的前20名)，计算入选家系和单株的遗传增益，筛选优良单株，先看平均蓄积量排名(年平均蓄积量30～45m3·
hm-2
)，然后是胸径、树高，优良单株的胸径、树高等范围随着生长年限而改变，6年生优良单株年平均胸径范围为2.5～3.5cm，年平均树高范围为3.5～4.5m；
62.(2)砧木培育：播种尾叶桉种子，培育实生苗，萌芽后选择长势好的小苗，移植到直径20cm的育苗杯中，培养备用；
63.(3)嫁接：在秋季，用采种专用的高空采样器，攀爬梯子或直接在地面，采集步骤(1)中接穗优良单株的结果母枝作为接穗(结果母枝是指当年生长出来，第2年时将成为结果枝，开花结实的枝条)，用水浸泡枝条切口处带回，在苗圃挑选步骤(2)中培育好的砧木，砧木地径要求≥0.35cm，将砧木截顶至10厘米，用切接法把结果母枝修剪嫁接到砧木上，确保砧木和接穗的形成层对正，对正后用封口膜绑紧接口，不留叶片的枝段作接穗，接后上端也用封口膜封口，再用一层厚农膜包裹接穗，防止失水，完成嫁接；用结果母枝嫁接，嫁接后第二年就能开花，所得嫁接桉木即为矮化桉木，后期再对矮化桉树主干截顶修剪，控制长高；
64.(4)嫁接植株培育：将嫁接苗木放入半自动控温控湿喷灌系统进行管护，控制湿度70％以上，并进行病虫害防治工作，14天后，接穗开始有萌芽并逐步长高，及时清除砧木上的萌芽，防止其争夺养分和水分，当嫁接口愈合完全后，适量追肥，促进生长，在新芽生长至10厘米，生长稳定时，将嫁接苗种植到矮化育种园中，株行距5.0
×
5.0m，种植后及时开展除草施肥等抚育管理，一年后开始开花；
65.(5)花粉收集：采用园角桉作为杂交父本，根据桉树的花期物候情况，在园角桉开花期，选取的优良父本单株花蕾蒴盖变白即将脱落时，用专用高空采样器采下花枝，去掉叶片，将枝条切口迅速插入水中培养，带回实验室，剪去已开放的花蕾后，转移至新的水中培养，待朔盖完全脱落，花丝外露，花药开始释放花粉时，取下花药，放置于玻璃干燥器中，干燥48小时后，过200目分样筛，将筛取的花粉装到经灭菌干燥处理过的小瓶中；
66.(6)花粉储存：将步骤(5)中获得的花粉贮藏在专用冷库中，由于常温下花粉易失去活性，所以对贮藏温度要求严格，温度维持在-4℃；
67.(7)人工控制授粉：当观察到步骤(4)移栽到矮化育种园长大的嫁接植株开始开花，开展人工控制授粉；包括以下(a)(b)(c)项内容；
68.(a)花粉萌发试验：为利用步骤(6)中储存的花粉进行人工控制授粉，需要检测花粉活性，开展花粉萌发试验，具体方法为在26℃下，抽取少量花粉，在1.5％琼脂+35％的蔗糖+250ppm硼酸的培养基上，培养24小时，当花粉萌芽率≤30％，花粉活力低或丧失活性，不再用于授粉；花粉萌芽率在30％～60％间，可用于授粉，并且为达到授粉效果，要增加单个柱头授粉量；花粉萌芽率≥60％，可以用于授粉，单个柱头的授粉量可以少一些；
69.(b)去雄和套袋隔离：当母本花蕾呈淡黄色且萼环出现裂缝时，把附近枝条已开放的花朵以及青色的花蕾剪掉，然后用手术剪或刀片切去即将脱落的花蕾蒴盖，再用刀片去掉雄蕊，用细毛刷刷去柱头和花杯基部的花粉，用蒸馏水冲洗柱头，以防止花粉污染，在去
雄完毕后，套上白色棉布袋隔离，用铁丝螺旋架支撑，两端系在枝条上，铁丝与枝条接触处垫上棉花，以免擦伤枝条；
70.(c)控制授粉：去雄后6天，当观察到柱头膨胀且有白色粘液时，打开套袋的一端，用医用棉签蘸取步骤(6)中经检测的花粉，轻轻涂抹在柱头上，每支棉签仅用于一个杂交组合，防止花粉污染，确保花粉均匀涂抹于柱头，每支棉签仅用一次，在第一次授粉后1天再授粉一次，然后再套袋隔离，授粉完成后做好标记包括授粉日期、花粉信息、授粉花蕾数量等；
71.(8)授粉后管理：授粉后减少人畜干扰，便于集中管理的植株，进行防风避雨管理，防治脱落或霉变，在最后一次授粉后14天，去掉隔离袋，在至果实成熟的四到六个月时间中，经常观察树枝生长和果实发育情况，当发现影响授粉枝条生长的竞争枝条，及时剪去，确保果实发育，同时做好病虫害防治等工作；
72.(9)果实采收：在果实成熟季节(杂交第二年的3～4月)观察到果实膨大即将开裂时及时采收，并统计坐果率，同时填写人工杂交育种档案，包括亲本情况、花粉采集和去雄、授粉时间、坐果率和种子数量等；
73.(10)果实处理：采果后，将果实置于蔑箩(垫牛皮纸)上晾晒，果实开裂后，收集从果实中脱出的种子，即得到尾园桉杂交子一代(f1)种子，严格标记后贮存待用。
74.杂交后检测稳定性：
75.将所得f1代种子播种培育成桉树苗，建立f1杂交子代测定林(种植密度83株/亩)，株行距2m
×
4m。连续6年进行胸径、树高、单株材积等生长量测定，结合干形、抗性(抗风、抗病、抗虫)、材性等性状，进行遗传变异分析，来验证f1子代是否稳定。
76.下表为本发明方法得到的矮化尾叶桉母本分别和巨桉、园角桉父本(优良单株花粉)人工控制授粉的结果：
[0077][0078]
可以看出，本发明母本矮化的桉树人工杂交育种方法，坐果率和每果种子数比较多，以上是尾叶桉
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巨桉、尾叶桉
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园角桉，在粗皮桉
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尾叶桉、园角桉
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巨桉中，也有较好的表现结果。
[0079]
在授粉这一技术环节中，切去三分之一柱头后一次性授粉的坐果率和每果种子数比较多，优于直接在柱头授粉2次的方案。然而，从生物繁衍进化角度来看，柱头对花粉有筛选作用。优势花粉萌芽后花粉管能通过并优先进入子房。切去柱头后，则不分优劣，全部进入子房。产生种子虽然多，遗传基因优良的种子占比可能会减少。
[0080]
本发明步骤(3)中所述的嫁接方法，劈接法是指在砧木横断面中间劈开一条裂缝，将接穗削成楔形，然后插入砧木断面的缝中，确保形成层对正，然后用封口膜绑缚固定，该方法接穗成活后稳固，不易脱落。对接法是指把接穗和砧木断面削成马耳形，然后紧贴在一起，确保形成层对正后，用封口膜绑缚固定，该方法适用于砧木和接穗大小相同时使用，因
为形成层接触面大，易愈合，成活率比较高。切接法是指在砧木断面的外侧，切开一条缝，形成一个纵切面，接穗削去一部分，同样地形成一个纵切面，然后将两个纵切面紧贴在一起，确保形成层对正后，用封口膜绑缚固定；该方法适用于砧木大，接穗小的情况。三种方法综合使用，可以充分地利用不同大小直径的类型结果母枝，提升母本优良单株嫁接的成功率。
[0081]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。