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一株羊肚菌菌株及其培养方法.pdf

花匠小妙招
2024-12-26 08:29

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1、(10)申请公布号 CN 103710271 A (43)申请公布日 2014.04.09 CN 103710271 A (21)申请号 201310730625.9 (22)申请日 2013.12.26 CGMCC No.7058 2013.01.11 C12N 1/14(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所地址 650223 云南省昆明市政教路 14 号申请人云南省供销合作社科学研究所云南云菌科技（集团）有限公司 (72)发明人桂明英刘蓓郭相马明邰丽梅吴素蕊 (74)专利代理机构昆明合众智。

2、信知识产权事务所 53113 代理人康珉 (54) 发明名称一株羊肚菌菌株及其培养方法 (57) 摘要本发明公开一株羊肚菌菌株及其培养方法。该羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株CGMCC No.7058 的培养方法是将其菌丝体接种到盛有改良 PDA 培养基的试管培养基斜面上，于 18-24 下培养 5-7d，获得试管菌种，接种到盛有液体培养基的三角瓶中，于 20-26下摇床培养，转速为 120-160r/min，培养时间 5-7d，获得一级液体菌种，再接种到发酵罐中，通气培养 72-96h，即获得所述菌株的液体菌种。该菌株的菌。

3、丝体生物量高可达 25g/kg、菌核生成能力强、抗污染、培养污染率低 2%、液体发酵时间短 72-96h，为羊肚菌野生资源保护促繁提供了优良菌种。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表1页 (10)申请公布号 CN 103710271 A CN 103710271 A 1/1 页 2 1. 一株羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058。 2. 羊肚菌（Mochella e。

4、sculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 液体菌种的培养方法，其步骤如下：（1）将羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC NO.7058 的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于 18-24下培养 5-7d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基为改良 PDA 培养基，其配方为马铃薯 30%，葡萄糖 2%， K2HPO4 0.5%，琼脂 2%，余量为水，所述的百分数是质量分数；（2）将试管菌种接种到盛有 200mL 液体培养基的 500mL 三角瓶中，于 20-26下摇床培养，转速为 120-160。

5、r/min，培养时间 5-7d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为： 5-10%麸皮、 0.5-1%黄豆粉、 0.5-1%麦芽糖、 1-2%可溶性淀粉，余量为水，所述的百分数是质量分数；（3）将获得的一级液体菌种接种到 25L 自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为 1 ： 0.8，搅拌转速为 120-160r/min，接种量为 5-10% 质量分数，罐压： 0.04Mpa ； pH 为 7.2-7.5 ；温度为 22-26 ；通气培养 72-96h，即获得羊肚菌（Mochella esculenta） M-02# 菌株 CGMCC No.7058 液。

6、体菌种。权利要求书 CN 103710271 A 2 1/7 页 3 一株羊肚菌菌株及其培养方法技术领域 0001 本发明属微生物技术领域，具体涉及一种新的羊肚菌菌株及其培养方法。背景技术 0002 羊肚菌属 (Morchella) 真菌，是世界著名的名贵野生食用菌，羊肚菌 (M.esuclenta(L.)Pers.) 是云南产羊肚菌属真菌的主要种类之一，分布较为广泛，在金沙江流域大量发生。目前羊肚菌属真菌的人工栽培由于产量不稳定，尚不能形成商业化和规模化，市场上的羊肚菌大多来自野生。近年来受气候条件恶化和过度采集等不良因素的。

7、影响，野生羊肚菌自然产量大幅下降。研究表明，在羊肚菌原生境，采用人工菌种和配套的技术措施，能够有效地提高单位面积内羊肚菌的产量。 0003 在羊肚菌原生境促繁技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。目前国内大多采用固体制种技术，而很少使用液体发酵。对于固体制种技术而言，液体发酵技术具有具有菌丝生长良好、菌球均匀、较少污染、培养基利用充分的优点。本专利采用液体发酵技术制作优良的液体菌种，对后期仿生学促繁和人工栽培提供保障。发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是克服现有技术羊肚菌的菌丝体生物量较低、菌核生成能力较弱、菌丝生长不均匀、污染率高、培养基。

8、利用不充分等不足。其目的是提供一种具有产量高、菌核生成能力强、抗污染的新的优良羊肚菌菌株及其培养方法，为羊肚菌野生资源保护促繁提供优良菌种。 0005 为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明的技术方案如下： 0006 1. 一株羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058。 0007 2. 羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 液体菌种的培养方法，其步骤如下： 0008 （1）将羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.70。

9、58 的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于 18-24下培养 5-7d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基为改良 PDA 培养基，其配方为马铃薯 30%，葡萄糖 2%， K2HPO40.5%，琼脂 2%，余量为水，所述的百分数是质量分数； 0009 （2）将试管菌种接种到盛有 200mL 液体培养基的 500mL 三角瓶中，于 20-26下摇床培养，转速为 120-160r/min，培养时间 5-7d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为： 5-10% 麸皮、 0.5-1% 黄豆粉、 0.5-1% 麦芽糖、 1-2% 可溶性淀粉，余量为水，所。

10、述的百分数是质量分数； 0010 （3）将获得的一级液体菌种接种到 25L 自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为 1 ： 0.8，搅拌转速为 120-160r/min，接种量为 5-10% 质量分数，罐压： 0.04Mpa ； pH 为 7.2-7.5 ；温度为 22-26；通气培养 72-96h，即获得羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 液体菌种。说明书 CN 103710271 A 3 2/7 页 4 0011 与现有技术相比，本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达 25g/kg，而固体菌。

11、包菌丝体生物量大约在 5-12g/kg ；二是菌核生成能力强，在直径 10cm 的平板上金黄色菌核颗粒多或覆盖面积大，菌核颗粒可达 50 粒，单颗粒直径可达 1cm ；三是抗污染、培养污染率低， 2%。同时采用液体发酵法时间短，大约 72-96h，而普通的固体包培养需要 15d 以上。 0012 本发明利用云南原产地羊肚菌子实体筛选出优良菌株，为羊肚菌野生资源保护促繁提供了优良菌种。 0013 本发明所提供的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.705 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址。

12、：北京市朝阳区北辰西路1号院 3 号；保藏日期： 2013 年 01 月 11 日；保藏号： CGMCC No.7058。 0014 序列表中 SEQ ID NO ： 1 所示的是实施例 1 中 ITS 序列分析时对菌株进行 ITS 序列扩增所用的 ITS4 引物的碱基序列。 0015 序列表中 SEQ ID NO ： 2 所示的是实施例 1 中 ITS 序列分析时对菌株进行 ITS 序列扩增所用的 ITS5 引物的碱基序列。具体实施方式 0016 下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0017 下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。。

13、0018 以下实施例野生羊肚菌在云南省昭通市巧家县蒙菇乡新塘村甘蔗地内采集（也是原始来源地）、其遗传资源取自微生物；采集方法为徒手采集（自行采集），采集时候注意保持子实体完整、无霉变、无病虫害，采集时间： 2012 年 11 月（也是原始采集时间）。 0019 实施例 1 0020 本发明所提供的一株羊肚菌（Mochellaesculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的获得、鉴定和培养方法。 0021 1.1 羊肚菌（Mochellaesculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的获得 0022 将采集的野生羊肚。

14、菌子实体内壁组织块接种到菌种分离纯化培养基斜面上，于 18下培养 10d，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，参见实施例 4 所述的方法通过菌丝体产量、菌核生成能力、抗污染力等性状比对，挑选出菌丝体产量高、菌核生成能力强、抗污染、长势良好的菌株即为获得的羊肚菌分离试管种；所述的菌种分离纯化培养基的配方为：马铃薯30%，葡萄糖2%， K2HPO40.5%，琼脂2%，余量为水，所述的百分数是质量分数； 0023 将羊肚菌分离试管种菌丝块接种到琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，培养条件为 18-24避光， 2d 后取尖端菌丝块接种在培养。

15、基斜面上，于 18下培养 7d，获得羊肚菌纯化试管种即为本发明所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 ；所述的平板培养皿中的培养基和所述的培养基斜面中的培养基配方法均为：马铃薯 30%，葡萄糖 2%， K2HPO40.5%，琼脂 2%，余量为水，所述的百分数是质量分数。 0024 1.2 鉴定及其特征、命名、保藏 0025 子实体特征 0026 羊肚菌（Mochellaesculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 分离用子实体特征为：说明书 CN 103710271 A 4 3/。

16、7 页 5 高 6 14.5cm。菌盖长 4 6cm，宽 4 6cm，不规则圆形、椭圆形，表面有许多凹坑，似羊肚状，淡黄褐色或浅黄色。菌柄长 5 7cm，粗 2 2.5cm，白色，有浅纵沟，基部稍膨大。子囊 (200 300)m(18 22)m ；子囊孢子 8 个，单行排列，宽椭圆形， (20 24) m(1215)m。侧丝顶部膨大，有时有隔。形态鉴定参考中国大型真菌 (卯晓岚.郑州：河南科学技术出版社， 2000.) 和中国大型真菌原色图鉴 ( 黄年来 . 北京：中国农业出版社， 1998.)。 0027 羊肚菌（Mochellaescu。

17、lenta） M-02#菌株纯化试管种特征 0028 接种后，在培养温度为 22的条件下， 8h 就开始萌发，生长初期菌丝紧贴培养基，无色，有光泽，一般为较粗的不分支或分支较少的菌丝；第一天长速最快为 1.3cm，最慢为 0.8cm，而后随菌落的增大，有叉状或树枝状分支，一般较细，前两天无菌核与色素产生，第三天生长最快，平均长速为 1.65cm/d，并开始有色素产生，第四天到第五天长满整个培养皿，第六天开始有菌核形成，随着色素的产生，菌丝开始老化、衰弱，颜色开始变深。 0029 菌核在第五天开始形成，分布在接种圈的周围，较少，直径平均为 0.。

18、5 1.0mm，色浅。有些种为条状，坚硬，有些光滑，有些粗糙。挑取，置于载玻片上，敲击压碎，镜下观察，可见菌核是由多条菌丝扭曲缠绕在一起而形成的；到第八天整个菌落上菌核均匀分布，直径0.83.2mm之间，色深。挑取，于载玻片上压碎着色，镜下观察，已分不清菌丝间的交织，可见到外壁加厚，为一层壳状物质，中间为可被深染的有浓厚的营养物质的纺锤形细胞。避光条件下易形成菌核，且密度大。 0030 ITS 序列分析 0031 采用供试野生羊肚菌子实体与实施例 1 获得的对应的羊肚菌纯化试管种菌丝，分别按 CTAB 法提取总 DNA，进行 PCR 扩增及。

19、 ITS 序列测定，通过 Blast 对比样品的 ITS 序列与 NCBI 中的羊肚菌 (M.esculenta)Identities=1114/1138(97.89%)， Gaps=24/1138(2.10%)，分析确定实施例 1 分离得到的羊肚菌纯化试管种即新的羊肚菌菌株为羊肚菌菌丝体。其具体方法如下： 0032 改良 CTAB 法流程 0033 称取 0.12g 左右的干燥样品，加入液氮并迅速研磨至粉状后，迅速加入 -CTAB500l、 - 巯基乙醇 20l，再加 +CTAB（65预热） 700l，混匀后置 65水浴振荡抽提 60min ； 0034 冷却， 1200。

20、0r离心10min，取上清液，加入700l等体积的苯酚/氯仿（1:1），混匀后 12000r 离心 10min ； 0035 取上清，加入 700l 氯仿 / 异戊醇，混匀， 12000r 离心 10min ； 0036 取上清，先加入 80l10%CTAB+4%NaCl 溶液（65预热），再加入 700l 氯仿 / 异戊醇，混匀， 12000r 离心 10min ； 0037 取上清，加入 600l 异丙醇， -18下放置过夜； 0038 取出， 12000r离心10min，弃上清液，沉淀依次用600l76%乙醇、 0.2mol/L乙酸钠及 300l70%。

21、乙醇进行洗涤； 0039 8000r 离心 5min，用滤纸滤干离心管， 45下真空干燥 5min，加入 100l TE 缓冲液溶解， 4冰箱保存。 0040 DNA 纯度及浓度检测说明书 CN 103710271 A 5 4/7 页 6 0041 取 2l DNA 样品，用 TE 缓冲液定容至 50l，用紫外分光光度计测定波长在 230nm、 260nm、 280nm处的OD值，根据260nm处的OD值计算DNA浓度，根据260/280、 260/230 值确定 DNA 的纯度。 0042 DNA 分子量检测 0043 取 DNA 样品 5l，上样缓冲液（含 0.。

22、25% 溴酚蓝， 40% 蔗糖） 2l，混匀，点入含 0.75l 核酸染料的 0.8% 琼脂糖凝胶中，同时点入 -Lambda mix marker 作为标记，用 1TAE 缓冲液，在 80V 电压下电泳 80min，最后在凝胶成像仪下观察并照相。 0044 ITS-PCR 扩增 0045 ITS 序列扩增引物 0046 采用White设计的ITS通用引物ITS4/ITS5对供试材料的rDNA ITS序列进行PCR 扩增。其 ITS 引物如下： 0047 ITS4:5 TCCTCCGCTTATTGATATGC3 （即序列表中 SEQ ID NO ： 1 所示的碱基序列） 004。

23、8 ITS5:5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3 （即序列表中 SEQ ID NO ： 2 所示的碱基序列） 0049 ITS-PCR 扩增体系 0050 ITS-PCR 扩增体系为 50L，含 rTaq(5U/L)0.5L， 10PCR Buffer6.25L， Mgcl2(25mmol/L)5.0L， dNTP 混合物 ( 各 2.5mmol/L)0.75L， ITS4/ITS5 引物 (10mol/ L) 各 2.5L，模板 DNA(50ng/L)2.5L， ddH2O 补足至总体积 50L。 0051 PCR 扩增在 GE9700PCR 仪上进行。反应程序为：。

24、94预变性 5min ； 94变性 40s ； 52退火 45s ； 72延伸 1min ；共 40 个循环；最后于 72补平 10min，终止温度为 4。采用 1.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测 ITS-PCR 扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录电泳谱带。 0052 ITS 扩增产物的序列测定 0053 PCR 扩增产物经电泳检测后，用胶回收试剂盒进行回收和纯化，样品送测序公司测序。 0054 ITS 序列分析 0055 将扩增得到的各试验样品的 ITS 序列，采用 ContigExpress 软件进行正反链序列拼接，将拼接好的序列保存为 FASTA 格式，然后在 NCB。

25、I 网站上进行序列同源性比较。将拼接好的 ITS 序列采用 ClustalX1.83 软件和 BioEdit 软件进行序列比对。比对结果采用 Mega3.0 软件进行序列组成分析，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建系统树，并用 Bootstrap1000 次检验分子系统树各分支的置信度。 0056 保藏 0057 保藏：本发明所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株CGMCC No.7058的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号；保藏日期： 2013 年 01 。

26、月 11 日；保藏登记入册的编号（保藏号）： CGMCC No.7058。 0058 1.3 培养方法 0059 将羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于 18下培养 6d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基的配方为改良 PDA 培养基：马铃薯 30%，葡萄糖 2%， K2HPO40.5%，琼脂 2%，余量为水，所述的百分数是质说明书 CN 103710271 A 6 5/7 页 7 量分数。 0060 将试管菌种接种到盛有 200mL 液体培养基的 500mL 三。

27、角瓶中，于 20下摇床培养，转速为 120r/min，培养时间 7d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为： 6% 麸皮、 0.5% 黄豆粉、 0.5% 麦芽糖、 1% 可溶性淀粉，余量为水，所述的百分数是质量分数。 0061 将获得的一级液体菌种接种到 25L 自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为 1 ： 0.8，搅拌转速为 120r/min，接种量为 5% 质量分数，罐压： 0.04Mpa， pH 为 7.2，温度为 22，通气培养 72h，即获得所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 液体菌。

28、种。 0062 实施例 2 0063 实施例 2 是对羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC NO.7058 的培养方法，其培养方法除以下措施不同外，其余措施与实施例 1 中 1.3 培养方法相同，其羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株CGMCC No.7058的获得、鉴定、保藏方法与实施例1等同。 0064 2.1 培养方法 0065 将羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于 20下培养 7d，获得试管菌种。 006。

29、6 将试管菌种接种到盛有 200mL 液体培养基的 500mL 三角瓶中，于 20下摇床培养，转速为 130r/min，培养时间 9d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为： 7% 麸皮、 0.5% 黄豆粉、 0.5% 麦芽糖、 1% 可溶性淀粉，余量为水，所述的百分数是质量分数。 0067 将获得一级液体菌种接种到 25L 自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为 1 ： 0.8，搅拌转速为 140r/min，接种量为 7%（质量分数），罐压： 0.04Mpa， pH 为 7.4，温度为 24，通气培养 84h，即获得所述的羊肚菌（Mochella es。

30、culenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 液体菌种。 0068 实施例 3 0069 实施例 3 是对羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的培养方法，其培养方法除以下措施不同外，其余措施与实施例 1 中 1.3 培养方法相同，其羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株CGMCC NO.7058的获得、鉴定、保藏方法与实施例1等同。 0070 3.1 培养方法 0071 将羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 的菌丝体接种到试。

31、管琼脂培养基斜面上，于 24下培养 5d，获得试管菌种。 0072 将试管菌种接种到盛有 200mL 液体培养基的 500mL 三角瓶中，于 22下摇床培养，转速为 160r/min，培养时间 7d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为： 10% 麸皮、 1% 黄豆粉、 1% 麦芽糖、 2% 可溶性淀粉，余量为水，所述的百分数是质量分数。 0073 将获得一级液体菌种接种到 25L 自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为 1 ： 0.8，搅拌转速为 160r/min，接种量为 10%（质量分数），罐压： 0.04Mpa， pH 为 7.5，温度为 26，。

32、通气培养 96h，即获得所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC NO.7058 液体菌种。 0074 实施例 4 性状对比试验 0075 使用本发明羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 与原有 3 个菌株 M-16#、 M0710#、 M-501#，（3 个菌株 M-16#、 M0710#、 M-501#可通过微生物保藏机构购买）说明书 CN 103710271 A 7 6/7 页 8 所有供试菌株品种均为羊肚菌 (M.esculenta)。 0076 4.1 菌丝体生长情况及污染。

33、情况对比 0077 试验方法 0078 将 4 个羊肚菌菌株接种于 18mm18mm 平板上，每个菌株重复 10 次，平板培养基为改良PDA ：马铃薯30%，葡萄糖2%， K2HPO40.5%，琼脂2%，余量为水，所述的百分数是质量分数，接种后放在 20的培养箱中避光培养。 0079 每 8h 进行观察记录。 0080 结果分析（详见表 1） 0081 表 1 羊肚菌各菌株在改良 PDA 培养基上的生长情况 0082 0083 注： + 表示菌丝长势较差； + 表示菌丝长势一般； + 表示菌丝长势较浓； + 表示菌丝长势浓密； + 表示菌丝长势很浓密。 0084。

34、从表 1 可以看出，在相同的培养条件下，各个菌株的生长情况有所差异。从长势和满板时间来看，本发明所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 生长速度快，长势良好，且菌丝铺满平板的时间较其他三个菌株缩短了 2-3d ；从污染情况的来看， M-02#菌株没有污染，抗污染率明显优于其他三个菌株。 0085 4.2 菌核生成能力比较 0086 试验方法 0087 将 4 个羊肚菌菌株接种于 18mm18mm 平板上，每个菌株 10 个重复，平板培养基为改良 PDA ：马铃薯 30%，葡萄糖 2%， K2HPO40.。

35、5%，琼脂 2%，余量为水，培养温度 20-25，所述的百分数是质量分数。接种后首先在 20的培养箱中避光培养 3d ；然后转入光照培养箱中，使用 250lx 连续光照促使菌丝体转色生成菌核。 0088 每 8h 进行观察记录。 0089 结果分析（详见表 2） 0090 表 2 羊肚菌菌核形成情况说明书 CN 103710271 A 8 7/7 页 9 0091 0092 注： + 的多少表示菌核的变化。 0093 从表 2 可以看出， M-02#菌株菌核生成能力最强， M0710#、 M-501#其次， M-16#最差。 M-02#转色快，从第5天开始就可以看见黄。

36、色颗粒状的菌核出现，随着培养时间的增加，菌核有开始的浅黄、黄逐步转变为褐黄、褐色。 0094 本发明从羊肚菌 (M.esculenta) 发生的昭通地区金沙江流域采集其野生子实体分离菌株羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株CGMCC No.7058具有明显的地域性特征，与现有技术相比，有以下优点：一是菌丝体生物量高，可达 25g/kg，而固体菌包菌丝体生物量大约在 5-12g/kg ；二是菌核生成能力强，在直径 10cm 的平板上金黄色菌核颗粒多或覆盖面积大，菌核颗粒可达 50 粒，单颗粒直径可达 1cm ；三是抗污染、培养污。

37、染率低， 2%。同时采用液体发酵法时间短，在 72-96h，而普通的固体包培养需要 15d 以上。因此，本发明所述的羊肚菌（Mochella esculenta） M-02#菌株 CGMCC No.7058 为羊肚菌野生资源保护促繁提供了优良菌种。说明书 CN 103710271 A 9 1/1 页 10 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所云南省供销合作社科学研究所云南云菌科技（集团）有限公司一株羊肚菌菌株及其培养方法 / 2 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 ITS4 引物 1 tcctccgctt attgatatgc 20 2 22 DNA 人工序列 ITS5 引物 2 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22 序列表 CN 103710271 A 10 。