衣藻中高效精确的多类型基因编辑方法的建立
01
文章背景简介
BACKGROUND INTRODUCTION
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种广泛分布于水沟、洼地及含有机质的水体中德单细胞绿藻，又称“莱氏衣藻”、“莱哈衣藻”，简称“衣藻”，属于衣藻科、衣藻属。莱茵衣藻具有无性和有性生殖两种繁殖方式。在光照并以CO2 为唯一碳源时，莱茵衣藻进行光合自养；在光照且碳源种类多样时，莱茵衣藻进行光合自养和异养兼性生长；在黑暗状态且碳源是醋酸及其盐类时，莱茵衣藻的生长方式则会完全转变为异养。莱茵衣藻是人类可食用的天然藻类，富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，其中蛋白质≥30.0%、粗多糖≥10.0%，因此于2022年5月被我国卫健委批准为新食品原料。
注：引自ISF健康教育中心（每天10克莱茵衣藻改变中国目前慢性疾病堪忧的现状！）
由于莱茵衣藻结构细胞特殊、生长速度快、可光合自养、遗传学背景清晰和转化容易等原因，使其在绿色植物的光合作用和纤毛的组装机制研究等方面具有重要应用。不仅如此，近年来，随着合成生物学、绿色低碳等热点兴起，莱茵衣藻也成为了研究基因功能、外源基因表达、生物制氢、二氧化碳固定等领域的新兴模式物种，被称为“绿色酵母”和“光合酵母”。
CRISPR/Cas9因其简单的操作流程、高效的编辑效率以及设计的多样性，已经成为许多模式生物（如细菌、酵母、植物和哺乳动物）最主要的基因编辑工具之一。CRISPR/Cas9在很多生物系统中的操作都相对容易，但是在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的实际编辑效率却很低，Cas9蛋白的持续性表达对莱茵衣藻细胞会造成一定的毒性，使得实验最终无法获得有效的基因编辑突变体。
目前，已有实验通过递送的方式在衣藻中实现了具有可选择表型的靶向基因突变。将Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNPs）直接导入或将Cpf1-gRNA RNPs 与单链DNA （ssDNA）修复模板共同导入衣藻细胞内，可产生靶位点序列的特异性突变并同时提供了筛选表型。不过，这些方法仅适用于功能丧失形成的突变体具备可见表型靶基因时的编辑。同时，尽管这些研究说明了ssDNA修复模板的重要性以及将Cas9-gRNA RNP引入细胞进行基因编辑的可行性。然而，对于转录水平较低的基因，如FTSY、SRP43和CrKU80，由于大多数突变体在目标位点有着不可预测的缺失或插入，致使突变体筛选效率极低。此外，一些精准的基因编辑如敲入编码抗原表位标签或荧光标签的DNA序列、靶向蛋白质的N端或C端或在蛋白质的靶向位点实现单个氨基酸的替换等，在现有的操作系统中很难实现，亟需建立更为先进的操作体系。
另外，目前还无法在衣藻中实现必需基因的完全敲除（零突变），因此这类基因的功能研究就会依赖于利用人工microRNA产生的敲低突变体。然而，表观遗传沉默往往会抑制外源DNA以及人工microRNA在细胞内的表达，直接削弱靶基因的敲低作用。最近，一项在哺乳动物细胞中的研究表明，使用CRISPR/Cas9对靶基因3’-UTR的完全敲除会降低靶基因mRNA的稳定性。但这种基于CRISPR/Cas9的基因敲除方法在衣藻中尚未报道。
为了在衣藻中实现精准的基因编辑，中国科学院生物化学与细胞生物学研究所的Hui Chen等人于2023年在《Plant J》杂志（IF=6.2，Q1，生物学1区）发表了题为"Efficient methods for multiple types of precise gene-editing in Chlamydomonas"的文章。
02
所用到的主要方法
METHODS
（1）电穿孔
（2）巢式PCR
（3）RT-qPCR
（4）琼脂糖凝胶电泳
（5）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（6）免疫荧光染色
03
文章主要内容摘要
ABSTRACT
利用CRISPR/Cas9技术对于衣藻中低表达的基因进行精准的基因编辑是一个长期的挑战。该研究开发了适用类型多样且精准度高的基因编辑方法，这种方法通过Cas9蛋白使靶基因DNA双链断裂，然后再利用同源DNA模板介导修复。研究中，对这种编辑方法在多个基因中进行了验证，其中包括对两个低表达基因（CrTET1和CrKU80）进行灭活、在VIPP1、IFT46、CrTET1和CrKU80基因中引入FLAG-HA标签以及将YFP标签置于VIPP1和IFT46基因以实现活细胞成像。此外，该研究还成功地实现了对FLA3、FLA10和FTSY基因的单氨基酸替换。最后，本文还证明了可应用CRISPR/Cas9对MAA7和VIPP1的3’-UTR片段进行精准且稳定的敲除。综上，该研究为衣藻中多种类型的精确基因编辑建立了有效的方法，可高效的实现碱基的替换、插入和删除，从而进一步提高了莱茵衣藻在基础研究和工业应用中的潜力。
简而言之，本研究的主要内容有：
1.开发一套同源性介导的依赖于基因组整合的筛选流程
2.微同源性介导的含有终止密码子的短供体DNA整合靶向基因的失活
3.微同源性介导的FLAG-HA表位标签的敲入
4.用于活细胞成像的微同源性介导的黄色荧光蛋白（YFP）的敲入
5.使用修饰后的短同源臂作为供体DNA来进行精确的氨基酸替换
6.微同源供体介导MAA7和VIPP1 3’-UTR的精确删除
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