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一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法与流程

花匠小妙招
2024-12-26 08:15

本发明属于植物性毒物毒性评价技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；基于分子生物学的评估方法，通过研究枣花花蜜对意大利蜜蜂代谢路径的影响，评估枣花花蜜对蜜蜂毒性效应。

背景技术：

枣花病又称枣花中毒，常发生于枣花流蜜期，蜜蜂采集枣花蜜后造成大量采集蜂死亡，蜂群的群势下降。枣花病不仅影响枣花期蜂蜜和王浆的产量，还会影响蜜蜂对枣树的授粉。关于枣花病的病因，一般认为气候干旱、蜜汁浓稠、枣花花蜜中较高的钾离子浓度等有关。然而这些研究大多建立在推测及以成熟枣花蜜来研究蜜蜂枣花病的成因。但是蜜蜂采集的花蜜需经过一系列复杂过程才成为成熟蜂蜜，其中包括花蜜成分的改变。因此成熟枣花蜜对蜜蜂的作用并不能解释枣花花蜜对蜜蜂的毒性效应。鉴于此，探索和建立一种快速、敏感性高的分析技术尤为重要，这有助于阐明蜜蜂枣花病的发生原因，为蜜蜂枣花病的防治提供理论依据。

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法，主要研究在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质。由于细胞内的生命活动大多发生于代谢层面，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。作为一门新兴的学科，代谢组学是一类全面、高通量、无偏差地研究生物体内代谢途径的分析技术，可以提供有关毒理、药物毒理、药效临床诊断以及基因功能的信息。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有研究不能阐释枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用的现状，提供一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；基于代谢组学的差异物代谢通路，以挖掘引起蜜蜂枣花病发生的机理，为蜜蜂枣花病的防治提供依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用uplc-q-tofms技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用xcms软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，使用simca软件对质谱数据进行多维统计分析；从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的血淋巴异常代谢物靶标和代谢轮廓，获得代谢指纹图谱；在枣花病组中显著上调的，vip值>5的代谢产物17种，下调的代谢产物18种；以血淋巴代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂毒性的作用机制；显著差异的代谢产物主要富集到5个代谢通路，这5个相关代谢通路参与了蜜蜂对枣花花蜜的代谢过程。

具体步骤如下：

（1）采样提取代谢物：采集患枣花病的蜜蜂，并以同期健康蜜蜂作为对照，带回实验室后采集血淋巴并提取代谢物；

（2）分离代谢物：对提取的代谢物采用agilent1290infinitylc超高效液相色谱系统uhplc，hilic色谱柱进行分离；

（3）分析样品：样品经uhplc分离后用triple-tof5600质谱仪absciex进行质谱分析；

（4）分析质谱数据：用xcms软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，并使用simca软件对质谱数据进行多维统计分析。

步骤（1）中采样的具体方法为：在枣花流蜜期收集已取食枣花花蜜并在蜂巢前爬行的出现枣花病症状的蜜蜂，并同时采集未取食枣花花蜜的健康蜜蜂作为对照，用纱笼迅速带回实验室；取蜜蜂血淋巴，每组取六个样；

代谢物的提取方法为：每个样本取30ul血淋巴，加入1ml预冷v/v/v为甲醇/乙腈/水=2:2:1，混匀，冰浴中超声60min，-20℃孵育1h后沉淀蛋白，16000g、4℃离心20min后，取上清液真空干燥；质谱检测时加入100μl的v/v为1:1的乙腈-水溶液复溶，14000g、4℃离心15min，取上清进样分析。

步骤（2）中具体方法为：对收集的各样本进行方法学考察，建立超高液相色谱-串联质谱技术检测蜜蜂血淋巴代谢物的指纹图谱；

其中：超高效液相色谱分析条件为：整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，样品采用agilent1290infinitylc超高效液相色谱系统，uhplc，hilic色谱柱进行分离；进样量为5μl，柱温25℃，流速0.3ml/min；色谱流动相a：水+25mm乙酸铵+25mm氨水，b：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95%b；0.5-7min，b从95%线性变化至65%；7-9min，b从65%线性变化至40%；9-10min，b维持在40%；10-11.1min，b从40%线性变化至95%；11.1-16min，b维持在95%；样本队列中插入qc样品，监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；

质谱条件为：每例样品分别采用电喷雾电离进行正离子和负离子模式检测；样品经uplc分离后用triple-tof5600质谱仪进行质谱分析；esi源条件如下：ionsourcegas1：60，ionsourcegas2：60，curtaingas：30，sourcetemperature：600℃，ionsaparyvoltagefloating正负两种模式±5500v；tofmsscanm/zrange：60-1200da，productionscanm/zrange：25-1200da，tofmsscanaccumulationtime0.15s/spectra,productionscanaccumulationtime0.03s/spectra；二级质谱采用informationdependentacquisition获得，并且采用highsensitivity模式，declusteringpotential正负两种模式：±60v，collisionenergy：30ev，ida设置如下excludeisotopeswithin4da，candidateionstomonitorpercycle：6。

步骤（4）中分析质谱数据的具体方法为：原始数据经proteowizard转换成.mzxml格式，然后采用xcms程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积；代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式，检索自建数据库；

对xcms提取得到的数据，删除组内缺失值>50%的离子峰，整合正负离子峰并应用软件simca-p14.1（umetrics，umea，sweden）进行模式识别，数据经pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析pca分析，有监督偏最小二乘法判别分析pls-da和正交偏最小二乘法判别分析opls-da；根据opls-da模型得到的变量权重值来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异代谢物，并对差异代谢物进行代谢通路富集分析，找到受枣花蜜显著影响的代谢通路。

枣花病病蜂血淋巴中具有生物学意义的差异代谢物为：上调的代谢产物有117个，下调的代谢产物为82个；其中vip>5的在枣花病组中显著上调的17种代谢标志物：葡萄糖、d-6-磷酸葡萄糖、半乳糖醇、溶血磷脂胆碱（18:1、16:0）、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰胆碱、异亮氨酸、l-谷氨酰胺、n-果糖基异亮氨酸、亚油酸、3-磷酸甘油、3-羟基-3-甲基谷氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、次黄（嘌呤核）苷、3′-磷酸腺苷；枣花病组中显著下调的代谢标志物主要有18种：蔗糖、海藻糖、麦拉齐糖、酮亮氨酸、异麦芽酮糖、奎宁酸、10-羟基癸酸、尼古丁、果糖、泛醇、麦芽糖、磷酰胆碱、葡萄糖酸酯、犬尿喹啉酸、肉豆蔻酸、咪唑丙烯酸、3-氧代戊酸甲酯、l苹果酸；

根据代谢通路的p值和通路的重要值，寻找到受枣花蜜显著影响的代谢通路：abc转运蛋白，氨基酸生物合成，淀粉及果糖代谢，磷酸转移酶系统，蛋白质消化及吸收这五个代谢通路为蜜蜂食用枣花花蜜后的重要代谢通路，参与了蜜蜂代谢枣花花蜜的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整阐释了枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用机制。

本发明基于代谢组学技术构建的枣花花蜜对蜜蜂毒性效应的评估方法，该方法研究了枣花病病蜂体内代谢产物的变化及影响的代谢通路，较为直观的揭示了枣花蜜对蜜蜂的毒性效应。

本发明利用uplc-q-tofms技术结合多元统计分析对枣花病蜜蜂血淋巴代谢产物进行分析，发现枣花花蜜对蜜蜂致病性的相关代谢产物。统计学手段结合代谢通路富集对高通量代谢产物进行分析，得到枣花病蜜蜂体内代谢产物的变化以及显著受影响的代谢路径，深入的反应了枣花花蜜所引起的蜜蜂的毒性效应。

本发明以代谢组学作为技术手段研究枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用机制，在枣花花蜜毒性评估过程中表现出快速、灵敏、高选择性的特点。

附图说明

图1为qc样品正、负离子模式tic重叠图谱；

图2为样本的pca得分图（图中t[1]代表主成分1、t[2]代表主成分2）；

图3为比较组jvsck的pls-da得分图；

图4为比较组jvsck的opls-da得分图；

图5为比较组jvsck的opls-da置换检验图；

图6为比较jvsck的火山图，图中黑色点为上调代谢物，灰色点为下调的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物；

图7为经过代谢通路富集分析所得到的枣花病组蜜蜂受到显著干扰的代谢通路。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的具体实现过程如下：

一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用uplc-q-tofms技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用xcms软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，使用simca软件对质谱数据进行多维统计分析；从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的血淋巴异常代谢物靶标和代谢轮廓，获得代谢指纹图谱；利用多元变量统计分析筛选出199个代谢产物，在枣花病组中显著上调的，vip值>5的代谢产物17种，下调的代谢产物18种；以血淋巴代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂毒性的作用机制；显著差异的代谢产物主要富集到5个代谢通路，这5个相关代谢通路参与了蜜蜂对枣花花蜜的代谢过程。

获得枣花花蜜致病蜜蜂血淋巴中的分子标志物及代谢通路的具体实现步骤如下：

a、枣花病病蜂及健康蜂的采集：在枣花流蜜期收集已取食枣花花蜜并在蜂巢前爬行的出现枣花病症状的意大利蜜蜂，并同时采集未取食枣花花蜜的健康意大利蜜蜂作为对照，用纱笼把样本迅速待会实验室。

b、蜜蜂血淋巴的采集：将蜜蜂固定于蜡盘后，用眼科剪剪开蜜蜂颈部，用塑料毛细管收集血淋巴，由于蜜蜂血淋巴很少很难收集，一般取50个蜜蜂的血淋巴混合成池，算为一个样本，每组取六个样。

c、样本的预处理：每个样本取30ul血淋巴，并在其中加入1ml预冷甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v），混匀，冰浴中超声60min，-20℃孵育1h后沉淀蛋白，16000g4℃离心20min后，取上清然后进行真空干燥。质谱检测时加入100μl乙腈-水溶液（1:1,v/v）复溶，14000g4℃离心15min，取上清进样分析。

d、样品质谱分析：对收集的各样本进行方法学考察，建立超高液相色谱-串联质谱技术检测蜜蜂血淋巴代谢物的指纹图谱方法。

e、超高效液相色谱分析条件：整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，样品采用agilent1290infinitylc超高效液相色谱系统（uhplc，hilic色谱柱）进行分离。其中进样量为5μl，柱温25℃，流速0.3ml/min；色谱流动相a：水+25mm乙酸铵+25mm氨水，b：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95%b；0.5-7min，b从95%线性变化至65%；7-9min，b从65%线性变化至40%；9-10min，b维持在40%；10-11.1min，b从40%线性变化至95%；11.1-16min，b维持在95%。样本队列中插入qc样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

质谱条件：每例样品分别采用电喷雾电离（esi）进行正离子和负离子模式检测。样品经uplc分离后用triple-tof5600质谱仪（absciex）进行质谱分析。其esi源条件如下：ionsourcegas1（gas1）：60，ionsourcegas2（gas2）：60，curtaingas（cur）：30，sourcetemperature：600℃，ionsaparyvoltagefloating（isvf）±5500v（正负两种模式）；tofmsscanm/zrange：60-1200da，productionscanm/zrange：25-1200da，tofmsscanaccumulationtime0.15s/spectra,productionscanaccumulationtime0.03s/spectra；二级质谱采用informationdependentacquisition（ida）获得，并且采用highsensitivity模式，declusteringpotential（dp）：±60v（正负两种模式），collisionenergy：30ev，ida设置如下excludeisotopeswithin4da，candidateionstomonitorpercycle：6。

f、实验质量评价：通过采用qc样本的质谱tic图比对和总体样本pca统计分析的两种策略，对本次项目实验的系统稳定性进行评价与分析。

qc样本质谱tic图比对：将qc样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图（tic）分别进行谱图叠加比较，如图1所示；结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明整个实验过程中仪器误差引起的变异较小，数据质量可靠。

总体样本主成分分析（pca）：采用xcms软件对代谢物离子峰进行提取，离子峰数目见表1。将所有实验样本和qc样本提取得到的峰，经pareto-scaling处理后进行pca分析，经7-foldcross-validation（7次循环交互验证）得到的pca模型见图2。如图2所示，qc样本较为紧密地聚集在一起，表明本项目实验的重复性良好。

表1保留离子峰数目

数据预处理：原始数据经proteowizard转换成.mzxml格式，然后采用xcms程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（<25ppm）和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库。

对xcms提取得到的数据，删除组内缺失值>50%的离子峰，整合正负离子峰并应用软件simca-p14.1（umetrics，umea，sweden）进行模式识别后，数据经pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析（pca）分析，有监督偏最小二乘法判别分析（pls-da）和正交偏最小二乘法判别分析（opls-da）。

主成分分析（principalcomponentanalysis,pca）是一种非监督的数据分析方法，它将原本鉴定到的所有代谢物重新线性组合，形成一组新的综合变量，同时根据所分析的问题从中选取几个综合变量，使它们尽可能多地反映原有变量的信息，从而达到降维的目的。同时，对代谢物进行主成分分析，还能从总体上反映样本组间和组内的变异度。采用pca的方法，观察所有样本之间的总体分布趋势，找出可能存在的离散点。对枣花病组（j）vs对照组（ck）样品进行pca分析，pca得分图见图3。样本采集到的lc-ms质谱数据，在pc1和pc2维图上，此样本间呈现明显的分离趋势。经7-foldcross-validation（7次循环交互验证）得到的pca模型参数见表2；a：表示主成分数；r2x：表示模型解释率；q2：表示模型预测能力。

表2.pca模型参数

正交偏最小二乘判别分析（opls-da）：正交偏最小二乘判别分析（opls-da）是另一种有监督的判别分析统计方法。该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。该方法在偏最小二乘判别分析（pls-da）的基础上进行修正，滤除与分类信息无关的噪音，提高了模型的解析能力和有效性。在opls-da得分图上，有两种主成分，即预测主成分和正交主成分。预测主成分只有1个，即t1；正交主成分可以有多个。opls-da将组间差异最大化的反映在t1上，所以从t1上能直接区分组间变异，而在正交主成分上则反映了组内的变异。

建立各比较组的opls-da模型，经7-foldcross-validation（七次循环交互验证）得到的模型评价参数r2y与q2，如果r2和q2越接近1，表明模型越稳定可靠；反之，如果r2和q2小于0.5，则模型可靠性较差。本实验比较组jvsck的opls-da评价参数（r2y，q2）列于表3，模型得分图见图4，可见opls-da模型能明显区分两组样本。本实验数据建立的pls-da模型，r2、q2≥0.5，模型稳定可靠。图5显示了基于该组opls-da模型的置换检验图，置换检验横坐标代表随机分组的y与原始分组y的相关性，纵坐标代表r2和q2的得分，其中q2截距小于0.05代表模型可靠，表明本实验数据建立的opls-da模型未发生过拟合。

表3.opls-da模型的评价参数

显著性差异代谢物：我们通过计算变量投影重要度（variableimportancefortheprojection,vip）来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助标志代谢物的筛选（通常以vipscore>1.0作为筛选标准）。本实验以vip>1为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物。进一步采用单变量统计分析，验证代谢物是否具有显著性差异。选择同时具有多维统计分析vip>1和单变量统计分析pvalue<0.05的代谢物，作为具有显著性差异的代谢物，我们发现在枣花病病蜂血淋巴中上调的代谢产物有117个，下调的代谢产物为82个（图6）；其中vip>5的在枣花病组中显著上调的17种代谢标志物，包括：葡萄糖、d-6-磷酸葡萄糖、半乳糖醇、溶血磷脂胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰胆碱、异亮氨酸、谷氨酰胺、n-果糖基异亮氨酸、亚油酸、3-磷酸甘油、3-羟基-3-甲基谷氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱等；枣花病组中显著下调的代谢标志物主要有18种，包括：蔗糖、海藻糖、麦拉齐糖、酮亮氨酸、异麦芽酮糖、10-羟基癸酸、尼古丁、果糖、泛醇、麦芽糖、磷酰胆碱、葡萄糖酸酯、犬尿喹啉酸、肉豆蔻酸等。具体含量变化如表4所示。

表4：枣花病病蜂血淋巴中潜在分子标志物的鉴定及在对照组、枣花病组中的含量变化

层次聚类分析：为了评价候选代谢物的合理性，同时更全面直观地显示样本之间的关系以及代谢物在不同样本中的表达模式差异，我们利用定性的显著性差异代谢物的表达量对各组样本进行层次聚类（hierarchicalclustering），从而辅助我们准确地筛选标志代谢物，并对相关代谢过程的改变进行研究。

潜在生物标记物的分析：将各比较组得到的显著性差异代谢物进行keggidmapping，并提交到kegg网站进行相关通路分析及kegg代谢通路富集分析（图7）。根据代谢通路的p值和通路的重要值，abc转运蛋白，氨基酸生物合成，淀粉及果糖代谢，磷酸转移酶系统，蛋白质消化及吸收这五个代谢通路为蜜蜂食用枣花花蜜后的重要代谢通路，参与了蜜蜂代谢枣花花蜜的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用机制。

本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。