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一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法

花匠小妙招
2024-12-26 12:31

一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法

1.本发明属于草本植物栽培技术领域，尤其涉及一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法。

背景技术：

2.目前，万寿菊为菊科万寿菊属一年生草本植物，具有重要的观赏和经济价值。在干旱缺水地区很少有观赏价值效果高的花海景观，干旱或缺水等非生物胁迫是影响植物生长、生产及各种生理过程的最重要因素，因此提高花海花卉抗旱性能变得十分重要。万寿菊的花色艳丽，易栽培管理，适应性强，对土壤要求不严，可作为胁迫研究材料。近年来，植物干旱胁迫逐渐进入更多学者的研究领域，研究表明，当土壤的干旱达到一定的程度时，植物的生理机能会受到严重的伤害，植物会经过土壤感知干旱而引起生理的变化。干旱会打破植物体内的物质代谢平衡，使细胞失水萎蔫，膜透性增大，呼吸紊乱，导致气孔关闭，光合作用减弱。目前，有关万寿菊的研究大多在色素提取，栽培技术，产业发展，抑菌作用方面，对其干旱胁迫方面研究较少，尚无褪黑素在干旱胁迫方面的研究。
3.褪黑素是一种能使皮肤色素颜色变浅的激素物质，这种激素是在松果腺中以色氨酸为基质而合成的，其化学名称为n-乙酰基、5-甲氧基色胺，存在于植物细胞线粒体中，在调节植物的生长，发育，应对胁迫方面起到积极的作用。褪黑素也是一种脂溶性化合物，是维生素e活性的两倍，被认为是最有效的亲脂性抗氧化剂。李爱等通过peg-6000模拟胁迫环境处理紫苏幼苗，发现水分胁迫显著抑制紫苏幼苗的生长，外源褪黑素可以增加胁迫下叶片长宽比。张娜发现水分胁迫会使叶绿素降解，使用褪黑素处理可以维持叶绿体的完整和缓解叶绿素含量。李琳琳等通过叶片喷施褪黑素表明，干旱胁迫会引起氧化胁迫和细胞膜的伤害，使活性氧(ros)含量升高，褪黑素可以提高番茄叶片抗氧化酶活性而得到有效缓解。吴燕等研究滁菊时发现外源褪黑素可以促进滁菊叶片脯氨酸，可溶性蛋白和可溶性糖含量积累，通过提高渗透调节物质来维持细胞的正常功能。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中有关万寿菊的研究大多在色素提取，栽培技术，产业发展，抑菌作用方面，对其干旱胁迫方面研究较少，尚无褪黑素在干旱胁迫方面的研究。
5.解决以上问题及缺陷的意义为：本发明通过在万寿菊叶片喷施褪黑素的方法来检测不同浓度褪黑素处理下万寿菊干旱胁迫下的生理生化变化，对万寿菊抗旱性能的提高和褪黑素在菊科植物中的应用具有重要的参考价值。

技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法。
7.本发明是这样实现的，一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法，所述利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法，包括：
8.步骤一，选择万寿菊种子，待播种后有7-8片真叶时选取长势一致的生长苗移栽到营养钵中，放置在光照培养箱中培养，试验选在万寿菊的生长期进行；
9.步骤二，将移栽后的万寿菊分为5个处理组，每个处理30株生长苗；
10.步骤三，分组完成后，褪黑素的处理采用叶片喷施法，喷至叶片正背两面均有水滴落下为准；
11.步骤四，在移栽一周以后开始进行干旱胁迫，胁迫开始时间为4月1日，干旱胁迫程度选择在30％-40％，胁迫处理周期共四周期20天，每周内的前三天每天早晚喷施一次褪黑素，隔一天后开始取样进行各项指标的测定，每个处理设三次重复。
12.进一步，所述步骤一中，待播种后有7-8片真叶时，万寿菊株高约45mm；
13.营养钵为10cm
×
10cm，以泥炭、蛭石、珍珠岩2:1:1作为栽培基质。
14.进一步，所述步骤一中，光照培养箱的温度设置在20℃左右，光照设置在20000lx，湿度60％左右，昼夜各12小时。
15.进一步，所述步骤二中，5个处理组分别为：ck(正常浇水)，m0(干旱+褪黑素0μmol/l)，m100(干旱+褪黑素100μmol/l)，m200(干旱+褪黑素200μmol/l)，m300(干旱+褪黑素300μmol/l)。
16.进一步，所述步骤四中，胁迫处理周期共四周期20天具体包括：
17.第一周期(4月1日-4月5日)；第二周期(4月6日-4月10日)，第三周期(4月11日-4月15日)；第四周期(4月16日-4月20日)。
18.进一步，所述步骤四中，各项指标的测定时间分别在处理后的第5天，第10天，第15天，第20天。
19.进一步，所述步骤四中，干旱胁迫处理采用称重法称重，第一次补充到含水量要保持的值，以后每次补水时补到重量与第一次相同即可；其中每两天用电子天平测定一次含水量。
20.进一步，所述步骤四中，测定的各项指标，包括：形态指标测定、叶绿素含量测定、抗氧化酶含量测定、可溶性糖和可溶性蛋白含量测定、游离脯氨酸含量和相对电导率测定。
21.进一步，所述形态指标测定；株高，茎粗，株幅使用游标卡尺进行测量，每个处理测量5株，重复三次，取平均值；
22.叶绿素含量测定；叶绿素含量的测定使用丙酮法测定。
23.进一步，所述抗氧化酶含量测定；超氧化物歧化酶(sod)的活性使用氮蓝四唑nbt法，过氧化物酶(pod)的活性使用愈创木酚法测定；
24.可溶性糖和可溶性蛋白含量测定；可溶性糖含量测定使用葸酮比色法；可溶性蛋白质量分数测定使用考马斯亮蓝法；
25.游离脯氨酸含量和相对电导率测定；游离脯氨酸含量测定使用茚三酮显色法；相对电导率使用电导仪电导法。
26.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明万寿菊在干旱胁迫下生长受到抑制，叶绿素含量下降，抗氧化酶活性，可溶性糖，可溶性蛋白，游离脯氨酸含量和相对电导率均升高。相对较干旱胁迫下，褪黑素对万寿菊的干旱胁迫具有缓解作用，可以提高抗氧化酶活性，调节渗透物质积累，增强其抗旱性，其中200μmol/l褪黑素浓度处理效果最佳。
27.同时干旱胁迫下万寿菊的生长受到抑制，其中株高株幅受到显著影响，茎粗影响相对较小。随着干旱胁迫时间的延长，不同浓度褪黑素处理的游离脯氨酸含量逐渐升高，而叶绿素含量，pod值，可溶性蛋白含量，相对电导率均呈先升后降趋势，sod值和可溶性糖含量呈不同的变化趋势。较干旱胁迫相比，m200和m100处理组显著提高了万寿菊的叶绿素含量；m200处理组提高了万寿菊的sod值，pod值，增加可溶性糖，可溶性蛋白，积累了游离脯氨酸，使得相对电导率偏低，综合处理效果m200》m100》m300。结果显示，干旱胁迫对一年生万寿菊生长阶段具有显著影响，而200μmol/l褪黑素可以明显抑制万寿菊在干旱胁迫条件下的不良反应，通过提高抗氧化酶活性，调节渗透物质积累，增强其抗旱性。
附图说明
28.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1是本发明实施例提供的利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法流程图。
30.图2是本发明实施例提供的褪黑素对干旱胁迫下万寿菊叶绿素总量的影响示意图；注：不同小写字母表差异显著(p《0.05)。
31.图3(a)是本发明实施例提供的处理时间—sod活性柱状图。
32.图3(b)是本发明实施例提供的处理时间—pod活性柱状图。
33.图4(a)是本发明实施例提供的处理时间—可溶性糖含量柱状图。
34.图4(b)是本发明实施例提供的处理时间—可溶性蛋白含量示意图。
35.图5(a)是本发明实施例提供的处理时间—脯氨酸含量柱状图。
36.图5(b)是本发明实施例提供的处理时间—相对电导率示意图。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
39.如图1所示，本发明实施例提供的利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法，包括：
40.s101：选择万寿菊种子，待播种后有7-8片真叶时选取长势一致的生长苗移栽到营养钵中，放置在光照培养箱中培养，试验选在万寿菊的生长期进行。
41.s102：将移栽后的万寿菊分为5个处理组，每个处理30株生长苗。
42.s103：分组完成后，褪黑素的处理采用叶片喷施法，喷至叶片正背两面均有水滴落下为准。
43.s104：在移栽一周以后开始进行干旱胁迫，胁迫开始时间为4月1日，干旱胁迫程度选择在30％-40％，胁迫处理周期共四周期20天，每周内的前三天每天早晚喷施一次褪黑素，隔一天后开始取样进行各项指标的测定，每个处理设三次重复。
44.本发明提供的利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的利用褪黑素提高万寿菊抗旱能力的方法仅仅是一个具体实施例而已。
45.本发明实施例提供的s101中，待播种后有7-8片真叶时，万寿菊株高约45mm；营养钵为10cm
×
10cm，以泥炭、蛭石、珍珠岩2:1:1作为栽培基质。
46.本发明实施例提供的s101中，光照培养箱的温度设置在20℃左右，光照设置在20000lx，湿度60％左右，昼夜各12小时。
47.本发明实施例提供的s102中，5个处理组分别为：ck(正常浇水)，m0(干旱+褪黑素0μmol/l)，m100(干旱+褪黑素100μmol/l)，m200(干旱+褪黑素200μmol/l)，m300(干旱+褪黑素300μmol/l)。
48.本发明实施例提供的s104中，胁迫处理周期共四周期20天具体包括：
49.第一周期(4月1日-4月5日)；第二周期(4月6日-4月10日)，第三周期(4月11日-4月15日)；第四周期(4月16日-4月20日)。
50.本发明实施例提供的s104中，各项指标的测定时间分别在处理后的第5天，第10天，第15天，第20天。
51.本发明实施例提供的s104中，干旱胁迫处理采用称重法称重，第一次补充到含水量要保持的值，以后每次补水时补到重量与第一次相同即可；其中每两天用电子天平测定一次含水量。
52.本发明实施例提供的s104中，测定的各项指标，包括：
53.形态指标测定；株高，茎粗，株幅使用游标卡尺进行测量，每个处理测量5株，重复三次，取平均值；
54.叶绿素含量测定；叶绿素含量的测定使用丙酮法测定；
55.抗氧化酶含量测定；超氧化物歧化酶(sod)的活性使用氮蓝四唑nbt法，过氧化物酶(pod)的活性使用愈创木酚法测定；
56.可溶性糖和可溶性蛋白含量测定；可溶性糖含量测定使用葸酮比色法；可溶性蛋白质量分数测定使用考马斯亮蓝法；
57.游离脯氨酸含量和相对电导率测定；游离脯氨酸含量测定使用茚三酮显色法；相对电导率使用电导仪电导法；
58.数据处理；用excel软件进行数据整理和作图，用spss20.0软件进行统计分析。
59.下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
60.1材料与方法
61.1.1供试材料
62.供试的万寿菊种子品种为泰山，由美国泛美种子公司生产，待播种后有7-8片真叶时选取长势一致(株高约45mm)的生长苗移栽到10cm
×
10cm的营养钵中，以泥炭、蛭石、珍珠岩(2:1:1)作为栽培基质，放置在光照培养箱中培养，试验选在万寿菊的生长期进行。
63.1.2实验处理
64.光照培养箱的温度设置在20℃左右，光照设置在20000lx，湿度60％左右，昼夜各12小时。将移栽后的万寿菊分为5个处理组，ck(正常浇水)，m0(干旱+褪黑素0μmol/l)，m100(干旱+褪黑素100μmol/l)，m200(干旱+褪黑素200μmol/l)，m300(干旱+褪黑素300μmol/l)
每个处理30株生长苗，具体处理方案如表1所示。褪黑素的处理采用叶片喷施法，喷至叶片正背两面均有水滴落下为准。在移栽一周以后开始进行干旱胁迫，胁迫开始时间为4月1日，干旱胁迫程度选择在30％-40％，胁迫处理周期共四周期20天，第一周期(4月1日-4月5日)；第二周期(4月6日-4月10日)，第三周期(4月11日-4月15日)；第四周期(4月16日-4月20日)，每周内的前三天每天早晚喷施一次褪黑素，隔一天后开始取样进行各项指标的测定，每个处理设三次重复。指标测定时间分别在处理后的第5天，第10天，第15天，第20天。干旱胁迫处理采用称重法称重，第一次补充到含水量要保持的值，以后每次补水时补到重量与第一次相同即可。其中每两天用电子天平测定一次含水量。
65.表1试验处理
[0066][0067]
1.3测定项目与方法
[0068]
1.3.1形态指标测定；株高，茎粗，株幅使用游标卡尺进行测量，每个处理测量5株，重复三次，取平均值。
[0069]
1.3.2叶绿素含量测定；叶绿素含量的测定使用丙酮法测定。
[0070]
1.3.3抗氧化酶含量测定；超氧化物歧化酶(sod)的活性使用氮蓝四唑nbt法，过氧化物酶(pod)的活性使用愈创木酚法测定；
[0071]
1.3.4可溶性糖和可溶性蛋白含量测定；可溶性糖含量测定使用葸酮比色法；可溶性蛋白质量分数测定使用考马斯亮蓝法；
[0072]
1.3.5游离脯氨酸含量和相对电导率测定；游离脯氨酸含量测定使用茚三酮显色法；相对电导率使用电导仪电导法；
[0073]
1.4数据处理；用excel软件进行数据整理和作图，用spss20.0软件进行统计分析。
[0074]
2结果与分析
[0075]
2.1褪黑素对干旱胁迫下万寿菊形态指标的影响
[0076]
由表2可知，与对照组ck相比，干旱胁迫对株高、茎粗和株幅均有不同的影响，第10天和第15天时，m0比ck降低了31.78％、16.53％、30.07％和35.12％、16.35％、29.72％。第10天m100处理较m0相比提高了2.74％、5.79％、9.30％；m200处理较m0相比提高了1.18％、10.38％、10.02％；m300处理较m0相比提高了5.94％、0.97％、1.36％。第15天m100处理较m0相比提高了3.67％、0.82％、2.50％；m200处理较m0相比提高了1.86％、13.99％、7.11％；m300处理较m0相比提高了14.30％、7.61％、6.71％。结果表明，褪黑素处理可以显著提高万寿菊在干旱胁迫下的株高和株幅，起到缓解干旱胁迫的作用，其中对茎粗的影响较小。
[0077]
表2褪黑素处理在干旱胁迫下万寿菊形态指标的变化
[0078][0079]
注：同列中不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
[0080]
2.2褪黑素对干旱胁迫下万寿菊叶绿素总量的影响
[0081]
如图2所示，随着干旱时间的增长，ck叶绿素含量呈现逐步上升的趋势，而m0呈现先上升后下降的趋势，且均低于ck，与ck相比，在第5天，第10天，第15天，分别降低了17.37％、20.25％、39.36％，干旱胁迫下万寿菊叶绿素含量变化具有显著性差异。m100处理较m0提高了22.74％、12.39％、26.85％；m200处理较m0提高了12.52％、11.32％、28.19％；第5天和第10天m300处理较m0提高了11.04％、0.3％，第20天提高了42.72％，在第15天m300下降了9.5％。由此可见，m100和m200对叶绿素总量提升的效果差异不大，均高于m300，即褪黑素处理效果m100＝m200》m300。
[0082]
2.3褪黑素对干旱胁迫下万寿菊抗氧化酶的影响
[0083]
从图3(a)和图3(b)中可以看出，随着干旱时间的增长，sod值在第5天到第10天出现下降趋势，而从第10天以后sod、pod均呈现先升后降的趋势。与对ck相比，干旱胁迫下万寿菊的sod和pod值分别增加了3.45％、47.26％、21.84％、3.19％和41.37％、3.51％、14.19％、44.85％，显然，干旱胁迫会提高万寿菊抗氧化酶活性。与干旱胁迫m0相比，三种褪黑素浓度处理下sod、pod均在第15天达到峰值，分别为261.09u/gfw，385.36u/gfw，
269.55u/gfw和1736u/(g
·
min)，1948u/(g
·
min)，1612u/(g
·
min)，其中，m200处理的值最高，处理效果m200》m100》m300，均高于胁迫处理。
[0084]
2.4褪黑素对干旱胁迫下万寿菊可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响
[0085]
由图4(a)和图4(b)中可知，万寿菊在第5天到第10天可溶性糖含量出现下降趋势，从第10天以后可溶性糖含量同可溶性蛋白含量一样均呈现先升后降的趋势。与对照组ck相比，干旱胁迫下的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量增加，在第10天和第15天分别增加了0.27倍，0.85倍和1.18倍，0.91倍。与干旱胁迫m0相比，褪黑素处理下可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均有上升，在第15天达到峰值，其中m200处理的峰值最高，分别为31.79％和15.42ug/g，处理效果m200》m100》m300。到第20天褪黑素处理下可溶性蛋白含量下降幅度较大略低于m0，但均高于ck。
[0086]
2.5褪黑素对干旱胁迫下万寿菊游离脯氨酸含量和叶片相对电导率的影响
[0087]
由图5(a)和图5(b)中可知，游离脯氨酸含量呈显著递增趋势，相对电导率呈先升后降趋势。随干旱胁迫时间的增长，游离脯氨酸含量在第20天最高，较ck相比，m0处理提高了22.01％；相对电导率在第10天达到最高，与ck相比，m0处理提高了28.66％。与干旱胁迫m0对比，三种褪黑素浓度处理均使得游离脯氨酸含量升高，使相对电导率降低，其中在第20天m200处理下游离脯氨酸含量最高，为764.19μg/gfw，且相对电导率最低，为31.34％，第5天时m100处理下相对电导率最低，为30.97％，但随胁迫时间变长，m100处理下相对电导率均高于其他两种浓度，处理效果为m200》m300》m100。
[0088]
3分析如下：
[0089]
水是一切生命物质的源泉，在自然环境条件下，植物会遭遇各种逆境胁迫。植物受到干旱胁迫主要是由于水分的缺失，因而对植物的生长发育和生物量的形成有显著的影响，其中形态特征属于最直观的变化。本试验以处于生长期的万寿菊为材料，使用盆栽控水进行干旱胁迫的探究，分析了不同浓度褪黑素处理下万寿菊的生理变化，与正常生长的万寿菊相比，干旱胁迫均降低了株高，茎粗和株幅，其中对茎粗的影响较小，说明正常浇水后对株高和株幅的增长更加敏感，这与邹京南的研究结果一致。因此，干旱胁迫会显著抑制万寿菊的生长，褪黑素处理可以显著提高万寿菊在干旱胁迫下的株高和株幅，起到缓解干旱胁迫的作用。
[0090]
叶绿素是植物体内最基本的光合色素，叶绿素的含量进而影响植物光合作用能力。本试验中施用褪黑素后叶绿素总含量总体趋势先升高再降低，第10天以后叶绿素总含量下降可能是因为干旱胁迫下，植物体内产生过量的活性氧(ros)，活性氧对叶绿素亲和力很强，使叶绿体结构遭到破坏，此外叶绿素含量降低导致光合能力减弱，还可能与叶面积的减少有关，这与田治国在万寿菊抗旱性评价的研究中结果一致。100μmol/l和200μmol/l的褪黑素处理下叶绿素含量较m0均显著提高，二者处理效果间没有显著性。结果显示，干旱胁迫会抑制叶绿素的合成，100μmol/l和200μmol/l的褪黑素能显著提高干旱胁迫下万寿菊的叶绿素含量。
[0091]
细胞膜对逆境胁迫的响应最为敏感，逆境发生时首先作用于质膜，导致原生质脱水，使膜的通透性增加，活性氧会在植物体内快速积累，破坏植物的细胞膜结构，使植物的正常的代谢生理受到干扰。褪黑素作为一种电子供体，可直接与动植物体内的活性氧反应，使体内的活性氧含量保持在较低水平。植物本身可以通过抗氧化酶系统清除过量氧自由
基，避免细胞受到氧化伤害。在本试验中，随着干旱时间的延长，sod在第10天前出现下降趋势，可能是因为胁迫开始不久，万寿菊还未适应胁迫条件，使得膜上的酶系统功能处于紊乱状态，干扰着细胞正常代谢。第10天以后sod、pod均呈先升后降趋势，前期可能是万寿菊调节体内抗氧化酶系统以分解氧自由基，当胁迫时间达到一定限度，植物体内产集聚大量活性氧，使细胞内的代谢受到严重破坏，且抗氧化酶数量有限，故值下降。较干旱胁迫m0相比，三种褪黑素浓度处理下sod和pod均有升高，其中200μmol/l的褪黑素处理下值最高，褪黑素可以提高抗氧化酶活性，维持细胞内活性氧的平衡以适应胁迫环境。
[0092]
植物在干旱胁迫下可以通过调节体内的保护酶和渗透物质来应对不良环境，可溶性糖和可溶性蛋白作为植物的渗透调节物质，能够维持植物细胞的渗透平衡。干旱胁迫下生物膜感受到影响，引起膜脂过氧化，膜透性提高，电解质渗透增加，脯氨酸含量和相对电导率可以作为判断细胞膜透性损害程度的依据。正常叶片中，线粒体内氧化降解酶诱导脯氨酸氧化，脯氨酸含量下降；当植物受到干旱胁迫时，线粒体破裂，脯氨酸氧化受阻，，故含量增加。从脯氨酸在干旱条件下积累的途径来看，它既可能有适应性的意义，又可能是细胞结构和功能受损伤的表现。在本试验中，第10天前可溶性糖含量出现下降趋势，可能是由于万寿菊处于苗期生长阶段植株过矮叶片过小光合能力较弱，呼吸和代谢比较旺盛，有机物消耗大于积累。第20天褪黑素处理下可溶性糖和可溶性蛋白含量下降幅度较大，可能是由于胁迫时间比较长严重损害了万寿菊生长期的膜的通透性，影响物质运输和代谢。研究结果显示，干旱胁迫下植株的相对电导率，游离脯氨酸，可溶性糖，可溶性蛋白含量显著上升，喷施不同浓度的褪黑素后，游离脯氨酸，可溶性糖，可溶性蛋白含量增加，相对电导率下降，这与李本峰等在黑麦草叶片中的研究结果一致。因此，适宜浓度的褪黑素可以有效促进万寿菊在干旱胁迫下渗透物质的调节，缓解对细胞膜透性的破坏。综上所述，干旱胁迫严重影响万寿菊的生理生化变化，褪黑素的处理可以提高万寿菊应对干旱胁迫的能力。
[0093]
万寿菊在干旱胁迫下生长受到抑制，叶绿素含量下降，抗氧化酶活性，可溶性糖，可溶性蛋白，游离脯氨酸含量和相对电导率均升高。相对较干旱胁迫下，褪黑素对万寿菊的干旱胁迫具有缓解作用，可以提高抗氧化酶活性，调节渗透物质积累，增强其抗旱性，其中200μmol/l褪黑素浓度处理效果最佳。
[0094]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。