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促进葡萄花青苷合成的VlbZIP30基因及其应用

花匠小妙招
2024-12-25 11:39

促进葡萄花青苷合成的VlbZIP30基因及其应用
(kyoho)中克隆bzip家族基因vlbzip30，并通过农杆菌介导的稳定遗传转化法将其成功转化到
‘
无核白’(thompson seedless)葡萄中，通过表型观察发现过表达vlbzip30的转基因无核白葡萄茎和叶片显著变红，推测该基因在参与花青苷生物合成途径中起到非常重要的作用，并进一步探究了vlbzip30调控花青苷合成的基因功能及其可能的作用机制，为提升葡萄果实品质提供分子理论基础及可用的基因资源，为加速选育优质葡萄新品种有重要的理论意义和应用价值。

技术实现要素：

6.本发明的目的是提供促进葡萄花青苷合成的vlbzip30基因，并证明了该基因在提高葡萄花青苷含量方面的功能。
7.本发明所采用的技术方案是，促进葡萄花青苷合成的vlbzip30基因，该基因的编码区序列是：
[0008][0009][0010]
vlbzip30基因编码的蛋白，蛋白的氨基酸序列是：
[0011][0012]
本发明所采用的另一技术方案是，促进葡萄花青苷合成的vlbzip30基因在提高葡萄的花青苷含量中的应用。
[0013]
本发明的有益效果是：
[0014]
本发明的欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因能明显提高葡萄花青苷的合成。本发明的vlbzip30基因是通过调控vvchi1、vvchs3、vvf3h、vvf3’h、vvfls5等花青苷生物合成关键基因的表达，来促进天竺葵素-3-o-葡萄糖苷、芍药花素-3-o-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-o-葡萄糖苷、矢车菊素-3-o-半乳糖苷、芍药花素-3-o-葡萄糖苷、飞燕草素-3-o-葡萄糖苷、牵牛花素-3-o-葡萄糖苷、矢车菊素-3-o-(6
”‑
乙酰葡萄糖苷)、芍药花素-3-(6
”‑
乙酰葡萄糖苷)、锦葵色素-3-o-丙二酰葡萄糖苷、矢车菊素-3-o-(6
”‑
对香豆酰葡萄糖苷)和芍药花素-3,5-o-二葡萄糖苷等花青苷代谢物的合成，进而行使提高葡萄花青苷合成的生物学功能。
附图说明
[0015]
图1是与野生对照(wt)相比vlbzip30转基因葡萄株系(#24、#25和#27)的花青苷含量；a图是野生对照(wt)与过表达vlbzip30转基因葡萄株系(#24、#25和#27)4个月苗龄的表型观察图；b图是野生对照(wt)与过表达vlbzip30转基因葡萄株系(#24、#25和#27)5个月苗龄叶片中的花青苷含量测定图；c图是野生对照(wt)与过表达vlbzip30转基因葡萄株系(#24、#25和#27)4个月苗龄茎中的花青苷含量测定图；**表示与野生对照相比有极显著差异(**p《0.01，学生t检验)；
[0016]
图2是对4个月苗龄的野生对照(wt)和vlbzip30转基因葡萄株系(#25)进行广靶代谢组测定；a图是不同差异富集代谢物组分的数量；b图是不同差异富集类黄酮组分的数量；
[0017]
图3是vlbzip30参与调节葡萄花青素生物合成的机制图；a图中的热图表示转基因(#25)和野生型(wt)植物叶片中与类黄酮代谢相关的差异表达基因(deg)的转录调控；b图中的热图代表#25和wt植物中与类黄酮代谢相关的差异富集的代谢物的相对积累水平；
[0018]
图4是通过定量实时(qrt)-pcr分析在转基因株系(#24、#25和#27)和野生型(wt)植物的叶子受vlbzip30诱导表达的类黄酮生物合成基因的表达水平；星号表示转基因和wt植物之间的统计显着性(**p《0.01，*0.01《p《0.05，学生t检验)。
具体实施方式
[0019]
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0020]
本发明构建了pcambia2300-35s-3
×
flag-vlbzip30过量表达载体，并通过农杆菌
介导的遗传转化法将其导入无核白葡萄中。研究了欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30过量表达的转基因株系和野生对照在正常生长条件下，其花青苷积累的情况。
[0021]
发明人利用同源克隆技术，根据欧洲葡萄黑比诺(vitis vinifera)vvbzip30的cds序列设计特异性引物，以欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’(kyoho)叶片总rna反转录合成cdna第一链为模板，扩增了vlbzip30开放阅读框序列，该基因完整开放阅读框序列全长978bp，编码325个氨基酸。
[0022]
为了研究欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因在同源系统葡萄中的生物学功能，发明人构建了pcambia2300-35s-3
×
flag-vlbzip30(酶切位点为xbai和kpni)过量表达载体，将其在汤姆森
‘
无核白’(thompson seedless)葡萄中过量表达，分析该基因的生物学功能。表型观察发现在正常生长条件下，与野生对照相比，4个月苗龄的转基因植株叶片和茎显著变红。通过含量提取后发现，转基因植株叶片和茎中的花青苷含量显著高于野生对照的。
[0023]
为了进一步了解vlbzip30具体参与何种花青苷代谢物的积累，对4个月苗龄的野生型对照和转基因植株进行广靶代谢组测定，结果发现在正常生长条件下，与野生对照相比，在转基因植株中共有435种代谢物有所差异，其中有227种代谢物质显著增加，有208种代谢物质减少。发明人对显著积累的代谢物进行统计，发现主要为黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄烷醇、原花色苷和花色苷等物质。其中显著积累的花色苷主要是矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-乙酰)葡萄糖苷，飞燕草素-3-o-(6
”‑
o-阿魏酰)葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，芍药花素-3,5-o-二葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-对香豆酰)葡萄糖苷，芍药花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，牵牛花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，锦葵色素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷等。结果表明在正常生长条件下，转基因植株中的花青素含量显著高于野生对照的。说明欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因的过量表达显著促进了葡萄中花青苷的合成。
[0024]
为了进一步了解vlbzip30参与花青苷生物合成的作用机制，对4个月苗龄的野生型和转基因植株进行转录组测序，发现在正常生长条件下，与野生型相比，在转基因植株中有1796个差异表达基因上调表达和1398个差异表达基因下调表达。通过转录组与代谢组数据关联分析后发现，花青苷生物合成途径中基因的表达(1个chs，vit_05s0136g00260；1个chi，vit_13s0067g03820；1个f3'5'h，vit_08s0007g05160；一个f3
′
h vit_17s0000g07200；一个f3h，vit_04s0023g03370；一个dfr基因vit_16s0039g02350)在#25中普遍高于wt，与之对应的代谢物，如查耳酮、柚皮素、圣草酚、二氢槲皮素、二氢山奈酚、二氢杨梅素、花青素等物质也有不同程度的增加。随后发明人对那些受vlbzip30诱导上调表达的差异表达基因进行定量表达分析，发现其中位于花青苷合成通路中关键节点位置的关键基因，包括vvchi1、vvchs3和vvf3h等基因的表达水平在过表达植株中确实显著增加。这些基因在之前的研究报道中已被表明可以直接参与花青苷的合成，因此推测vlbzip30基因可以通过调控vvchi1、vvchs3和vvf3h等花青苷生物合成关键基因的表达，从而提高无核白葡萄中花青苷的合成。
[0025]
以下是欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30的编码区序列以及其提高花青苷生物合成功能实验验证的具体步骤。
[0026]
a、在前期研究分析中，对葡萄47个bzip家族基因进行鉴定的基础上，利用同源克
隆技术，以欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’叶片总rna反转录合成cdna第一链为模板，扩增得到了vlbzip30序列，该欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30的编码区序列如下：
[0027][0028][0029]
该基因编码的氨基酸序列如下：
[0030][0031]
b、参见图1，鉴定了vlbzip30转基因株系(#24、#25和#27)能明显提高无核白葡萄中花青苷的含量。在正常生长条件下，与野生对照相比，4个月苗龄的转基因植株叶片和茎显著变红。通过含量提取后发现，转基因植株叶片和茎中的花青苷含量显著高于野生对照的。
[0032]
c、参见图2，对转基因株系(#25)和野生型无核白葡萄叶片进行广靶代谢组分析。结果发现与野生对照相比，在转基因植株中共有435种代谢物有所差异，其中有227种代谢物质显著增加，有208种代谢物质减少。发明人对显著积累的代谢物进行统计，发现主要为
黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄烷醇、原花色苷和花色苷等物质。其中显著积累的花色苷主要是矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-乙酰)葡萄糖苷，飞燕草素-3-o-(6
”‑
o-阿魏酰)葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，芍药花素-3,5-o-二葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-对香豆酰)葡萄糖苷，芍药花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，牵牛花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，锦葵色素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷等。结果表明在正常生长条件下，转基因植株中的花青素含量显著高于野生对照的。说明欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因的过量表达显著促进了葡萄中花青苷的合成。
[0033]
d、参见图3，通过代谢组与转录组联合分析，结果发现花青苷生物合成途径中的基因的表达在#25中普遍高于wt，与之对应的代谢物，如查耳酮、柚皮素、圣草酚、二氢槲皮素、二氢山奈酚、二氢杨梅素、花青素等物质也有不同程度的增加。
[0034]
e、参见图4，对那些受vlbzip30诱导上调表达的差异表达基因进行定量表达分析，发现其中位于花青苷合成通路中关键节点位置的关键基因，包括vvchi1、vvchs3和vvf3h等基因的表达水平在过表达植株中确实显著增加。这些基因在之前的研究报道中已被表明可以直接参与花青苷的合成，因此发明人推测vlbzip30基因可以通过调控vvchi1、vvchs3和vvf3h等花青苷生物合成关键基因的表达，从而提高无核白葡萄中花青苷的合成。综合上述结果说明vlbzip30具有提高无核白葡萄中花青苷合成的生物学功能。
[0035]
以下是给出的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
[0036]
实施例1：过量表达vlbzip30显著提高无核白葡萄中花青苷的含量
[0037]
通过表型观察发现，与野生对照相比，转基因植株叶片和茎显著变红。通过含量提取后发现，转基因植株叶片和茎中的花青苷含量显著高于野生对照的(图1)。
[0038]
为了进一步了解vlbzip30具体参与何种花青苷代谢物的积累，对4个月苗龄的野生型对照和转基因植株进行广靶代谢组测定，结果发现在正常生长条件下，与野生对照相比，在转基因植株中共有435种代谢物有所差异，其中有227种代谢物质显著增加，有208种代谢物质减少。发明人对显著积累的代谢物进行统计，发现主要为黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮、黄烷醇、原花色苷和花青苷等物质。其中显著积累的花青苷主要是矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-乙酰)葡萄糖苷，飞燕草素-3-o-(6
”‑
o-阿魏酰)葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，芍药花素-3,5-o-二葡萄糖苷，矢车菊素-3-o-(6
”‑
o-对香豆酰)葡萄糖苷，芍药花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，牵牛花素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷，锦葵色素-3-o-(6
”‑
o-咖啡酰)葡萄糖苷等。结果表明在正常生长条件下，转基因植株中的花青素含量显著高于野生对照的。说明欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因的过量表达显著促进了葡萄中花青苷的合成(图2)。结果表明在正常生长条件下，转基因植株中的花青素含量显著高于野生对照的。说明欧美杂交葡萄品种
‘
巨峰’vlbzip30基因的过量表达显著促进了白葡萄中花青苷的合成。
[0039]
实施例2：vlbzip30通过调控花青苷生物合成关键基因的表达来提高葡萄花青苷的合成
[0040]
为了进一步了解vlbzip30参与花青苷生物合成的作用机制，本研究对4个月苗龄的野生型和转基因植株进行转录组测序，发现在正常生长条件下，与野生型相比，在转基因植株中有1796个差异表达基因上调表达和1398个差异表达基因下调表达。通过转录组与代谢组数据关联分析后发现，花青苷生物合成途径中基因的表达(1个chs，vit_
05s0136g00260；1个chi，vit_13s0067g03820；1个f3'5'h，vit_08s0007g05160；一个f3
′
h vit_17s0000g07200；一个f3h，vit_04s0023g03370；一个dfr基因vit_16s0039g02350)在#25中普遍高于wt，与之对应的代谢物，如查耳酮、柚皮素、圣草酚、二氢槲皮素、二氢山奈酚、二氢杨梅素、花青素等物质也有不同程度的增加(图3)。随后发明人对那些受vlbzip30诱导上调表达的差异表达基因进行定量表达分析，发现其中位于花青苷合成通路中关键节点位置的关键基因，包括vvchi1、vvchs3和vvf3h等基因的表达水平在过表达植株中确实显著增加(图4)。这些基因在之前的研究报道中已被表明可以直接参与花青苷的合成，因此发明人推测vlbzip30基因可以通过调控vvchi1、vvchs3和vvf3h等花青苷生物合成关键基因的表达，从而提高无核白葡萄中花青苷的合成。