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鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对.pdf

花匠小妙招
2024-12-20 07:30

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010376163.5 (22)申请日 2020.05.07 (71)申请人云南菌视界生物科技有限公司地址 651700 云南省昆明市嵩明县小街镇本纳克村云南省花卉示范园区东片区 (72)发明人罗祥英李荣春 (74)专利代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 代理人杨青穆德骏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 1/14(2006.01) (54)发明名称一种鉴定商。

2、业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对 (57)摘要本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-1的引物对 M1F/M1R(SEQIDNO:21和SEQIDNO:22)和用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-2的引物对 M2F/M2R(SEQIDNO:23和SEQIDNO:24)，以及利用所述引物对鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法。该方法适用于羊肚菌菌种生产过程的不同阶段，可实时监测羊肚菌菌种生产过程的交配型基因情况，保证两个交配型基因不丢失，播种前提前预测出菇能力。本发明引物对和交配型基因鉴定方法的准确率、稳定性和灵。

3、敏度高。权利要求书1页说明书8页序列表5页附图9页 CN 111500759 A 2020.08.07 CN 111500759 A 1.一种用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-1的特异性引物对，分别如SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:22所示。 2.一种用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-2的特异性引物对，分别如SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:24所示。 3.一种用于检测羊肚菌种类交配型基因的引物对试剂盒，包括权利要求1和权利要求2 所述的特异性引物对。 4.一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法，其包括使用权利要求1和/或权利要求。

4、2所述的特异性引物对，实施PCR扩增的步骤。 5.权利要求4所述的方法，其适用于羊肚菌生产过程的任意阶段，包括母种、原种和/或栽培种。 6.权利要求4或5所述的方法，其中所述羊肚菌种类选自六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和七妹羊肚菌。 7.权利要求4或5所述的方法，其还包括取样的步骤。 8.权利要求7所述的方法，其中所述取样的步骤包括母种培养4-7天取培养基表面菌丝体，原种培养10-15天取原种瓶培养料表面菌丝体，和/或栽培种培养12-18天取菌袋培养料表面菌丝体，作为检测样品。 9.权利要求4所述的方法，其中PCR扩增的反应条件为93-94预变性5min， 93-94变。

5、性30-45s， 52-54.4退火35s， 72延伸1min，共35个循环， 72延伸10min。 10.权利要求1或2所述的特异性引物对的用途，通用于商业化栽培羊肚菌种类的交配型基因鉴定。 11.权利要求1或2所述的特异性引物对的用途，特异性用于羊肚菌交配型基因MAT1-1 和MAT1-2鉴定。 12.权利要求1或2所述的特异性引物对的用途，用于羊肚菌菌种生产过程中母种、原种和/或栽培种阶段菌丝体的交配型基因实时监测。权利要求书 1/1 页 2 CN 111500759 A 2 一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对技术领域 0001 本发明属于分子生物学。

6、技术领域，具体涉及一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对。背景技术 0002 羊肚菌是羊肚菌属(Morchella)真菌的统称，隶属于子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)。 0003 真菌的 “性别特征” 由交配型基因位点(mating-type locus， MAT)控制，包括羊肚菌在内的多数子囊菌的交配型基因一般以MAT1-1和 MAT1-2表示。目前，商业化栽培推广的羊肚菌种类的有性生殖方式均为异种配合，即必须同时具有交配型基因MAT1-1和MA。

7、T1-2或分别含有两个互补交配型基因的菌丝体相互融合，才能完成有性生殖过程，实现出菇。 0004 因此，在羊肚菌大规模生产、推广种植过程中，如果能够寻找一种简单、快速、有效的检测方法，对羊肚菌的整个菌种生产过程(母种、原种、栽培种)及播种前对交配型基因全程实时监测，保证在菌种生产过程两个交配型基因不丢失，提前预测其出菇能力，这对羊肚菌的大规模生产、栽培研究及保障羊肚菌产业的稳健、快速发展具有重要意义。 0005 现有梯棱羊肚菌交配型基因的鉴定方法及特异引物对1为：用于检测交配型基因 MAT1-1的特异引物对P8-4F/P8-4R，用于检测交配型基因MA。

8、T1-2的特异引物P6-1F/P6-1R。现有鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型基因方法和引物对2为：用于检测交配型基因 MAT1-1 的特异引物对P7-2F/P7-2R或P8-5F/P8-5R，用于检测交配型基因 MAT1-2的特异引物对P10-1F/P10-2R或P10-2F/P10-3R。现有羊肚菌交配型基因决定基因鉴定专用引物及出菇能力预测方法3为：用于检测交配型基因mr1MAT1-1-1基因的特异引物对 Mr1MAT1-1- 1F/Mr1MAT1-1-1-R，用于检测交配型基因mr1MAT1-2-1 的特异引物对Mr1MAT1-2-1-F/ Mr1MAT1-2-1-R。

9、。现有鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型基因方法4为：用于检测交配型基因MAT1-1 的引物对MAT1-1L/MAT1-1R，用于检测交配型基因MAT1-2的引物对 MAT1- 2L/MAT1-2R。这些引物对序列及其分析参见图1A-图1D。 0006 引物设计的一般性原则： (1)引物与模板DNA序列紧密互补； (2)引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或者发夹结构，即引物自身不含有连续4个碱基的互补、两引物之间不应有多于4个连续互补碱基或同源碱基，尤应避免3 端的互补重叠； (3)引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应，即发生错配； (4)引物长度一般不超过3。

10、8bp，常用的是18- 27bp； (5)引物序列的GC含量一般为 40-60； (6)引物序列碱基分布具有随机性，避免出现4个以上的单一重复碱基。 0007 基于上表对现有具体引物序列的分析并参照引物设计的一般性原则，为了满足实时监测羊肚菌菌种生产过程及播种前的交配型基因情况，进一步提高交配型基因鉴定方法的特异性、稳定性和灵敏度，对更优的引物对及其鉴定方法，一直存在迫切的需求。说明书 1/8 页 3 CN 111500759 A 3 发明内容 0008 根据一般性原则，本发明设计并筛选出了用于鉴定商业化栽培推广羊肚菌种类的交配型基因MAT1-1的特异性引物对M1F/。

11、M1R和交配型基因MAT1-2的特异性引物对M2F/M2R，并以羊肚菌菌种生产过程中的母种、原种、栽培种菌丝体的3000份样品为模板系统评价了引物对的稳定性、特异性及灵敏度，通过优化羊肚菌交配型基因鉴定方法，从而实现了商业化栽培羊肚菌种类菌种生产过程对交配型基因的实时监测。 0009 本发明提供一种用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-1的特异性引物对，分别如 SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。 0010 本发明还提供一种用于检测羊肚菌种类交配型基因MAT1-2的特异性引物对，分别如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示。 0011 。

12、本发明进一步提供一种用于检测羊肚菌种类交配型基因的引物对试剂盒，包括上述特异性引物对，即SEQ ID NOs:21-22和SEQ ID NOs:23-24。 0012 本发明另提供一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法，包括使用上述特异性引物对，即SEQ ID NOs:21-22和/或SEQ ID NOs:23-24，实施PCR扩增的步骤。 0013 根据本发明，交配型基因的鉴定方法适用于羊肚菌生产过程的任意阶段，包括母种、原种和/或栽培种。 0014 根据本发明，交配型基因的鉴定方法还包括取样的步骤。 0015 根据本发明，所述取样的步骤包括母种培养4-7天取。

13、培养基表面菌丝体，原种培养 10-15天取原种瓶培养料表面菌丝体，和/或栽培种培养12-18天取菌袋培养料表面菌丝体，作为检测样品。 0016 根据本发明， PCR扩增的反应条件为93-94预变性5min， 93-94 变性30-45s， 52-54.4退火35s， 72延伸1min，共35个循环， 72 延伸10min。 0017 根据本发明，上述特异性引物对通用于商业化栽培羊肚菌种类的交配型基因鉴定。 0018 根据本发明，上述特异性引物对特异性用于羊肚菌交配型基因 MAT1-1和MAT1-2 鉴定。 0019 根据本发明，上述特异性引物对用于羊肚菌菌种生产过程母种、原种。

14、和/或栽培种阶段菌丝体的交配型基因实时监测。 0020 根据本发明，所述羊肚菌种类选自六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和七妹羊肚菌。 0021 发明效果 0022 本发明通用型引物对和交配型基因鉴定方法适用于目前商业化栽培的羊肚菌种类(六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌)的交配型基因鉴定，该方法和引物对用于羊肚菌菌种生产过程(母种、原种、栽培种)的交配型基因实时监测，通过不同阶段菌丝体的3000份样品，系统评价该方法和引物的稳定性和可靠性。本发明所提供的引物对和交配型基因鉴定方法的准确率高、稳定性好，预期目的条带清晰，不拖带，不易形成引物二聚体， DNA模板稀释1。

15、0-3倍，仍可清晰检测出预期目的条带，灵敏度高。 0023 本发明找到一种简单、快速、有效的交配型基因鉴定方法及稳定性好、特异性强、灵敏度高的通用于扩增商业化栽培推广羊肚菌种类交配型基因的引物对，从而在播种前提前预测其出菇能力，这对羊肚菌的大规模生产、栽培研究及保障羊肚菌产业的稳健、快速发说明书 2/8 页 4 CN 111500759 A 4 展具有重要意义。 0024 附图简述 0025 为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于下列附图： 0026 图1A-1D示出现。

16、有技术引物对序列及其分析； 0027 图2示出本发明引物对M1F/M1R的分析结果； 0028 图3示出本发明引物对M2F/M2R的分析结果； 0029 图4说明本发明M1F序列与用于鉴定交配型基因MAT1-1的现有正向引物序列比对后差异显著； 0030 图5说明本发明M1R序列与用于鉴定交配型基因MAT1-1的现有反向引物序列比对后差异显著； 0031 图6说明本发明M2F序列与用于鉴定交配型基因MAT1-2的现有正向引物序列比对后差异显著； 0032 图7说明本发明M2R序列与用于鉴定交配型基因MAT1-2的现有反向引物序列比对后存在差异； 0033 图8示出本发明引物对M1F/M。

17、1R和M2F/M2R分别只能特异性扩增羊肚菌交配型基因 MAT1-1和MAT1-2，其中M为Marker， 1和7 泳道分别为羊肚菌为模板扩增的MAT1-1和MAT1-2 条带，剩余泳道分别为金耳、炭角菌、灰树花、大球盖菇为模板的扩增结果； 0034 图9示出目前栽培推广羊肚菌种类的交配型基因检测电泳图，其中M泳道为 Marker， 1、 2泳道代表1个羊肚菌样品的两个交配型基因 MAT1-1、 MAT1-2的扩增结果， 1-12 泳道(上)为梯棱羊肚菌菌株， 13-24泳道(上)为七妹羊肚菌菌株， 1-24泳道(下)为六妹羊肚菌菌株； 0035 图10示出羊肚菌菌种生产过程(母。

18、种、原种、栽培种)的交配型基因检测电泳图，其中泳道1-24(上)为交配型基因MAT1-1扩增结果，泳道1-24(下)为交配型基因MAT1-2扩增结果；以及 0036 图11示出羊肚菌菌种生产过程(包括母种、原种和栽培种)实时取样监测。具体实施方式 0037 为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。 0038 实施例1：引物对及其分析 0039 通过分析、。

19、比对羊肚菌交配型基因MAT1-1和MAT1-2序列，在序列保守区域使用 primer primer或DNAMAN软件分别设计引物，本发明设计并筛选出的引物序列如下： 0040 M1F： 5 -AAGCGGGCTCTTTGTCTTC-3 (SEQ ID NO:21)； 0041 M1R： 5 -CAAGTGGGTGTCATTCGTT-3 (SEQ ID NO:22)； 0042 M2F： 5 -ATCGCAACACAGAGATGAAG-3 (SEQ ID NO:23)；以及 0043 M2R： 5 -CAGTATTATCACCAACCGTAGC-3 (SEQ ID NO:24)。说明书。

20、 3/8 页 5 CN 111500759 A 5 0044 分析结果参见图2， SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22两个引物中均未见发夹结构，且连续碱基对的最大互补性为3bp，不连续碱基对的最大互补性为6bp。而参见图3， SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24两个引物中，只有M2F存在发夹结构，且连续碱基对的最大互补性为 3bp，不连续碱基对的最大互补性为6bp。 0045 将本发明引物对与现有引物对对比分析如下： 0046 (1)就用于鉴定交配型基因MAT1-1的正向引物序列而言，本发明的M1F序列与现有引物序列差异显著，参见图4。 0047。

21、 (2)就用于鉴定交配型基因MAT1-1的反向引物序列而言，本发明的M1R序列与现有引物序列(例如MAT1-1R)差异显著，一致性 65.22，参见图5。 0048 (3)就用于鉴定交配型基因MAT1-2的正向引物序列而言，本发明的M2F序列与现有引物序列(例如P6-1F)差异显著，一致性32.14，参见图6。 0049 (4)就用于鉴定交配型基因MAT1-2的反向引物序列而言，本发明的M2R序列与现有引物序列(例如MAT1-2R)有差异(一致性 90.91)。但由于扩增的目的序列不同，应将正反向引物作为一个整体分析(参见图7)。 0050 实施例2：样品分析 00。

22、51 1.样品 0052 样品为目前商业化栽培推广的羊肚菌种类(六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌)不同菌株不同批次的母种、原种及栽培种的菌丝体，共3000份样品。菌株均为云南菌视界生物科技有限公司保存。 0053 0054 2.取样方法 0055 羊肚菌菌种生产过程中母种培养4-7天取培养基表面菌丝体，原种培养10-15天取原种瓶培养料表面菌丝体，栽培种培养12-18天取菌袋培养料表面菌丝体为检测样品。 0056 3.基因组DNA提取 0057 取50-100mg新鲜大型真菌菌丝用液氮研磨。具体操作步骤参照上海生工生物工程公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂。

23、盒(批号： B518259)说明书提取DNA。说明书 4/8 页 6 CN 111500759 A 6 0058 4.PCR扩增 0059 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同。 PCR 反应体系为30uL，均包括DNA模板1uL，上下游引物各1uL， 2Taq PCR mix 15uL，无菌水12uL，混合均匀，冰上操作。 0060 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增程序相同。其最佳反应条件为： 93-94 预变性5min， 93-94变性30-45s， 52-54.4退火35s， 72延伸1min，共35个循环， 72 延伸10。

24、min。 0061 5.琼脂糖凝胶电泳 0062 使用上述方法获得PCR扩增产物，扩增产物用0.8-1的琼脂糖凝胶电泳检测。用引物对M1F/M1R扩增时，扩增产物有720bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因 MAT1-1；用引物对M2F/M2R扩增时，扩增产物有400bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因MAT1-2；检测样品如果同时检测到两条目的条带，则预测该样品可以出菇，进行下一步工作；若只有其中一条目的条带则说明该样品不能出菇，生产中被淘汰，不可作为栽培。 0063 实施例3：引物对特异性分析 0064 参见图8，本发明所筛选的引物对M1。

25、F/M1R和M2F/M2R分别只能特异性扩增羊肚菌交配型基因MAT1-1和MAT1-2。其中， M为 Marker， 1和7泳道分别为羊肚菌为模板扩增的 MAT1-1和MAT1-2条带，剩余泳道分别为金耳、炭角菌、灰树花、大球盖菇为模板的扩增结果。 0065 参见图9，本发明所筛选的引物对及对应的鉴定方法准确率高和稳定性好，预期目的条带清晰。从图中可知， 1-12泳道(上)为梯棱羊肚菌菌株，其中1泳道(上)无MAT1-1条带，则此样品在生产上为淘汰样品。另外， 1-24泳道(下)为六妹羊肚菌菌株，其中23-24 泳道 (下)无MAT1-1和MAT1-2条带，表明此。

26、样品在生产上为淘汰样品。 0066 参见图10，泳道1-24(上)为交配型基因MAT1-1扩增结果，泳道1-24(下)为交配型基因MAT1-2扩增结果。 0067 实施例4：羊肚菌菌种生产过程实时取样监测 0068 羊肚菌菌种的生产包括母种、原种、栽培种的生产，即不断移植扩大培养的过程。母种指经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管或培养皿为培养容器和使用单位，也称一级种、试管种；原种指由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。以玻璃菌种瓶(350-400mL)为培养容器，也称二级种；栽培种指由原种移植、扩大培养而成的菌丝。

27、体纯培养物。以聚丙烯塑料袋为培养容器，栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种，也称三级种。羊肚菌菌种生产过程实时取样监测如图11所示。 0069 实施例5：羊肚菌母种监测 0070 1.羊肚菌母种制作 0071 羊肚菌母种的制作培养基：土豆200g，葡萄糖20g， KH2PO4 3g， MgSO4 1.5g，琼脂粉 18g。 0072 2.样品取样 0073 根据菌种生产过程，每一个阶段进行取样，实现交配型基因实时监测。取样方法：母种培养4-7天取培养基表面菌丝体。 0074 3.真菌基因组DNA提取方法 0075 取50-100mg新鲜大型真菌菌丝用液氮研磨。。

28、具体操作步骤参照上海生工生物工程说明书 5/8 页 7 CN 111500759 A 7 公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(批号： B518259)说明书提取DNA。 0076 4.引物设计方法 0077 设计筛选出2对引物：用于检测交配型基因MAT1-1的引物对 M1F/M1R和用于检测交配型基因MAT1-2的引物对M2F/M2R。 M1F 的核苷酸序列为5 -AAGCGGGCTCTTTGTCTTC-3 (SEQ ID NO:21)； M1R的核苷酸序列为5 -CAAGTGGGTGTCATTCGTT-3 (SEQ ID NO:22)； M2F的核苷酸序列为5 -ATC。

29、GCAACACAGAGATGAAG-3 (SEQ ID NO:23)； M2R的核苷酸序列为 5 - CAGTATTATCACCAACCGTAGC-3 (SEQ ID NO:24)。 0078 5.PCR扩增 0079 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同。 PCR 反应体系为30uL，均包括DNA模板1uL，上下游引物各1uL， 2Taq PCR mix 15uL，无菌水12uL，混合均匀，冰上操作。 0080 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增程序相同。其最佳反应条件为： 94预变性5min， 94变性30s， 52.5退火45s。

30、， 72延伸1min，共35个循环， 72延伸10min。 0081 6.琼脂糖凝胶电泳 0082 使用5介绍的方法获得PCR扩增产物，扩增产物用0.8的琼脂糖凝胶电泳检测。用引物对M1F/M1R扩增时，扩增产物有720bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因 MAT1-1；用引物对M2F/M2R 扩增时，扩增产物有400bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因MAT1-2；检测样品如果同时检测到两条目的条带，则预测该样品可以出菇，进行下一步工作；若只有其中一条目的条带则说明该样品不能出菇，生产中被淘汰，不可作为栽培。 0083 7.目的序列测序比对。

31、验证 0084 选取含有目的片段的样品，进行目的片段测序验证，测序结果在 NCBI数据库中进行BLAST序列比对。比对结果为羊肚菌交配型基因 MAT1-1和MAT1-2的序列(SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:26)。 0085 实施例6：羊肚菌原种监测 0086 1.羊肚菌原种生产 0087 羊肚菌原种的制作配方：麦粒70，谷壳13.5，麦麸5，土壤 8，轻质碳酸钙 1，石膏1，糖0.5， KH2PO4 0.5， MgSO4 0.5。 0088 2.样品取样 0089 根据菌种生产过程，每一个阶段进行取样，实现交配型基因实时监测。取样方法：原种培。

32、养10-15天取原种瓶培养料表面菌丝体。 0090 3.真菌基因组DNA提取方法 0091 取50-100mg新鲜大型真菌菌丝用液氮研磨。具体操作步骤参照上海生工生物工程公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(批号： B518259)说明书提取DNA。 0092 4.引物设计方法 0093 设计筛选出2对引物：用于检测交配型基因MAT1-1的引物对 M1F/M1R和用于检测交配型基因MAT1-2的引物对M2F/M2R。 M1F 的核苷酸序列为5 -AAGCGGGCTCTTTGTCTTC-3 (SEQ ID NO:21)； M1R的核苷酸序列为5 -CAAGTGGGTGTCAT。

33、TCGTT-3 (SEQ ID NO:22)； M2F的核苷酸序列为5 -ATCGCAACACAGAGATGAAG-3 (SEQ ID NO:23)； M2R的核苷酸序列为 5 - 说明书 6/8 页 8 CN 111500759 A 8 CAGTATTATCACCAACCGTAGC-3 (SEQ ID NO:24)。 0094 5.PCR扩增 0095 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同。 PCR 反应体系为30uL，均包括DNA模板1uL，上下游引物各1uL， 2Taq PCR mix 15uL，无菌水12uL，混合均匀，冰上操作。 0096 鉴定。

34、交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增程序相同。其最佳反应条件为： 94预变性5min， 93变性40s， 53退火35s， 72延伸1min，共35个循环， 72延伸10min。 0097 6.琼脂糖凝胶电泳 0098 使用5介绍的方法获得PCR扩增产物，扩增产物用0.8-1的琼脂糖凝胶电泳检测。用引物对M1F/M1R扩增时，扩增产物有720bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因 MAT1-1；用引物对M2F/M2R 扩增时，扩增产物有400bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因MAT1-2；检测样品如果同时检测到两条目的条带，则预测该样品可以。

35、出菇，进行下一步工作；若只有其中一条目的条带则说明该样品不能出菇，生产中被淘汰，不可作为栽培。 0099 7.目的序列测序比对验证 0100 选取含有目的片段的样品，进行目的片段测序验证，测序结果在 NCBI数据库中进行BLAST序列比对。比对结果为羊肚菌交配型基因 MAT1-1和MAT1-2的序列(SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:26)。 0101 实施例7：羊肚菌栽培种监测 0102 1.羊肚菌栽培种生产 0103 羊肚菌栽培种的制作配方：麦粒50，木屑12，谷壳14，土壤15，麦麸5，轻质碳酸钙1，石膏1， KH2PO4 1，糖1。。

36、 0104 2.样品取样 0105 根据菌种生产过程，每一个阶段进行取样，实现交配型基因实时监测。取样方法：栽培种培养12-18天取菌袋培养料表面菌丝体。 0106 3.真菌基因组DNA提取方法 0107 取50-100mg新鲜大型真菌菌丝用液氮研磨。具体操作步骤参照上海生工生物工程公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(批号： B518259)说明书提取DNA。 0108 4.引物设计方法 0109 设计筛选出2对引物：用于检测交配型基因MAT1-1的引物对 M1F/M1R和用于检测交配型基因MAT1-2的引物对M2F/M2R。 M1F 的核苷酸序列为5 -AAGC。

37、GGGCTCTTTGTCTTC-3 (SEQ ID NO:21)； M1R的核苷酸序列为5 -CAAGTGGGTGTCATTCGTT-3 (SEQ ID NO:22)； M2F 的核苷酸序列为5 -ATCGCAACACAGAGATGAAG-3 (SEQ ID NO:23)； M2R的核苷酸序列为 5 - CAGTATTATCACCAACCGTAGC-3 (SEQ ID NO:24)。 0110 5.PCR扩增 0111 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同。 PCR 反应体系为30uL，均包括DNA模板1uL，上下游引物各1uL， 2Taq PCR mix 15u。

38、L，无菌水12uL，混合均匀，冰上操作。 0112 鉴定交配型基因MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增程序相同。其最佳反应条件为： 94预说明书 7/8 页 9 CN 111500759 A 9 变性5min， 93变性45s， 54.4退火30s， 72 延伸1min，共35个循环， 72延伸10min。 0113 6.琼脂糖凝胶电泳 0114 使用5介绍的方法获得PCR扩增产物，扩增产物用0.8-1的琼脂糖凝胶电泳检测。用引物对M1F/M1R扩增时，扩增产物有720bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因 MAT1-1；用引物对M2F/M2R 扩增时，扩增产。

39、物有400bp左右的唯一目的条带，表明菌株含交配型基因MAT1-2；检测样品如果同时检测到两条目的条带，则预测该样品可以出菇，进行下一步工作；若只有其中一条目的条带则说明该样品不能出菇，生产中被淘汰，不可作为栽培。 0115 7.目的序列测序比对验证 0116 选取含有目的片段的样品，进行目的片段测序验证，测序结果在 NCBI数据库中进行BLAST序列比对。比对结果为羊肚菌交配型基因 MAT1-1和MAT1-2的序列(SEQ ID NO:25 和SEQ ID NO:26)。 0117 参考文献 0118 1柴红梅,赵永昌,陈卫民,张小雷,苏开美,刘萍,陈立佼.鉴定梯。

40、棱羊肚菌交配型基因的方法和特异引物对P.CN106282396A, 2017-01-04. 0119 2柴红梅,赵永昌,陈卫民,苏开美,张小雷,刘萍,陈立佼.鉴定黑色羊肚菌类群中四个种的交配型基因方法和引物对P. CN106282397A,2017-01-04. 0120 3谭昊,甘炳成,彭卫红,王波,苗人云,刘天海,黄忠乾.羊肚菌交配型基因决定基因鉴定专用引物及出菇能力预测方法P. CN106282370A,2017-01-04. 0121 4杜习慧,杨祝良 .鉴定黑色羊肚菌类群中十一个种的交配型基因方法P .CN107151698A,2017-09-12.。说明书 8/8 页 10。

41、 CN 111500759 A 10 SEQUENCE LISTING 云南菌视界生物科技有限公司一种鉴定商业化栽培羊肚菌种类交配型基因的方法和引物对 SPI201675-63 26 PatentIn version 3.5 1 25 DNA 正向引物P8-4F 1 gctctcttgt gccccttttg actat 25 2 25 DNA 反向引物P8-4R 2 tctaccagcc atgtgaaaca agcaa 25 3 25 DNA 正向引物P6-1F 3 gagactcaaa tctgactgac ttcct 25 4 25 DNA 反向引物P6-1R 4 gaagaacct。

42、c agataagcgt aaaat 25 5 25 DNA 正向引物P7-2F 5 ccggtttatc ttactggact ggttc 25 6 25 序列表 1/5 页 11 CN 111500759 A 11 DNA 反向引物P7-2R 6 gctttcctct tctctcgttg ccata 25 7 25 DNA 正向引物P8-5F 7 atgtcactcc gtccggttta cctta 25 8 25 DNA 反向引物P8-5R 8 tggaatgtct gtgattgagg ctgtg 25 9 25 DNA 正向引物P10-1F 9 ggccagaaca gatgct。

43、cgaa gaagc 25 10 25 DNA 反向引物P10-2R 10 ctcccaaagc atgatcaaat ccctc 25 11 25 DNA 正向引物P10-2F 11 agaccgcttt agatagattg gcagg 25 12 25 DNA 反向引物P10-3R 12 序列表 2/5 页 12 CN 111500759 A 12 gatcaaatcc ctccattaag gcatc 25 13 29 DNA 正向引物Mr1MAT1-1-1F 13 atggctcact cttatgcatc gacttgtac 29 14 27 DNA 反向引物Mr1MAT1-1-1。

44、-R 14 ggctgtggaa agtctttgga ggtgtag 27 15 28 DNA 正向引物Mr1MAT1-2-1-F 15 aagaccgctt tagatagatt ggcaggac 28 16 28 DNA 反向引物Mr1MAT1-2-1-R 16 aacagccttc atctctgtgt tgcgatag 28 17 20 DNA 正向引物MAT1-1L 17 ttaccttact ggactggttc 20 18 20 DNA 反向引物MAT1-1R 18 aatgcaagta ggtgtcattc 20 19 20 序列表 3/5 页 13 CN 111500759。

45、 A 13 DNA 正向引物MAT1-2L 19 tcctatgaat gcgtaagttc 20 20 20 DNA 反向引物MAT1-2R 20 gtattatcac caaccgtagc 20 21 19 DNA 正向引物M1F 21 aagcgggctc tttgtcttc 19 22 19 DNA 反向引物M1R 22 caagtgggtg tcattcgtt 19 23 20 DNA 正向引物M2F 23 atcgcaacac agagatgaag 20 24 22 DNA 反向引物M2R 24 cagtattatc accaaccgta gc 22 25 716 DNA 交配型基。

46、因MAT1-1 25 序列表 4/5 页 14 CN 111500759 A 14 aaggcggggt tttttgtctt cgcaacgcca ctttgggttg cgctctctat ctctcgaaaa 60 cccatcaata ccttttaatg caagaccgag gcggtggaat ctgggttcaa cacaaagact 120 gtcgatatat tgtgccccca ccaggagggt cggtatttca ggtgcagggc agacccctcc 180 cgttccagag atggctcact cttatgcatc gacttgtacg tcagg。

47、aggga agggctgggc 240 tagaccctaa gaccccatac aagtgtgcag tccaaaggct ttatggtgaa cactacaaga 300 gtaataggcc gattattgat gaaccgttga ctaaacgttc tgttttgaaa gccctaaacc 360 cttacatagc acatagaagt aaggaagaaa gaatcccctt tctaattaat ttcagattta 420 atttatttct ttttagcttg gatatcaaaa ttcctgggag gactaggatt tacccagatg 480。

48、 ctgatttcag cactcaccaa aggtgtatgg caacgagaga agaggaaagc catgtggtcc 540 aatatagcaa ggttgtacac ctaccaccgg gatcaaggga cgcttacatc tactctcgaa 600 gattttatca aagcacagct tgtcgagaat aaacaagatc cttcccctag ctcgttccta 660 cacaactgcg gtataaaact cgacgatgtg agaaaacgaa tgccccccac cttgaa 716 26 401 DNA 交配型基因MAT1-2 。

49、26 gatcgcaaca cagagatgaa ggctgttcgc cagaaatacc cggggattgg gaacaacgat 60 gtttgtaagt ttttttgttg ctcatttatc cctcaaaacc tgataatatg tgttcgtttt 120 gacccttttg atcattttat tgacaattta cgttatagcg cggatcgtcg ggcaacggtg 180 gcgagagctt gatcctaaga ttagagagca ttataaggtg aattaaaaat aataatcact 240 tcaagtaaat atgctca。

50、tat tgctaatcta gaaaaggatt tggccgcaaa atctgcacga 300 gagcaccacg taaagcatcc tgggtataag tatacacctc ggaaacctga agatgttgtt 360 cgccgccgca agaagtcagc tacggttggt gataatactg a 401 序列表 5/5 页 15 CN 111500759 A 15 图1A 说明书附图 1/9 页 16 CN 111500759 A 16 图1B 说明书附图 2/9 页 17 CN 111500759 A 17 图1C 说明书附图 3/9 页 18 CN 1。