月季花红色素提取条件的优化

• 花匠小妙招
• 2024-12-26 18:01

张思博，赵 阳，李 杰，李 斌，罗建成

(南阳理工学院生物与化学工程学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳 473004)

月季花(Chinese Rose)别名有月月红、四季花。原产于我国，素有“花中皇后”的美誉。根据医药及药草类古籍中对月季花的记载，月季花的花瓣和花根经研磨后可入药，归肝经，其性味为甘，温。可以活血调经，疏肝解郁。月季花中的红色素是一类天然植物色素类活性物质，主要为花青素。

经研究发现，花色素可以降低血液的粘稠度，疏通血管，改善血液循环，促进人眼视网膜细胞中的视紫质的再生成从而达到预防近视增强视力的作用;花青素可以稳定大脑组织，使大脑不受有害物质的伤害;花青素具有清除自由基的作用，从而让癌细胞无法顺利扩散，所以可以避免更多健康的细胞被癌细胞所侵蚀。因此，以花青素作为功能性成分的药物对于癌症的治疗有着很好的积极作用［1］。色素类化合物的提取方法有:针对脂溶性色素用有机溶剂提取法，常使用的有机提取溶剂有乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、石油醚、乙酸乙酯等;利用植物体内生物多种活性物质与碱的不同作用常用碱提取法［2］;超临界二氧化碳流体萃取方法是一种新型针对物质分离、精制技术，使用这种方法所得到的产品没有毒性、没有溶剂残留，不仅经济还是一种环境友好型的萃取技术［3］。利用超声波产生的强烈振动、极高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等加速药物有效成分进入溶剂，可以提高提取率，并且不存在温度对该技术的影响［4－7］。饱含天然色素类化合物的月季花，是开发天然抗氧化活性物质的天然金库。该研究课题可为大规模生产天然色素类活性物质工业化生产奠定基础，至今未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

月季花花瓣(采摘于河南南阳理工学院药用植物园)。

1.2 实验仪器

FW－100高速万能粉碎机:北京中兴伟业仪器有限公司;HHS－6电热恒温水浴锅:上海跃进仪器有限公司;101－2A型电热鼓风干燥箱:天津市泰斯特仪器有限公司;721 N可见分光光度计上海精752N紫外－可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超声波细胞粉碎机:上海珂淮仪器有限公司。

1.3 实验试剂

花青素(红色素)标准品(中国药品生物制品检定所);甲醇(AR)、乙醇(AR)、乙醚(AR)、石油醚(AR)、乙酸乙酯(AR)、正丙醇(AR)、正丁醇(AR)，天津市德恩化学试剂有限公司。

1.4 月季花红色素提取工艺

月季花花瓣清洗→干燥→粉碎→水浴提取→超声处理提取→离心→定容→稀释→测定含量。

1.5 月季花红色素标准曲线绘制

精确称取花青素标准品0.6500g，使用95%浓度的乙醇溶液于25mL容量瓶中进行定容，得到浓度为0.026g/mL的红色素标准液，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 的红色素标准液分别于七个洁净的10mL容量瓶中，然后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中进行定容，充分振荡后静置10min，在可见分光光度仪上520nm处测吸光度值，绘制曲线。

1.6 样品的测定及提取率的计算

1.6.1 样品测定方法［8－12］

将月季花色素提取液离心处理，使用50mL容量瓶对提取液进行定容，用移液管精确吸取定容溶液10mL于刻度试管中，再使用移液管于刻度试管中精确吸取溶液1.0mL于10mL刻度试管中，稀释10倍，最后用95%乙醇溶液于10mL容量瓶中进行定容，充分振荡后静置10min，在可见分光光度仪520nm处测吸光度值。

1.6.2 色素提取率的计算

由标准曲线可以推导出标准曲线方程:x=(y+0.0066)/0.0507

y:吸光度值。

x:计算得到的色素提取物的浓度。

提取率=(色素提取物的浓度×提取液体积)/月季花花瓣粉末的重量×100%

在吸光度测量时将提取液稀释10倍，则推导出月季花红色素含量的计算公式为:

色素含量(g/100g)=(色素浓度×提取液体积×稀释倍数)/样品鲜重(或干重)

即:η%=(x×1 mL×10)/1000/1 g×100(g/100 g)

2 结果与分析

2.1 色素标准曲线的绘制

不同浓度的色素标准液在520nm处测吸光度值如图1所示。

图1 不同浓度色素标准品在520 nm处标准曲线

根据图1中数据计算月季花中红色素含量与色素吸光度值之间的线性关系:y=0.0507x－0.0066。其中 y代表于520 nm处测得的吸光度值;x为色素浓度(mg/mL)，相关系数R2=0.9976，回归极显着。所以在色素含量为0～16 mg/mL的范围内，是可以用该方法检测色素含量的。

2.2 提取溶剂对色素提取率的影响

精确称量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，分别甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、石油醚、乙醚、乙酸乙酯为溶剂;在料液比为1∶50(g/mL)，80℃的水浴提取1h，超声波功率450W，占空比1/2(超声中超声时间与总时间的比值)处理15min。提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶。每种溶剂做3个平行试验，求平均值，实验结果如表1。

表1 不同溶剂的色素提取率

由表1中数据可以看出，不同的提取溶剂色素的提取率有所不同，由上表可知乙醇的提取率最大，故以下实验均选择乙醇溶剂作为提取溶剂。

2.3 提取溶剂浓度对色素提取率的影响

精确称量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用乙醇作为提取溶剂，分别用50%、60%、70%、80%、95%、无水乙醇提取。料液比为1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h，超声波功率450W，占空比1/2处理15min。提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶。不同浓度提取溶剂做3个平行试验，求平均值，实验结果如表2。

表2 不同浓度提取溶剂的色素提取率

由表2中数据可以看出，提取溶剂的浓度对实验影响是比较明显的，在95%乙醇提取溶剂浓度下获得最大色素提取率。

2.4 提取水浴温度对色素提取率的影响

表3 不同水浴温度的色素提取率

精确称量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇为提取溶剂，按料液比 1∶50(g/mL)，采用 20、40、60、80、100℃提取温度提取1h，超声波功率450W、占空比1/2处理15min。提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同水浴温度做3个平行试验，求平均值，实验结果如表3所示。

由表3中数据可以看出，随着温度的升高色素提取率随之升高，超过80℃之后反而下降，分析原因有可能是色素分子的结构在高温下受到了破坏。故选择80℃水浴温度作为最佳提取水浴温度。

2.5 提取溶液的料液比对色素提取率的影响

精确称量5份月季花花瓣粉末，每份1.0 g，使用95%乙醇为提取溶剂，80℃水浴提取 1 h，分别采用 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比，超声波功率450W，占空比1/2处理15min，提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同料液比做3个平行试验，求平均值，结果如表4所示。

表4 不同料液比的色素提取率

由表4中数据可以看出，物料与提取溶剂的配比越大越好，随着料液比的增大色素提取率也随之增大，但是在料液比为1∶50之后有下降趋势，在考量实验成本与实验效果等因素的基础上选择料液比为1∶50为提取实验最佳料液比。

2.6 超声波功率对色素提取率的影响

精确称量5份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1h。放入超声波仪器处理，分别采用在 150、300、450、600、750W 和占空比为1/2的条件下提取20min。提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超声波功率做3个平行试验，求平均值，结果如表5所示。

表5 超声波功率对色素提取率的影响

由表5中数据可以看出，超声波功率对色素提取率的影响不是超声波功率越大越好，而是存在最优水平即450W超声波功率，故选择450W超声波功率为色素提取最优水平。

2.7 超声波占空比对色素提取率的影响

表6 超声波占空比对色素提取率的影响

精确称量7份月季花花瓣粉末，每份1.0g，使用95%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶50(g/mL)，80℃水浴提取1 h。放入超声波仪器提取，在功率为450W，占空比为1提取10min、2/3提取15min、1/2 提取 20min、1/3 提取 40min、1/4 提取 50min。提取液离心，取上清液定容至10mL容量瓶，不同超声波占空比做3个平行试验，求平均值，结果如表6所示。

由表6中数据分析可以看出，超声波占空比为1/2时色素提取率有最大值，所以选择超声波功率为1/2为超声波处理提取的最优水平。

2.8 响应面实验分析

根据 Box－Behnken的中心组合实验设计原理［13－14］，综合单因素实验所得实验结果，选取3个对色素提取率影响显着的因素，将乙醇浓度、水浴温度和超声波功率3个对色素提取率影响显着的因素，确定乙醇浓度95%、料液比为1∶50，超声波占空比为1/2，分别以A、B和 C为代表，每一个自变量的试验水平分别以－1、0、1进行编码。0代表最优水平、－1为最优水平左面的水平、1为最优水平右面水平。以月季花红色素提取率为响应值(Y)，在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表7，实验结果与分析如表。

表7 响应面分析因素与水平

其中，对提取溶剂乙醇溶剂浓度A、水浴提取时间B和超声波提取功率C作变换公式如下:A=(Z－95)/5，B=(t－80)/20，C=(T －450)/150(Z、t、T 分别为试验提取溶剂乙醇溶剂浓度、水浴提取温度及超声波提取功率)以 A、B、C为自变量，以3次试验所得月季花红色素提取率的平均值为响应值(Y)，结果见表8。其中1～12为析因试验，13～15是中心复合试验，用来估计试验误差。

表8 响应面分析方案及结果

采用Minitab 15质量数据分析电脑软件对响应值与各因素进行回归拟合，将以上数据录入进行分析后，得到回归方程和提取率估计回归系数表如表9:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C。S=0.309198，PRESS=6.66798，R －Sq=93.36% ＞90.00%，说明方法可靠。R － Sq(预测)=7.35%R －Sq(调整)=81.40%。

表9 提取率的估计回归系数

由表9提取率的回归系数显着性检验可以得知，该试验模型:(1)一次项A乙醇浓度显着;(2)二次项A2极显着，B2、C2显着;(3)交互项都不显着。

提取率方差分析结果如表10，提取率的估计回归系数，使用未编码单位的数据结果如表11。

表10 提取率的方差分析

表11 提取率的估计回归系数，使用未编码单位的数据

以下为保持其中一个因素不作变化的情况下，探究其余两个因素对色素提取率的影响，使用曲面图形及等值线图形来直观地表达了每一因素对响应值即色素提取率的影响，如图2～7所示。

图2 色素提取率与乙醇浓度，水浴温度曲面图

图3 色素提取率与乙醇浓度，水浴温度等值线图

图4 色素提取率与乙醇浓度，超声功率曲面图

图5 色素提取率乙醇浓度，超声功率等值线图

图6 色素提取率与水浴温度，超声功率曲面图

图7 色素提取率与提取时间，提取温度等值线图

对分析所得的回归方程:

Y=11.9320 － 0.349000A+0.0367500B+0.215250C －0.698250A2 － 0.476750B2 － 0.802250C2+0.204000A*B+0.335500A*C+0.298000B*C

求一阶偏导并联立方程组，解得A=－0.225500885，B=0.0185651718，C=0.0904499059，代入前面的变换公式可得到乙醇浓度Z为96.1% 、水浴提取温度t为80.4℃、超声波功率为463.6W。即月季花中红色素提取工艺最佳工艺条件为，采用乙醇浓度为96.1%、水浴提取温度80.4℃、料液比1∶50、超声波处理提取超声波功率463.6W、超声波占空比为1/2。对实验优化条件进行验证得到提取率为12.94%。

3 结论

在采用有机溶剂萃取、超声波辅助处理提取工艺的优化实验研究中，得到最佳工艺条件为乙醇浓度为96.1%、提取温度80.4℃、料液比 1∶50、超声波处理提取超声波功率 463.6W、超声波占空比为1/2。对实验优化条件进行验证得到提取率为12.94%。

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