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菊花遗传转化体系的优化和使用基因编辑技术建立‘神马’突变体库初探

花匠小妙招
2024-09-28 11:07

　　菊花是经长期人工选择培育的名贵观赏花卉,是世界四大切花之一,产量居首。它存在非常多的种下变异机制,在花卉界被誉为世界两大花卉育种奇观之一。在中国,不少地方更是通过举办菊花展览的形式来宣传菊文化,具有很高的经济和观赏价值。随着市场需求的多元化,规模化生产市场所需特异性状的菊花品种成为紧要任务,除传统杂交育种外,菊花综合性状的遗传改良研究成为了热点。前人已在菊花遗传转化体系的优化方面做了多年的探索,农杆菌介导法仍然是当下外源基因转化的最有效的途径。大多数栽培菊花品种为异源多倍体,所以针对菊花基因功能的研究大多采用同源或异源过表达以及基因沉默(RNAi)的方式,而当前最受关注的基因编辑技术CRISPR-Cas9则较少应用在在菊花上,主要的技术壁垒也在于其复杂的倍性。然而菊花中存在多个二倍体野生种,如甘菊(D.lavandulifolium)、菊花脑(D.nankingense)、野菊(D.indicum L)等,相对较容易产生目标基因的CRISPR-Cas9敲除突变体。因此,本试验首先利用production of anthocyanin pigment 1(PAP1)和GFP两种过表达载体对菊花二倍体野生种甘菊、野菊、菊花脑和一种栽培菊花品种‘神马’的遗传转化体系进行了优化。优化过程中我们发现,菊花二倍体野生种产生遗传材料的速度较慢,且遗传转化体系较不稳定,同时选用了遗传转化体系较成熟的菊花栽培品种‘神马’并进一步优化体系以缩短实验进程。后续我们构建了 CRISPR随机敲除载体(CRISPR-Random)侵染‘神马’叶片,该载体会随机的作用在菊花基因的不同target位点,理论上从而产生上百种乃至上千种不同的基因突变,是一种创制菊花突变体的较为新型的方法。目前我们已成功产生了 14棵‘神马’敲除突变体并初步测定了若干表型指标,在多倍体菊花上成功进行了基因编辑,为我们下一步产生菊花二倍体野生种突变体提供了实验数据。在此基础上,本论文针对使用CRISPR-Random敲除载体体系建立菊花二倍体野生种突变体库的这一方法进行了初步探索和总结,为下一步该方法在菊花育种上面的推广应用提供了实验证据和理论支撑。试验结果如下:1.甘菊外植体愈伤形成培养基的最佳配方为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,10天后愈伤形成率为100%,愈伤分化培养基的最佳配方为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA,20天后的愈伤分化率高达100%。菌液最佳侵染浓度为OD600=0.4,最佳侵染时间为15分钟。最适Timentin浓度为300mg/L,最适硫酸卡那霉素浓度为10mg/L。2.菊花脑外植体愈伤形成培养基的最佳配方为MS+0.1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA、MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA 和 MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA,30天后的愈伤形成率均高达100%。菌液最佳侵染浓度为OD600=0.4,最佳侵染时间为15分钟。最适Timentin浓度为300mg/L,最适硫酸卡那霉素浓度为1Omg/L。3.野菊愈伤形成培养基的最佳配方为MS+0.3mg/L ZT+0.5mg/LNAA,30天后的愈伤率高达100%。菌液最佳侵染浓度为OD600=0.4,最佳侵染时间为15分钟,最适Timentin浓度为300mg/L,最适硫酸卡那霉素浓度为10mg/L。4.栽培品种‘神马’外植体愈伤形成培养基的最佳配方为MS+1mg/L 6-BA+0.25mg/L2,4-D,20天后的愈伤生成率为100%;愈伤分化培养基的最佳配方为MS+1mg/L 6-BA+0.25mg/LNAA,30天后的愈伤分化率高达100%。菌液最佳侵染浓度为OD600=0.4,最佳侵染时间为15分钟,最适Timentin浓度为300mg/L,最适硫酸卡那霉素浓度为10mg/L。5.应用随机敲除载体CRISPR-Random共产生了 21棵‘神马’再生苗,通过测序确定其中有14棵为敲除突变体,并进一步利用T载体对CRISPR-Random敲除突变体进行了基因突变位点的确定。6.将产生的CRISPR-Random‘神马’突变体与野生型植株进行了株型、叶片面积、冠径、株高以及色素含量等生理数据的比较,发现相同生长条件下突变体的株型以中间型和开张型居多,而野生型植株的株型均为直立型;突变体植株的高度明显低于野生型但冠径和叶片面积却要大于野生型;大部分突变体植株的色素含量均高于野生型,只有少部分低于野生型。

[关键词]：

菊花二倍体野生种;栽培菊花品种;载体构建;再生体系;转化体系;随机敲除;突变体库

[文献类型]：硕士论文
[文献出处]：

山东农业大学2021年

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