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中国科学院青岛能源所建立紫花苜蓿高效简捷基因编辑体系

花匠小妙招
2024-11-20 14:18

紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，是全世界广泛种植的饲草作物。随着生物育种技术的不断发展，苜蓿分子育种工作也取得了一系列的重要突破。基因编辑技术能够精准高效地创制具有优良育种性状的苜蓿种质新资源，因而成为国内外苜蓿育种研发领域激烈角逐的核心技术之一。苜蓿高效基因编辑体系的开发需要依靠高通量的遗传转化技术与高效的基因编辑器。然而紫花苜蓿的遗传转化流程繁琐，且对操作人员技术经验与受体材料的遗传背景具有严重的依赖性，导致其转化效率高低不一。另外，紫花苜蓿为同源四倍体作物，基因组复杂，同一靶标基因的不同sgRNA的编辑效率千差万别。虽然当前国内外研发人员已成功开发了多种不同类型的紫花苜蓿基因编辑载体，但均使用Pol III型启动子驱动sgRNA表达，难与使用Pol II型启动子驱动的Cas9较好地协同表达。

近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所付春祥团队在The Crop Journal在线发表了题为“Development of a single tran CRISPR/Cas9 toolkit for efficient genome editing in autotetraploid alfalfa”的紫花苜蓿基因编辑技术体系开发的研究论文。

研究人员选择紫花苜蓿重要品种公农1号为底盘资源，采用操作简便、侵染效果稳定的超声辅助侵染技术，建立了公农1号高效遗传转化体系（转化率达到50%以上，图1），该技术有助于紫花苜蓿规模化遗传转化生产线的建立。

图1 公农1号紫花苜蓿超声辅助叶圆盘高效遗传转化体系

在此基础上，研究人员采用拟南芥UBIQ10组成型强启动子启动Cas9和sgRNA模块以单一转录单元进行协同高效表达，并利用基于tRNA的多sgRNA串联，在紫花苜蓿中实现了同一基因或不同基因多个靶位点的高效编辑（图2）。该载体系统简捷、高效，在包括苜蓿（紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、杂花苜蓿等）、杨树、烟草等重要作物的基因编辑中具有通用性，方便不同研究团队在双子叶作物基因编辑育种研发中的使用。目前该载体系统已被来自国内科研院所的20多个相关团队试用，并获得良好的反馈。

图2 紫花苜蓿高效简捷基因编辑载体

此外，研究人员还发现sgRNA的选择是决定紫花苜蓿基因编辑成功与否的另一个关键。然而，紫花苜蓿原生质体制备与转化体系对操作人员技术要求高，而紫花苜蓿叶圆盘法遗传转化周期长，两者均无法实现高编辑效率sgRNA的快速筛选。先前，研发者团队建立了蒺藜苜蓿sgRNA筛选的毛状根技术体系，然而该体系无法快速区分实生根和毛状根，制约了其在紫花苜蓿中的进一步应用。因此，研究人员基于MtLAP1转录因子过表达累积花青苷 “显色”的原理，开发了一套基于可视化毛状根的sgRNA高效筛选系统（图3）。与非可视化的工具相比，可节省60%~70%的样本检测成本。

图3 基于可视化毛状根的紫花苜蓿sgRNA高效筛选系统

最后，研究人员利用构建的一整套技术体系对紫花苜蓿叶发育的关键基因PALM1进行编辑，成功获得了包括公农1号在内的高叶/茎比和高蛋白含量的紫花苜蓿种质资源（图4）。该工作有助于推动基因编辑技术在我国苜蓿生物育种研发中的广泛应用，同时还能够加速具有优良农艺性状苜蓿核心种质资源的创制。

图4palm1基因编辑紫花苜蓿新材料

作者和基金项目

中国科学院青岛生物能源与过程研究所博士研究生赵海霞、中国科学院青岛生物能源与过程研究所与山东大学联合培养博士研究生赵思怡以及中国科学院青岛生物能源与过程研究所副研究员曹英萍为该文的共同第一作者，刘文文副研究员以及付春祥研究员为共同通信作者。此外，山东大学生命科学学院周传恩教授、宁夏大学麻冬梅教授、中国农业科学院生物技术研究所林浩研究员、蒙草生态环境（集团）股份有限公司牧草育种与良种繁育重点实验室主任王召明、科技项目总监苑峰等也参与了该工作，青岛农业大学王增裕教授也为该研究提供了支持。该研究得到中国科学院战略性先导科技专项(XDA26030301)和呼和浩特市“揭榜挂帅”(2023-JBGS-S-1)等项目资助。研发团队（能源作物分子育种研究组）长期从事能源草、牧草、草坪草、中草药等多种植物的遗传转化与分子设计育种研发。建立了包括苜蓿、籽粒苋、构树、鹿茸草、雪莲、玉米、甜高粱、羊草、冰草、野大麦、老芒麦、狗牙根、柳枝稷等20多种植物的遗传转化与基因编辑技术体系，并在多种饲草作物中实现了株型设计、细胞壁改良、耐盐碱与抗旱/寒能力提升等。