一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法与流程

• 花匠小妙招
• 2024-09-15 04:07

本发明属于植物种质资源创新领域，具体地涉及公开一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法。
背景技术：
：国兰(chinesecymbidium)是指兰属(cymbidium)兰花中的地生种类，包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰等，在中国有着悠久的栽培历史和深厚的文化内涵，市场前景广阔。2015年国兰的国内年销售额为12.24亿元人民币，其中墨兰占比最高。随着我国经济的发展、人们生活质量的不断提高以及兰文化的普及和推广，国兰必将越来越受到国内消费者的喜爱。同时随着中国的逐渐强盛，作为中国传统文化载体的国兰还具有广阔的国际市场。墨兰(cymbidiumsinense)香气浓郁、花枝挺俊、叶姿矫健、叶艺亮丽、适用性广，是国兰中最先被驯化栽培、最普及和最重要的种类之一，是中国兰文化的重要物质载体。作为中国传统文化物质载体的墨兰，曾经是文人雅士、达官贵人的赏玩对象，但随着我国经济发展和人民生活水平的提高，“宰相养兰、百姓种花”将成为历史，墨兰走进千家万户将成为必然，因此墨兰产业化发展势在必行。种苗工厂化生产是兰花产业化发展的基础。目前，传统墨兰种苗工厂化繁殖难，无法实现种苗工厂化生产。因此传统墨兰仍然靠分株繁殖，这种繁殖方式速度慢，不适应墨兰新品种推广和产业化发展的要求，同时长期分株繁殖导致种苗质量下降，生长成本增高，效益降低，竞争能力减弱。近年来由于长期分株繁殖造成墨兰种苗质量下降，抗病性降低、造成茎腐病频发，已对墨兰生产者造成巨大经济损失，一些墨兰生产者不得不放弃墨兰生产。因此，创建易工厂化繁殖墨兰资源，对培育适合产业化发展的墨兰新品种，进一步推动我国墨兰产业转型升级，提高兰花产业源头创新能力、竞争力和效益，推广普及兰文化均具有重要意义。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法。该方法通过选择含墨兰基因组的杂交兰为核心亲本配置杂交组合，通过单种子离体培养评价杂交后代的中间繁殖体类型及其组培快繁能力，并进行试管苗生产，对生产出的试管苗进行鉴定和移栽，从而获得易工厂化繁殖的墨兰资源。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法，包括以下步骤：s1.亲本选择与杂交组合配置：根据育种目标，选择含墨兰基因组的杂交兰为核心亲本配置杂交组合，获得果实；s2.单种子培养与中间繁殖体形态及增殖能力鉴定：对杂交后代种子进行无菌播种获得中间繁殖体，对单粒种子形成的中间繁殖体进行继代培养，观测中间繁殖体增殖能力和类型，选择增殖能力强且为根状茎类型的中间繁殖体；s3.植株再生与再生能力及试管苗形态鉴定：对中选的中间繁殖体进行植株再生，观测其再生成苗能力和试管苗形态，选择植株再生能力强且试管苗形态为墨兰型或似墨兰型的株系；s4.易工厂化繁殖墨兰资源的获得：对获得的株型为墨兰型或似墨兰型的试管苗进行移栽和栽培，即可获得易工厂化繁殖墨兰资源。步骤s1中按照母本为含墨兰基因组的杂交兰、父本为墨兰；或母本为墨兰、父本为含墨兰基因组的杂交兰；或父母本均为含墨兰基因组的杂交兰配置杂交组合。步骤s2所述的单种子培养与中间繁殖体形态及增殖能力鉴定包括以下步骤：s21.果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150～190天的果实洗净，然后用75％乙醇消毒7～10分钟，无菌水冲洗2～4次，取其内部种子接种到种子萌发培养基上培养；培养条件为温度26±1℃，暗培养；s22.中间繁殖体的增殖：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，单独接种于增殖培养基上培养，形成中间繁殖体系；培养条件为温度26±1℃，每日光照8～12小时，光照强度500～1000lux；s23.中间繁殖体增殖能力和形态鉴定：对各中间繁殖体系的形态进行观察，选择形态为根状茎的中间繁殖体系；将根状茎掰成长度约0.7～1.3cm的小段于增殖培养基上进行增殖培养，选择增殖60天后增殖系数大于2.0的中间繁殖体系。进一步地，步骤s21中所述的种子萌发培养基配方为ms培养基+0.3～1.0mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+10～20％(v/v)椰子汁+20～40g/l蔗糖+0.3～0.5g/l活性炭(ac)+7～8g/l卡拉胶。优选的，所述的种子萌发培养基配方为ms培养基+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+10％(v/v)椰子汁+30g/l蔗糖+0.5g/l活性炭(ac)+7.5g/l卡拉胶。进一步地，步骤s22和s23中所述的增殖培养基配方为ms培养基+0.5～2.0mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+0～20％(v/v)椰子汁+20～40g/l蔗糖+0.3～0.5g/l活性炭(ac)+7～8g/l卡拉胶。优选的，所述的增殖培养基配方为ms培养基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.5g/l活性炭(ac)+7.5g/l卡拉胶。步骤s3中所述植株再生与再生能力及试管苗形态鉴定包括如下步骤：s31.分化培养：将增殖培养后根状茎直接或分开转接到分化培养基上培养，每瓶接8～15条(块)；培养条件为温度26±1℃，每日光照10～12小时，光照强度1000～1200lux；s32.生根壮苗培养：将株高3～5cm的芽或苗从根状茎上掰下，接种到生根壮苗培养基上培养，每瓶接8～10株；培养条件为温度26±1℃，每日光照10～12小时，光照强度1200～2000lux；s33.再生能力和试管苗形态鉴定：观测根状茎分化和生根壮苗过程，选择易分化成苗、出叶时间间隔长、芽苗生长速度快的株系；对获得的试管苗形态进行观察，选择试管苗形态为墨兰型或似墨兰型的株系，即株型紧凑、叶姿直立、叶横截面形状近v字形的株系。进一步地，步骤s31中所述的分化培养基配方为ms培养基+1.0～3.0mg/l6-ba+0.1～0.5mg/lnaa+20～40g/l蔗糖+0.01～0.3g/l活性炭+7～8g/l卡拉胶。优选的，所述的分化培养基配方为ms培养基+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.1g/l活性炭+7.5g/l卡拉胶。步骤s32中所述的生根壮苗培养基配方为1/2ms培养基+0.1～0.2mg/l6-ba+0.5～2mg/lnaa+20～40g/l蔗糖+0.3～0.5g/l活性炭+7～8g/l卡拉胶。优选的，所述的生根壮苗培养基配方为1/2ms培养基+0.2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+20g/l蔗糖+0.5g/l活性炭+7.5g/l卡拉胶。步骤s4所述的易工厂化繁殖墨兰资源的获得包括以下步骤：s41.试管苗移栽：选择苗高大于或等于8cm，根系健壮的试管苗洗净晾干后进行移栽，移栽基质为6号树皮+泥炭(1～2：1)的混合基质，移栽容器为6×6或8×8的黑色塑料杯，移栽后在4000～6000lux光照、80～95％相对湿度、20～30℃温度、通风良好下栽培7～10天，试管苗成活后转入常规管理；s42.易工厂化繁殖墨兰资源的获得：将生长10个月的小苗进行换盆，移栽基质为4号树皮+泥炭(2～3：1)的混合基质，移栽容器为14×14或15×15的黑色塑料杯中，成活后转入常规管理。本发明利用上述方法，在步骤s1中选择母本为含墨兰基因组的杂交兰‘玉女兰’，父本为‘黄叶红墨’墨兰配制的杂交组合作为示例，通过筛选获得了易工厂化繁殖的墨兰资源d26和d521。与传统墨兰‘企剑白墨’相比，d26和d521的组培快繁能力得到很大改善，且这种改善效果不因激素浓度的改变而降低。表明采用本发明的亲本选配和后代筛选方法，能够获得易工厂化繁殖的墨兰资源。本发明的机理是：大花蕙兰(cymbidiumhybridum)种苗易工厂化生产，和墨兰有很好的杂交亲和性，通过杂交和回交可以将大花蕙兰中的易组培快繁基因导入到墨兰中，从而创建出易工厂化繁殖的墨兰资源。本发明就是通过杂交和回交的方法，结合在试管中选择和鉴定，将大花蕙兰中易工厂化繁殖基因转入墨兰中，创建易工厂化墨兰资源，为推动墨兰产业化发展奠定基础。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明提供的方法在试管内完成易工厂化墨兰资源的选择，与现有育种移栽成苗后再进行选择相比，显著缩短育种年限，节约人力物力；(2)传统墨兰品种种苗依靠分株繁殖，不利于墨兰产业化发展。本发明提供的方法能够真正改善传统墨兰的组培快繁能力，获得易工厂化繁殖的墨兰新资源，实现墨兰种苗工厂化生产，对推动墨兰产业化发展有重要现实意义。附图说明图1是本发明创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法流程图。图2是典型的墨兰试管苗和典型的大花蕙兰试管苗。图3是‘玉女兰’ב黄叶红墨’墨兰79个株系的中间繁殖体形态，其中，a为不同中间繁殖体形态(根状茎：d333，根状茎：d432，中间类型：d54，类原球茎：d158)；b为中间繁殖体形态的比例分布。图4是‘玉女兰’ב黄叶红墨’墨兰53个株系的试管苗形态，其中，a为不同试管苗形态(墨兰型：d333，似墨兰型：d26，大花蕙兰型：d524)；b为试管苗形态的比例分布。图5是易工厂化繁殖的墨兰资源d26和d521的试管苗。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实例中所述培养基、试剂等均为本领域的普通技术人员通过购买可以得到。实施例中所用的‘企剑白墨’墨兰、‘金作家’大花蕙兰、杂交兰‘玉女兰’在文献“杂交兰新品种‘玉女兰’.园艺学报2014,41(2)：401-402.”中公开。所用的‘黄叶红墨’墨兰，购自广州市怡香兰花科技有限公司。所用的‘楠山幻想曲’大花蕙兰(二倍体)在文献“环境胁迫对不同倍性大花蕙兰类原球茎增殖和分化的影响[j].植物生理学报,2015,51(08):1265-1272.”中公开。所用的6号树皮和4号树皮购自中山市神湾镇崧堡园艺用品经营部，所用泥炭购自广州市三力园艺有限公司。实施例1：易工厂化繁殖墨兰资源的创建2011年起我们用本发明所述的方法进行易工厂化繁殖的墨兰资源的创建，具体方法如下(流程如图1所示)：s1.亲本选配和杂交组合配置：选择以‘企剑白墨’墨兰和‘金作家’大花蕙兰杂交获得的含一半墨兰基因组的杂交兰‘玉女兰’为核心亲本材料，2011年2月20日以‘玉女兰’为母本，‘黄叶红墨’墨兰为父本配制杂交组合，同年8月24日收获果实。s2.单种子培养与中间繁殖体形态及增殖能力鉴定：s21.果实消毒、接种和初代培养：将杂交后发育185天的果实用用解剖刀去掉果柄，修理果实顶部，蘸取洗洁精刷洗后用自来水冲洗5～6min，晾干，在超净工作台上用75％的酒精浸泡8～10min，无菌水冲洗3～4次后，用无菌解剖刀切开取其内部种子接种到成分为ms+0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+7.5g/l卡拉胶+10％椰子汁+0.5g/l活性炭的种子萌发培养基上培养。培养条件为温度26±1℃，暗培养；s22.中间繁殖体的增殖：将单个种子萌发后形成的中间繁殖体一一分开，接种到成分为ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+7.5g/l卡拉胶+30.0g/l蔗糖+0.5g/lac的增殖培养基上培养；培养条件为温度26±1℃，每日光照12小时，光照强度800lux；增殖培养继代两次，共计获得中间繁殖体系79个；s23.中间繁殖体增殖能力和形态鉴定：对79个中间繁殖体系的中间繁殖体形态进行观测，判定依据见表1；该中间繁殖体系的中间繁殖体形态绝大部分为根状茎(67.09％)，其次为中间类型(27.85％)，类原球茎仅占5.06％(图3)；通过选择获得53个根状茎株系，对根状茎进行增殖试验，将其掰成长度约0.7～1.3cm的小段进行增殖培养，培养基和培养条件同s22，将增殖60天后增殖系数大于2.0的株系判定为增殖能力强，获得增殖能力强的根状茎株系36个(表3)。s3.植株再生与再生能力及试管苗形态鉴定：s31.分化培养：将步骤s22和s23中增殖获得的根状茎掰下或直接转接到成分为ms+1.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+7.5g/l卡拉胶+30.0g/l蔗糖+0.1g/lac的分化培养基上进行分化培养，每瓶接种8条，每条大小不小于1.0*0.25cm2；培养条件为温度26±1℃，每日光照12小时，光照强度1200lux；s32.生根壮苗培养：将株高为3～5cm的芽或苗从根状茎上掰下，注意不要伤根，然后直立接种于成分为1/2ms+0.2mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+7.5g/l卡拉胶+20.0g/l蔗糖+0.5g/lac的固体培养基上培养，每瓶接8株。培养条件为温度26±1℃，每日光照12小时，光照强度2000lux；s33.再生能力和试管苗形态鉴定：对获得的36个增殖能力强的根状茎株系经分化和生根壮苗培养最终获得的苗数进行统计，将平均每瓶中间繁殖体能够获得6株苗以上的株系判定为再生能力强，易分化成苗(表3)；对获得的试管苗形态进行观测，判定依据见表2，典型的墨兰(‘企剑白墨’)和大花蕙兰(‘楠山幻想曲’)试管苗见图2；这36个株系的试管苗形态大部分为大花蕙兰型(50.00％)，其次为似墨兰型(33.33％)，墨兰型(8.33％)最少(图4)，选择试管苗形态为墨兰型及似墨兰型、再生能力强的株系，获得了编号为d26和d521两个株系，其试管苗形态分别为似墨兰型和墨兰型(图5)，再生能力强，易分化成苗(表3)。s4.易工厂化繁殖墨兰资源的获得：s41.试管苗移栽：选择d26和d521在步骤s32和s33中获得的，且苗高大于或等于8cm，根系健壮的试管苗洗净晾干后进行移栽，移栽基质为6号树皮+泥炭(2﹕1)的混合基质，移栽容器为8×8的黑色塑料杯，移栽后在5000lux左右光照、80～95％相对湿度、20～30℃温度、通风良好下栽培7～10天，试管苗成活后转入常规管理；s42.易工厂化繁殖墨兰资源的获得：将d26和d521生长10个月的小苗进行换盆，移栽基质为4号树皮+泥炭(2～3﹕1)的混合基质，移栽容器为14×14的黑色塑料杯，成活后转入常规管理。表1兰花中间繁殖体形态分类及其标准中间繁殖体形态形状分化前是否伸长类原球茎圆球形或近球形轻微伸长中间类型圆球形或近球形明显伸长根状茎长条形明显伸长表2兰花试管苗类型及形态标准编号性状观测方法及赋值1株型紧凑(1)、较紧凑(2)、松散(3)2叶片横截面形状v型(1)、u型(2)、-型(3)3出叶间隔时间长(1)、中(2)、短(3)4叶姿直立(1)；半直立(2)；披垂(3)5叶数少(1)、中(2)、多(3)6叶色深绿(1)；中绿(2)；浅绿(3)7叶面光泽度强(1)、中(2)、弱(3)8试管苗生长速度慢(1)、中(2)、快(3)注：前3个性状均为1，且以下任2个性状为1的株系为墨兰型；前3个性状均为1的株系为似墨兰型；不满足以上条件的均为大花蕙兰型。表3‘玉女兰’ב黄叶红墨’墨兰79个杂交后代的组培特征特性注：‘-’代表该数据未统计，下同。实施例2：d26和d521的组培快繁特性为了进一步验证获得的新资源是否比传统墨兰更易进行工厂化繁殖，以传统墨兰‘企剑白墨’为对照，与d26和d521共同进行组织培养试验。1.根状茎的增殖特性利用‘企剑白墨’墨兰、d26和d521生长均匀的根状茎进行增殖试验，仅对培养基中的6-ba浓度进行改变(1.0mg/l，1.5mg/l和2.0mg/l)，其余培养基成分和培养条件保持一致，培养前和培养40天后称重，计算绝对增殖率(绝对增殖率(％)＝(培养后总重-初始总重)/初始总重×100％)。试验结果如表4所示，d26和d521的绝对增殖率都显著高于‘企剑白墨’墨兰(72.19％)，分别达到155.93％和126.38％。而d26和d521褐化死亡率显著低于‘企剑白墨’墨兰(23.19％)，分别为11.39％和12.50％。6-ba浓度对‘企剑白墨’墨兰和d26绝对增殖率的影响不显著，但对d521的影响显著，6-ba浓度为1.0mg/l时，d521的绝对增殖率最高(142.92％)，6-ba浓度为1.5mg/l时，株系d521的绝对增殖率最低(113.49％)，但该最低值仍明显高于‘企剑白墨’墨兰的最高值(80.07％)。表4d26和d521的根状茎增殖特性及6-ba浓度的影响注：株系平均值一列中不同小写字母表示株系间差异显著(p≤0.05)，相同字母表示差异不显著。在其他列中的不同小写字母则代表单一株系在不同6-ba浓度下的差异。下表同。2.根状茎的分化特性利用‘企剑白墨’墨兰、d26和d521生长均匀的根状茎进行分化试验，仅对培养基中的6-ba浓度进行改变(1.0mg/l，2.0mg/l和3.0mg/l)，其余培养基成分和培养条件保持一致，培养60天后记录分化芽数和褐化死亡的根状茎数，计算芽分化率和褐化死亡率(芽分化率(％)＝芽分化数/接入根状茎条数×100％；褐化死亡率(％)＝褐化死亡的根状茎数/接入根状茎数×100％)。试验结果如表5所示，d26和d521的芽分化率均显著高于‘企剑白墨’墨兰(113.72％)，其中d26的芽分化率最高(618.64％)，d521的芽分化率(430.14％)略低于d26，以上差异均达到显著水平。分化过程中，d26和d521的根状茎褐化死亡率均显著低于‘企剑白墨’墨兰(20.29％)，分别为1.25％和4.30％。6-ba浓度对‘企剑白墨’墨兰和d26芽分化的影响显著，对d521的影响不显著(表5)，‘企剑白墨’墨兰和d26的芽分化率都随6-ba浓度的升高而升高，但‘企剑白墨墨兰’的最大值(144.90％)仍远低于d26和d521的最小值(405.83％)。表5d26和d521的根状茎分化特性及6-ba浓度的影响3.生根壮苗特性由于‘企剑白墨’墨兰在相同分化过程中未能获得足够数量的小芽进行生根壮苗试验，故利用d26和d521分化培养诱导获得的芽高大于或等于2cm的无根芽进行生根壮苗试验，仅对培养基中的naa浓度进行改变(1.0mg/l和0.5mg/l)，其余培养基成分和培养条件保持一致，培养60天后记录成苗数，计算成苗率(成苗率(％)＝生根成苗数/接入无根芽数×100％)。试验结果如表6所示，d26和d521的成苗率没有显著差异，成苗率能够达到83.67％和82.00％，平均每芽生根数为1.88和1.85条(表5)。naa浓度对d26和d521的成苗率的影响不显著，说明d26和d521都很容易生根成苗，不受naa浓度变化的影响。表6d26和d521的生根壮苗特性及naa浓度的影响上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12

技术特征：

技术总结
本发明公开一种创建易工厂化繁殖墨兰资源的方法，属于植物种质资源创新领域。该方法通过选择含墨兰基因组的杂交兰为核心亲本配置杂交组合，通过单种子离体培养评价杂交后代的中间繁殖体类型及其组培快繁能力，并进行试管苗生产，对生产出的试管苗进行鉴定和移栽，从而获得易工厂化繁殖的墨兰资源。本发明提供的方法在试管内完成易工厂化墨兰资源的选择，与现有育种移栽成苗后再进行选择相比，显著缩短育种年限，节约人力物力；且能够真正改善传统墨兰的组培快繁能力，获得易工厂化繁殖的墨兰新资源，实现墨兰种苗工厂化生产，对推动墨兰产业化发展有重要现实意义。

技术研发人员：张志胜;刘阳;郭和蓉;李洁铌;谢利;曾瑞珍
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2017.09.26
技术公布日：2018.02.09

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