花后高温对水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累的影响机理
花后高温对水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累的影响机理
作 者: 韦克苏导 师: 程方民
学 校: 浙江大学
专 业: 作物学
关键词: 水稻 高温 淀粉精细结构 粒径分布 淀粉合成 蛋白积累 基因表达
分类号: S511
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
花后高温是影响稻米品质的主要气候因子,同时也是制约许多高产品种产量潜力发挥与品质稳定的逆境因素之一。本文在前期研究工作的基础上,以品质性状的生态表现具有代表性(高温敏感和高温钝感)、且生育期和其他农艺性状相仿的两个早籼稻品种(嘉935和嘉353)为材料,利用大田异季种植和人工气候箱控温处理试验,对不同温度处理下稻米胚乳的淀粉粒径、链长精细结构和贮藏蛋白(蛋白亚基、氨基酸组分等)等品质理化指标的差异变化进行比较分析,并结合cDNA微阵列、定量RT-PCR和蛋白表达分析等技术,对花后高温胁迫下水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累代谢途径的相关基因表达模式与表达谱进行了检测,以揭示花后高温对水稻胚乳淀粉精细结构与贮藏蛋白组分影响的效应机理。主要结果如下：1、花后高温所导致的稻米蒸煮食味品质变劣现象(如糊化温度升高和胶稠度下降等),与不同温度处理下稻米淀粉的粒径分布差异、链长精细结构之间存在着密切联系。花后高温胁迫对稻米淀粉粒粒径的影响表现为：导致小型淀粉粒和中型淀粉粒的数量与相对比例降低,大型淀粉粒的数量与相对比例显著增大,淀粉粒的平均粒径增大,这是稻米糊化温度与糊化热焓值明显升高的重要因素。此外,花后高温会导致稻米直链淀粉的聚合度降低、支链淀粉长B链组分(B3链,DP≥37)的比例上升,短B链组分(B1链,DP13-24)的比例有所下降。与稻米表观直链淀粉含量(AC)的品种类型间差异相似,花后高温胁迫对稻米B2链(DP25-36)与短A链(DP5-12)也表现出一定的品种类型差异。低AC类型品种嘉935在花后高温下的B2链比例上升、短A链比例下降,而高AC类型品种嘉353呈相反趋势。2、花后高温下发育胚乳中的蔗糖转运体(SUT)和蔗糖合成酶(SuSy)主要同工型基因(SUT1, SUT2, SuSy2和SuSy3)的相对表达量降低,但质体转化酶基因(CIN2和CIN7)的相对表达量上升,高温胁迫破坏发育胚乳糖卸载代谢环节两个关键蔗糖合成酶和质体转化酶间的平衡,降低蔗糖的卸载效率；此外,高温胁迫下己糖激酶类的几个主要功能基因(HxKI和HxKⅡ等)上调表达,而果糖激酶类和糖信号作用蛋白的相关功能基因(FrK Ⅰ和FrKⅡ)下调表达,两类基因(HxK类和FrK类)在高温胁迫下的相对表达量呈“此消彼长”变化,说明花后高温抑制己糖磷酸化代谢途径,并改变发育胚乳中的有关糖信号途径及其应答机制,不利于淀粉的合成代谢。3、花后高温对水稻胚乳淀粉精细结构的影响效应涉及到淀粉合成代谢途径多个功能基因及相应同工型的特异性表达。淀粉合成酶基因(如SSS Ⅰ、SSSⅢa、SSSⅣa等)呈上调表达,淀粉合成酶与分支酶基因(如SSS Ⅱa、SBE Ⅰ、SBEⅢ等)呈下调表达,异淀粉酶基因ISA1的相对表达量上升,普鲁兰酶基因PUL的相对表达量下降,花后高温对稻米淀粉精细结构的影响效应(例如,B3链比例上升、B1链比例下降,等)受上述功能基因与同工型的共同调控,而SSS Ⅰ、SSS ⅡaQ两同工型基因对支链淀粉链长合成的催化作用最为明显。此外,GBSS Ⅰ是在发育胚乳中相对表达量较高的颗粒结合型淀粉合成酶基因同工型,高温胁迫下,GBSS Ⅰ在低直链淀粉品种嘉935胚乳中的相对表达量下降,而高直链淀粉品种嘉353中则呈相反趋势,这与不同温度处理下两水稻品种胚乳中的直链淀粉含量变化趋势是一致的。4、水稻籽粒糊粉层临时淀粉的正常降解,对胚乳淀粉合成所需的碳源和能量保障具有重要意义。花后高温胁迫对临时淀粉降解代谢(包括磷酸化降解和非磷酸化降解两条途径)相关基因的影响主要表现为：“上游基因”(如GWD、AMY3和SEX4等)在高温胁迫下呈上调表达,导致代谢中间产物的快速累积；而“下游基因”(如ISA3、PUL和MEX1等)大多呈下调表达,抑制淀粉降解中间产物进一步分解。“上游基因”和“下游基因”的表达模式引起淀粉降解中间产物在糊粉层的过量累积,影响稻米糊粉层的营养转运功能,这可能是导致花后高温胁迫下胚乳淀粉合成所需的碳源和能量供应不足,并引起总淀粉积累量降低的重要原因。5、花后高温胁迫下,水稻籽粒中的蛋白和氨基酸组分含量在灌浆前期普遍上升；醇溶蛋白含量在灌浆后期下降,蛋白和氨基酸组分含量差异主要表现在灌浆后期。高温加速蛋白体的形成,改变谷蛋白和醇溶蛋白亚基的相对含量,其中,醇溶蛋白13kDa亚基相对含量略微降低,17-19kDa亚基相对含量上升,谷蛋白亚基和谷蛋白前体相对含量均上升。水稻胚乳蛋白积累不仅受蛋白亚基前体基因的调控,同时还受到蛋白质修饰相关基因的调控。与蛋白亚基前体基因相比,蛋白质修饰调控和逆境防御相关基因对高温胁迫更为敏感。其中,内质网细胞腔结合蛋白基因(BiP)在高温下的上调表达有利于醇溶蛋白的折叠与聚集,加速蛋白体1的形成：蛋白质二硫同分异构酶基因(PDI)、水稻碱性亮氨酸拉链蛋白基因／醇溶谷蛋白框结合蛋白基因(RISBZ1/RPBF)组合的上调表达与高温胁迫下的蛋白前体聚合过程和逆境防御代谢有关。
全文目录
致谢 11-12
缩略术语词表 12-13
摘要 13-15
Abstract 15-18
第一章 文献综述 18-46
1.1 稻米淀粉的组成与结构 18-20
1.1.1 稻米淀粉的化学组成 18-20
1.1.2 稻米淀粉的颗粒结构 20
1.2 稻米蛋白质的组成与结构 20-23
1.2.1 稻米蛋白质的组成 20-21
1.2.2 稻米蛋白质的存在状态 21-22
1.2.3 稻米蛋白质的亚基成分 22-23
1.3 稻米淀粉理化特征与品质间关系 23-25
1.3.1 淀粉组成与品质间关系 23-24
1.3.2 稻米淀粉的热力学特性 24
1.3.3 稻米淀粉的粘滞特性 24-25
1.3.4 稻米淀粉的晶体特性 25
1.4 稻米蛋白理化特征与品质间关系 25-26
1.4.1 稻米蛋白质的表面疏水性 25-26
1.4.2. 稻米蛋白质的热力学性质 26
1.5 花后高温对水稻籽粒淀粉代谢的影响 26-32
1.5.1 胚乳的发育和淀粉的积累 26-27
1.5.2 蔗糖转化 27
1.5.3 直链淀粉和支链淀粉的合成 27-29
1.5.4 淀粉的磷酸化降解与非磷酸化降解 29-30
1.5.5 花后高温对水稻胚乳淀粉代谢关键酶与相关基因表达的影响 30-32
1.6 花后高温对稻米水稻贮藏蛋白积累代谢的影响 32-34
1.6.1 稻米贮藏蛋白的合成 32
1.6.2 稻米中贮藏蛋白的加工 32-33
1.6.3 贮藏蛋白的运输和蛋白体形成 33
1.6.4 花后高温对稻米蛋白质代谢的影响 33-34
1.7 RNAi技术及其在稻米品质研究中的应用 34-35
1.7.1 RNAi技术 34
1.7.2 RNAi技术在稻米品质研究中的应用现状 34-35
1.8 存在问题和研究目的及意义 35-38
1.8.1 存在问题 35-37
1.8.2 本文研究目的与意义 37-38
参考文献 38-46
第二章 花后高温对稻米淀粉粒径分布与淀粉糊化特性影响 46-61
2.1 引言 46-47
2.2 材料与方法 47-50
2.2.1 试验材料与设计 47
2.2.2 淀粉粒粒径分布测定 47-48
2.2.3 稻米表观直链淀粉含量测定 48
2.2.4 稻米淀粉酶解抗性测定 48
2.2.5 淀粉颗粒的分级 48-49
2.2.6 稻米淀粉糊化特性和老化特性测定 49
2.2.7 溶解性和膨胀度的测定 49
2.2.8 直支链淀粉分离与碘蓝值的测定 49-50
2.3 结果与分析 50-56
2.3.1 不同灌浆温度下稻米淀粉的粒径分布变化 50-51
2.3.2 不同灌浆温度下稻米淀粉酶解抗性和碘蓝值变化 51-52
2.3.3 不同灌浆温度下稻米淀粉热力学特性的变化 52-54
2.3.4 不同灌浆温度下稻米淀粉理化特征参数间的相关性 54-55
2.3.5 不同大小淀粉粒理化特征差异 55-56
2.4 讨论 56-58
2.5 小结 58
参考文献 58-61
第三章 花后高温对水稻淀粉代谢相关基因表达模式及支链淀粉精细结构的影响 61-97
3.1 引言 61-62
3.2 材料与方法 62-67
3.2.1 试验材料 62
3.2.2 人工气候箱控温处理 62
3.2.3 cDNA微阵列检测分析 62-63
3.2.4 水稻籽粒RNA的提取、纯化 63
3.2.5 荧光定量RT-PCR和半定量RT-PCR引物设计 63-65
3.2.6 实时荧光定量RT-PCR 65-66
3.2.7 半定量RT-PCR 66-67
3.2.8 支链淀粉的分离及其结构的测定 67
3.3 结果与分析 67-83
3.3.1 花后高温对水稻籽粒灌浆与淀粉积累的影响 67-68
3.3.2 花后高温对水稻胚乳代谢相关基因的表达特征概貌 68-70
3.3.3 花后高温对水稻淀粉代谢相关基因的cDNA微阵列检测 70-77
3.3.4 花后高温对水稻糖代谢与糖信号相关基因同工型动态表达模式的影响 77-78
3.3.5 花后高温对水稻淀粉合成代谢相关基因同工型动态表达模式的影响 78-80
3.3.6 花后高温对水稻淀粉降解代谢相关基因同工型动态表达模式的影响 80-81
3.3.7 花后高温对水稻支链淀粉链长结构的影响 81-83
3.4 讨论 83-91
3.4.1 花后高温对水稻胚乳糖信号与糖代谢的调控及其与胚乳灌浆充实过程的联系 83-85
3.4.2 花后高温对水稻胚乳淀粉合成代谢的调控及其与淀粉积累、精细结构间的关系 85-88
3.4.3 花后高温对水稻籽粒淀粉降解代谢的调控及其在籽粒灌浆过程中的生理意义 88-91
3.5 小结 91-92
参考文献 92-97
第四章 花后高温对水稻贮藏蛋白质及氨基酸代谢的影响 97-124
4.1 引言 97-98
4.2 材料与方法 98-100
4.2.1 试验材料 98
4.2.2 人工气候箱控温处理 98
4.2.3 cDNA微阵列检测分析 98
4.2.4 水稻籽粒RNA的提取、纯化 98
4.2.5 蛋白质氨基酸代谢相关基因半定量RT-PCR的引物设计 98-99
4.2.6 半定量RT-PCR 99
4.2.7 可溶性蛋白质含量和蛋白组分测定 99
4.2.8 蛋白组分聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 99-100
4.2.9 透射电镜观察制样 100
4.2.10 氨基酸组分的测定 100
4.3 结果与分析 100-116
4.3.1 蛋白质氨基酸代谢相关基因的cDNA微阵列检测概貌 100-101
4.3.2 花后高温对水稻胚乳中蛋白质氨基酸代谢相关基因的影响 101-111
4.3.3 花后高温对水稻籽粒中蛋白质组分积累的影响 111-112
4.3.4 花后高温对水稻籽粒中蛋白质组分积累的影响 112
4.3.5 花后高温对水稻籽粒氨基酸组分积累的影响 112-115
4.3.6 花后高温对水稻籽粒蛋白体形成的影响 115-116
4.4 讨论 116-119
4.4.1 花后高温对水稻胚乳贮藏蛋白、氨基酸组分及蛋白体形成的影响 116-117
4.4.2 花后高温对水稻胚乳贮藏蛋白与氨基酸代谢相关基因影响 117-119
4.5 小结 119-120
参考文献 120-124
第五章 水稻蛋白质二硫键异构酶基因的RNAi载体构建 124-132
5.1 引言 124
5.2 材料与方法 124-127
5.2.1 试验材料 124
5.2.2 水稻胚乳总RNA提取纯化与cDNA合成 124-125
5.2.3 水稻胚乳蛋白质二硫键异构酶基因引物设计及克隆 125-126
5.2.4 蛋白质二硫键异构酶摹因RNAi载体构建 126
5.2.5 愈伤组织的培养与转化、农杆菌侵染与培养 126-127
5.3 结果与分析 127-130
5.3.1 PDI目的基因的克隆与序列分析 127-128
5.3.2 RNAi载体构建 128
5.3.3 水稻遗传转化过程和RNAi转基因植株的获得 128-130
5.4 小结 130
参考文献 130-132
第六章 结束语 132-134
附录 134
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